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Medicine

निलंबन में रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं उद्धार करने के लिए कृन्तकों में subretinal इंजेक्शन प्रदर्शन

Published: January 23, 2015 doi: 10.3791/52247
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2, 1, 1,2
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Lowy Medical Research Institute

Abstract

बिजली के उद्यमी में प्रकाश का रूपांतरण बाहरी रेटिना में होता है और रॉड और कोन photoreceptors और रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं से काफी हद तक पूरा किया है। RPE फोटोरिसेप्टरों और मौत या RPE कोशिकाओं की शिथिलता उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी), लोगों की उम्र 55 और पुराने में स्थायी दृष्टि हानि का प्रमुख कारण की विशेषता है के लिए महत्वपूर्ण समर्थन प्रदान करते हैं। AMD के लिए कोई इलाज नहीं पहचान की गई है, वहीं रोगग्रस्त आँखों में स्वस्थ RPE के आरोपण के लिए एक प्रभावी उपचार साबित हो सकता है, और RPE कोशिकाओं की बड़ी संख्या को आसानी से स्टेम सेल से उत्पन्न हो सकता है। RPE सेल वितरण की सुरक्षा और प्रभावकारिता के बारे में कई दिलचस्प सवाल अभी भी पशु मॉडल में जांच की जा सकती, और RPE इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल में अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते प्रोटोकॉल विकसित किया गया है। यहाँ वर्णित तकनीक विभिन्न अध्ययनों में कई समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया है और पहले एक तेज सुई के साथ नजर में एक छेद बनाने शामिल है। एक Blu के साथ फिर एक सिरिंजकोशिकाओं के साथ भरी हुई NT सुई के छेद के माध्यम से डाला जाता है और यह धीरे RPE छू तक शीशे के माध्यम से पारित कर दिया है। अपेक्षाकृत आसान है और कम से कम उपकरणों की आवश्यकता है जो इस इंजेक्शन विधि, का उपयोग करना, हम पशु मॉडल में फोटोरिसेप्टर अध: पतन की महत्वपूर्ण राशि से बचाता है कि मेजबान RPE के बीच में स्टेम सेल व्युत्पन्न RPE कोशिकाओं की सुसंगत और कुशल एकीकरण को प्राप्त करने। वास्तविक प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं है, हम भी इंजेक्शन, और कैसे कोशिकाओं vivo इमेजिंग तौर तरीकों में उपयोग कर subretinal अंतरिक्ष में इंजेक्शन थे कि सत्यापित करने के लिए प्रेरित द्वारा आघात की सीमा निर्धारित करने के लिए क्या करते हैं। अंत में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग RPE कोशिकाओं तक सीमित नहीं है; यह subretinal अंतरिक्ष में किसी भी परिसर या सेल इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

नोट: सभी जानवरों के स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट द्वारा स्थापित नैतिक दिशा निर्देशों के अनुसार इलाज किया गया।

इंजेक्शन के लिए सामग्री की 1. तैयारी (~ 20 मिनट)

  1. पूर्व गर्म सेल हदबंदी समाधान (अधिमानतः नहीं सीरम के साथ, कमजोर पड़ने के माध्यम से निष्क्रिय है कि एक), बाँझ पीबीएस, और संस्कृति मीडिया (1 टेबल)।
  2. यह disassembling और 15 मिनट के लिए पानी में भागों उबलते द्वारा एक कुंद सुई के साथ सिरिंज जीवाणुरहित।

इंजेक्शन के लिए RPE कोशिकाओं की 2. तैयारी (~ 30 मिनट घंटा करने के लिए 1)

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-8 मिनट के लिए पूर्व गर्म सेल हदबंदी समाधान का उपयोग RPE कोशिकाओं को अलग करें।
  2. अभी भी जुड़े होते हैं कि किसी भी रिलीज करने के लिए धीरे परिमार्जन कोशिकाओं।
  3. संस्कृति मीडिया की एक बड़ी मात्रा (एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को भरने) हदबंदी समाधान निष्क्रिय है और उन्हें गिनती करने के साथ कोशिकाओं पतला।
  4. गोली कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र।
  5. बाँझ पूर्व गर्म पीबीएस में / μl 200,000 कोशिकाओं (एक 0.5 μl मात्रा में 100,000 कोशिकाओं वितरित करने के लिए) में कोशिकाओं Resuspend और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में उन्हें स्थानांतरित।
  6. वैकल्पिक रूप से, एक जीवित कोशिका क्षणिक फ्लोरोसेंट मार्कर जोड़ सकते हैं और 30-45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. कोशिकाओं के 0.5 μl के साथ एक कुंद सुई के साथ सिरिंज लोड करें। जितनी जल्दी हो सके कोशिकाओं इंजेक्षन।

3. उप रेटिना इंजेक्शन (~ इंजेक्शन प्रति 5 मिनट)

नोट: यदि संभव हो तो किनारी वाहिकाओं कल्पना करने के लिए बहुत आसान नहीं हैं, वयस्क सूरजमुखी मनुष्य चूहों के साथ तकनीक सीखना। और अधिक आसानी से इंजेक्शन साइट के दृश्य की सुविधा के लिए (कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए प्रयास करने से पहले) सीखने जब फास्ट ग्रीन समाधान इंजेक्षन।

  1. कृंतक anesthetize। 100 मिलीग्राम / एमएल ketamine और 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine (20 μl / 10 ग्राम शरीर डब्ल्यू की intraperitoneal इंजेक्शन का प्रयोग करेंisofluorane साँस लेना से अधिक आठ) यह कृंतक पैंतरेबाज़ी और इनहेलर में थूथन के साथ नजर में इंजेक्षन करने के लिए मुश्किल है के बाद से।
    1. पशु गहरा अपने पंजे में से एक pinching द्वारा anesthetized है कि सुनिश्चित करें। यह flinches हैं, तो कई अधिक मिनट तक प्रतीक्षा करें और subretinal इंजेक्शन की शुरुआत से पहले फिर से प्रयास करें।
  2. इंजेक्ट किया जाएगा कि आंख छत का सामना करना पड़ रहा है, इसलिए है कि अपने पक्ष पर कृंतक स्थिति।
  3. थैली (अस्थायी proptosis) के थोड़ा बाहर चबूतरे और सिर्फ कान के ऊपर और उसके जबड़े से और धीरे से पलकें त्वचा समानांतर खिंचाव दो उंगलियों के साथ उसके सिर पकड़े द्वारा और अधिक सुलभ हो जाता है तो एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत धीरे त्वचा में खिंचाव इसलिए आंख से थोड़ा सॉकेट से बाहर है कि ऊपर चबूतरे (चित्रा 1C देखें)। गले को भी बंद कृंतक समझ नहीं है।
  4. एक 30 ग्राम तेज डिस्पोजेबल पूर्व निष्फल सुई के साथ, जहाजों हिट रहे हैं, तो खून बह रहा होगा ख (तुरंत किनारी नीचे एक छेद बनामहत्वपूर्ण ई और यह बाद में छेद खोजने के लिए मुश्किल हो सकता है) और एक कोण पर सुई (चित्रा -1) के साथ लेंस को छू से बचने के लिए। घटित होगा तेज (या कुंद) सुई या तत्काल मोतियाबिंद गठन के साथ लेंस को छूने से बचें।
    नोट: इंजेक्शन दो लोगों के साथ बेहतर काम करते हैं। इस रास्ते में एक व्यक्ति को वे छेद है जहां पर ध्यान बनाए रखने के लिए तेज डिस्पोजेबल सुई के साथ पहली छेद बनाया है के बाद इंजेक्शन प्रदर्शन व्यक्ति को कुंद सुई के साथ सिरिंज पारित कर सकते हैं।
  5. सिर पर पकड़ बनाए रखते हुए आंख से डिस्पोजेबल तेज सुई वापस लेना। छेद है वास्तव में, जहां याद रखें।
  6. या तो एक micromanipulator पर एक कुंद सुई के साथ पूर्व लोड सिरिंज बढ़ते या इसे हाथ से पकड़े हुए, लेंस को छूने और धीरे आंख के माध्यम से इसे धक्का नहीं है फिर ख्याल रख रही है, छेद के माध्यम से कुंद सुई के साथ सिरिंज की नोक डालने के बाद बहुत धीरे महसूस कर प्रतिरोध (चित्रा -1) तक।
  7. कश्मीरएक न्यूनतम करने के लिए सभी आंदोलनों eeping, सावधानी से धीरे-धीरे subretinal अंतरिक्ष में RPE कोशिकाओं इंजेक्षन।
    नोट: RPE / रेटिना टुकड़ी प्रेरित किया जाएगा; यह अपरिहार्य है। हालांकि, एक क्लीनर इंजेक्शन टुकड़ी को कम करता है और बहुत reattachment (चित्रा 1E) की संभावना को बेहतर बनाता है। किसी भी अतिरंजित आंदोलनों रेटिना में वापस सुई स्थानांतरित कर सकते हैं, और बग़ल में आंदोलनों रेटिना को नुकसान पहुंचा सकते हैं। एक इंजेक्शन पंप का उपयोग वैकल्पिक है, लेकिन एक बहुत ही सटीक प्रसव के लिए अनुमति देता है।
  8. धीरे धीरे सिरिंज वापस लेना। आँख मॉइस्चराइजिंग लागू करें हाइड्रेटेड नजर रखने के लिए चला जाता है।
  9. यह sternal अवलंबन आएगा जब तक पशु निगरानी जारी है। नायाब जानवर छोड़ने के लिए या यह sternal अवलंबन आएगा जब तक अन्य चेतावनी जानवरों के साथ एक पिंजरे में वापस नहीं करते।

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Representative Results

हम इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक का उपयोग कर जल्दी से और लगातार कृन्तकों के subretinal अंतरिक्ष में RPE कोशिकाओं के निलंबन वितरित कर सकते हैं। आवश्यक नहीं है, जबकि दुख बहुत चित्रा 1 ए और बी में एक micromanipulator के साथ दिखाया गया सेटअप का उपयोग कम से कम किया जा सकता है। अस्थायी proptosis के लिए चित्रा 1C रूप में दिखाया गया कृंतक पकड़ो। micromanipulator के साथ या हाथ से प्रदर्शन किया अगर चरणों वही कर रहे हैं; इन चित्रा -1 में कार्टून में चित्रित कर रहे हैं। लेबल वाले RPE कोशिकाओं से सफाई से प्रदर्शन किया प्रतिदीप्ति जब एक cSLO और एक अक्टूबर प्रणाली (चित्रा 2) का उपयोग करते हुए देखा जा सकता है प्रेरित रेटिना टुकड़ी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। चित्रा 3 में एक cSLO (subretinal इंजेक्शन के बाद तुरंत कब्जा कर लिया गया चित्रा 2 और चित्रा 3 से छवियों) एकाधिक पूरे इंजेक्शन स्थल के आसपास छवियों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एम है कि सेना की टुकड़ी नोटकेंद्र छवियों (3-5) में गहरा (नहीं बल्कि गंभीर) OST।

चित्रा 1
चित्रा 1. subretinal इंजेक्शन मंच और इंजेक्शन तकनीक का एक कार्टून चित्रण। (ए) छेद विदारक माइक्रोस्कोप प्रत्यय करने के लिए एक धातु की थाली में drilled किया गया। (बी) एक चुंबकीय स्टैंड पर एक micromanipulator में और इंजेक्शन के दौरान स्थिति से बाहर ले जाया जा सकता है। (सी) कृंतक पकड़ो अस्थायी proptosis के लिए दिखाया गया है। ( आंख के प्रमुख संरचनाओं के डी) चित्रण (डी;। एक छेद सिर्फ किनारी और लेंस के नीचे एक तेज डिस्पोजेबल सुई के साथ नजर में किया जाता है) 3.4 कदम (डी;। 3.6 चरण) एक कुंद सुई के छेद में डाला जाता है और diametrically विरोध रेटिना के माध्यम से धीरे RPE छू तक (डी; चरण 3.8)। कोशिकाओं के इंजेक्शन एक अस्थायी रेत लाती हैinal टुकड़ी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2. बुध्न छवियों subretinal इंजेक्शन के बाद सीधे लिया। (ए) सही पैनल (आईआर और FAF छवियों के ओवरले) में मनाया हरी प्रतिदीप्ति (बी) तंत्रिका रेटिना की रेटिना टुकड़ी। एक क्षणिक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल आईपीएस RPE कोशिकाओं से उत्सर्जित होता है और RPE इंजेक्शन के पास मनाया जाता है (तीर के साथ चिह्नित) subretinal इंजेक्शन के बाद साइट। (ए) में तारांकन ऑप्टिक तंत्रिका लेबल। (यह आंकड़ा Krohne एट अल से अपने मूल स्वरूप में पुनर्प्रकाशित किया जा रहा है। 21) स्केल बार = 200 माइक्रोन ज क्लिक करेंपहले यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 3
हम इंजेक्शन स्थल के चारों ओर कई छवियों पर कब्जा कर सकते हैं एक अक्टूबर डिवाइस का उपयोग सीधे इंजेक्शन के बाद इंजेक्शन स्थल के आसपास अक्टूबर का उपयोग vivo इमेजिंग। में चित्रा 3. टुकड़ी का इंजेक्शन और हद की प्रभावशीलता दोनों निर्धारित करने के लिए। इस उदाहरण न्यूनतम टुकड़ी में मनाया जाता है (चित्र 3-5 में विशेष रूप से सूजन के रूप में देखा)। स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन

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Discussion

इस लेख में हम चूहों और चूहों में निलंबन में RPE कोशिकाओं की subretinal इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए एक अपेक्षाकृत सरल विधि का वर्णन। प्रोटोकॉल कम दुख में अनुवाद करेंगे तकनीक के साथ जानने के लिए आसान और अधिक अनुभव है (चित्रा 3, यह बेहतर इंजेक्शन से एक का प्रतिनिधित्व करता है) एक micromanipulator (चित्रा 1 ए) का इस्तेमाल किया जाता है, खासकर अगर। किसी भी आघात एक cSLO और अक्टूबर प्रणाली (चित्रा 2) यदि उपलब्ध हो तो साथ vivo में नजर रखी जा सकती है। उच्च संकल्प और कम शोर छवियों वांछित हैं, कला इमेजिंग प्लेटफार्मों का राज्य murine रोग मॉडल 39-41 में अक्टूबर के प्रदर्शन के लिए उत्कृष्ट प्रोटोकॉल के साथ उपलब्ध हैं।

इस तकनीक के साथ जुड़े सबसे आम जटिलताओं choroidal हेमोरेज, जिससे अत्यधिक रेटिना टुकड़ी उत्प्रेरण, सर्जरी के दौरान पशु के अनुचित स्थिति से उत्पन्न होती हैं, और सुई से RPE कोशिकाओं की भाटा। तैनात हैंअनुपयुक्त, यह पहली बार छेद बनाने के लिए मुश्किल हो जाएगा, और भी कठिन होने के बाद इसे खोजने के लिए। आँख का स्थानांतरण असंभव कुंद सुई के साथ पैठ बना रही है, छेद अस्पष्ट सकता है। यह एक तेज सुई के साथ एक और छेद बनाने के लिए संभव है, यह अधिक आघात बनाता है। उच्चारण रेटिना टुकड़ी गंभीर दृश्य हानि में परिणाम कर सकते हैं। टुकड़ी रेटिना न्यूरॉन्स और glia में विशेषता morphological परिवर्तन के लिए प्रेरित; प्रतिक्रियाशील gliosis और रेटिना remodeling के इन संयोजनों फोटोरिसेप्टर कोशिका मृत्यु 42 को बढ़ावा देने के कर सकते हैं। बहुत अधिक दबाव कुंद टिप के साथ सिरिंज के साथ लागू किया जाता है, तो अंत में, choroidal ख़ून का बहाव प्रेरित किया जा सकता है। अभी तक बहुत ज्यादा दबाव लागू किया जाता है तो इन उदाहरणों दुर्लभ हैं, हालांकि, RPE और हो सकता है Bruch झिल्ली और कुछ आईपीएस RPE के सफलता, रंजित में मनाया जा सकता है। रेटिना और शीशे में इंजेक्शन RPE कोशिकाओं की भाटा अधिक बार होता है, और से बचने के लिए मुश्किल है। इस syrin retracting द्वारा कम किया जा सकता हैजीई इंजेक्शन के बाद बहुत धीरे-धीरे कुंद सुई के साथ (इस संबंध में micromanipulator अविश्वसनीय रूप से उपयोगी है)।

क्षेत्र में इस्तेमाल अन्य तकनीकों और अधिक परिष्कृत कर रहे हैं लेकिन (समीक्षा के लिए Ramsden एट अल। 30 देखें) भी काफी अधिक चुनौती दे रहे हैं। यह श्वेतपटल, रंजित, और RPE के माध्यम से विपरीत दिशा में तेजी से सुई डालने से subretinal अंतरिक्ष में निलंबन में कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए संभव है। इस तकनीक में काफी अधिक अभ्यास और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है; महारत हासिल है, जब तक RPE कोशिकाओं के सबसे रंजित या रेटिना में इंजेक्शन और subretinal अंतरिक्ष में एकीकृत कभी नहीं किया जाएगा। (इसके अलावा, आंख की सीमित पहुंच के कारण, इस दृष्टिकोण मानव रोगियों में उपयोग के लिए अनुपयुक्त है।) यह ध्रुवीकरण RPE के 43 में से बरकरार monolayers के प्रत्यारोपण के लिए भी संभव है। यह एक छेद के माध्यम से रेटिना के नीचे, या एक कृत्रिम झरझरा सब्सट्रेट और insertin पर कोशिकाओं से बढ़ द्वारा RPE कोशिकाओं के एक पत्रक unrolling द्वारा या तो किया जाता हैsubretinal अंतरिक्ष में जी दोनों कोशिकाओं और कृत्रिम। इन तकनीकों के फायदे RPE कोशिकाओं आरोपण पर "repolarize" की जरूरत नहीं है के रूप में स्पष्ट कर रहे हैं, और रेटिना में बच कि RPE कोशिकाओं की पिगमेंटड क्षेत्रों के संभावित गठन काफी हद तक 16,44 से बचा जा सकता है। हालांकि, इन शल्य चिकित्सा तकनीक स्वाभाविक और भी अधिक जटिल हैं। इसके अलावा, मानव में, RPE और कृत्रिम एक लेजर के साथ cauterized किया जाना चाहिए कि एक छेद के माध्यम मैक्युला के तहत डाला जा करने की आवश्यकता होगी। इस cauterized क्षेत्र के आसपास रेटिना अध: पतन का परिणाम देगा।

यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करने का लाभ यह है कि, विश्वसनीयता का प्रदर्शन जानने के लिए सबसे आसान है, और RPE के अलावा अन्य यौगिकों या कोशिकाओं देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है किया जा सकता है। इसके अलावा, (कोशिकाओं देने के लिए कुंद सुई के बजाय तेज सुई का उपयोग) मामूली संशोधनों के साथ, यह एक ही तकनीक intravitreally कोशिकाओं या दवाओं देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम एकइस तकनीक के अनुरूप परिणाम chieve, और अनुभव के माध्यम से और vivo इमेजिंग निगरानी के माध्यम से तकनीक के साथ जुड़े आघात को कम से कम करने के लिए सीखा है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM) Gibco  21985-023 50 ml x 1 
Cell Scapers VWR 89260-222 Case x 1
CellTracker Green CMFDA Molecular Probes C34552 50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-144 500 ml x 1 
Fast Green Sigma-Aldrich F7258 25 g x 1 
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops  Walmart 4060941 25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR Hamilton 87942 Syringe x 1 
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel) Hamilton 7803-05 Needles x 6
Knockout DMEM Gibco 10829-018 500 ml x 1 
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828-028 500 ml x 1 
L-Glutamine 200 mM Gibco 25030-081 100 ml x 1
Magnetic Stand Leica Biosystems 39430216 Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X  Gibco 11140-050 100 ml x 1
Micromanipulator Leica Biosystems 3943001 Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)   VWR BD309656 Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1") VWR BD305128 Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red Gibco 12604013 100 ml x 1

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References

  1. Bird, A. C. Therapeutic targets in age-related macular disease. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).
  2. Jong, P. T. Age-related macular degeneration. Med, N. . E. ngl. J. . 355 (14), 1474-1485 (2006).
  3. Abe, T. Auto iris pigment epithelial cell transplantation in patients with age-related macular degeneration: short-term results. The Tohoku Journal Of Experimental Medicine. 191 (1), 7-20 (2000).
  4. Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 232, 707-716 (1994).
  5. Binder, S. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).
  6. Binder, S. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am. J. Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).
  7. Juan, E., Loewenstein, A., Bressler, N. M., Alexander, J. Translocation of the retina for management of subfoveal choroidal neovascularization II: a preliminary report in humans. Am. J. Ophthalmol. 125 (5), 635-646 (1998).
  8. Falkner-Radler, C. I. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study. British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).
  9. Joussen, A. M. How complete is successful 'Autologous retinal pigment epithelium and choriod translocation in patients with exsudative age-related macular degeneration: a short-term follow-up' by Jan van Meurs and P.R. van Biesen. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 241 (12), 966-967 (2003).
  10. Lai, J. C. Visual outcomes following macular translocation with 360-degree peripheral retinectomy. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1317-1324 (2002).
  11. Machemer, R., Steinhorst, U. H. Retinal separation, retinotomy, and macular relocation: II. A surgical approach for age-related macular degeneration? Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 231 (11), 635-641 (1993).
  12. MacLaren, R. E. Autologous transplantation of the retinal pigment epithelium and choroid in the treatment of neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 114 (3), 561-570 (2007).
  13. Peyman, G. A. A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring. Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).
  14. Buchholz, D. E. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
  15. Carr, A. J. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15 (4), 283-295 (2009).
  16. Carr, A. J. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
  17. Hirami, Y. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).
  18. Idelson, M. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
  19. Klimanskaya, I. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).
  20. Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE. Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).
  21. Krohne, T. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).
  22. Lund, R. D. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
  23. Meyer, J. S. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  24. Osakada, F. In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction. J. Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).
  25. Vugler, A. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp. Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
  26. Westenskow, P. D. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).
  27. Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch. Ophthalmol. 122 (10), 598-614 (2004).
  28. Li, Y., et al. Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Molecular Medicine. 18, 1312-1319 (2012).
  29. Wang, N. K. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa). Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).
  30. Ramsden, C. M. Stem cells in retinal regeneration: past, present and future. Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
  31. Schwartz, S. D. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  32. Carr, A. J. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).
  33. Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. The New Visual Neurosciences. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).
  34. Westenskow, P., Sedillo, Z., Friedlander, M. Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from iPS. J. Vis. Exp. , Forthcoming Forthcoming.
  35. Furhmann, S., Levine, E. M., Friedlander, M. Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development. 127 (21), 4599-4609 (2000).
  36. Lu, B. Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration). Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).
  37. Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).
  38. Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. Journal Of Visualized Experiments. , e50932 (2014).
  39. Huber, G. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5888-5895 (2009).
  40. Kim, K. H. Monitoring mouse retinal degeneration with high-resolution spectral-domain optical coherence tomography. Journal of Vision. 53 (8), 4644-4656 (2008).
  41. Pennesi, M. E. Long-term characterization of retinal degeneration in rd1 and rd10 mice using spectral domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 4644-4656 (2012).
  42. Fisher, S. K., Lewis, G. P., Linberg, K. A., Verardo, M. R. Cellular remodeling in mammalian retina: results from studies of experimental retinal detachment. Progress in Retinal And Eye Research. 24 (3), 395-431 (2005).
  43. Hu, Y. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
  44. Diniz, B. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).

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चिकित्सा अंक 95 रेटिना वर्णक उपकला subretinal इंजेक्शन translational चिकित्सा उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन सेल आधारित वितरण
निलंबन में रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं उद्धार करने के लिए कृन्तकों में subretinal इंजेक्शन प्रदर्शन
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Westenskow, P. D., Kurihara, T.,… More

Westenskow, P. D., Kurihara, T., Bravo, S., Feitelberg, D., Sedillo, Z. A., Aguilar, E., Friedlander, M. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247, doi:10.3791/52247 (2015).

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