Abstract
De omzetting van licht in elektrische impulsen optreedt in de buitenste retina en is grotendeels bereikt door staafjes en kegeltjes fotoreceptoren en retinale pigmentepitheel (RPE) cellen. RPE bieden kritische steun voor de fotoreceptoren en de dood of disfunctioneren van RPE cellen is kenmerkend voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de voornaamste oorzaak van permanent verlies van het gezichtsvermogen bij mensen van 55 jaar en ouder. Hoewel er geen remedie voor AMD is geïdentificeerd, kan implantatie van gezonde RPE in zieke ogen blijken een effectieve behandeling, en grote aantallen RPE cellen kunnen gemakkelijk worden gegenereerd uit pluripotente stamcellen. Verschillende interessante vragen over de veiligheid en werkzaamheid van RPE cellen levering kan nog worden onderzocht in diermodellen en goed aanvaarde protocollen gebruikt injecteren RPE ontwikkeld. De hier beschreven techniek is door meerdere groepen in diverse studies en omvat eerst een gat in het oog met een scherpe naald. Dan is een spuit met een blunt naald geladen met cellen wordt ingebracht door het gat en door het glasvocht, totdat deze net tegen de RPE. Met deze injectiemethode, die relatief eenvoudig en vereist minimale apparatuur, we consistente en efficiënte integratie van stamcellen afgeleide RPE cellen bereiken tussen de ontvangst RPE die aanzienlijke hoeveelheid fotoreceptor degeneratie voorkomt in dierlijke modellen. Hoewel geen onderdeel van de eigenlijke protocol, ook beschrijven hoe de omvang van het trauma veroorzaakt door de injectie en Controleren of de cellen werden geïnjecteerd in de subretinale ruimte met in vivo beeldvormende modaliteiten. Tenslotte wordt het gebruik van dit protocol niet beperkt tot RPE cellen; kan worden gebruikt om een verbinding of cel in de subretinale ruimte te injecteren.
Protocol
Opmerking: Alle dieren werden volgens de ethische richtlijnen die door de Scripps Research Institute behandeld.
1. Voorbereiding van Materialen voor de Injectie (~ 20 min)
- Voorverwarmen cel dissociatie oplossing (bij voorkeur een die wordt geïnactiveerd door verdunning niet met serum), steriel PBS, en kweekmedia (Tabel 1).
- Steriliseren van de spuit met een stompe naald door het demonteren en het koken van de onderdelen in water gedurende 15 min.
2. Bereiding van de RPE cellen voor injectie (~ 30 min tot 1 uur)
- Maak de RPE cellen met voorverwarmd cel dissociatie oplossing gedurende 5-8 minuten bij 37 ° C.
- Schraap de cellen zachtjes om elke dat verbonden blijven los.
- Verdun de cellen met een groot volume kweekmedium (vullen een 15 ml buisje) de dissociatie oplossing inactiveren en tellen.
- Centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
- Resuspendeer de cellen bij 200.000 cellen / ul (100.000 cellen leveren een 0,5 pi volume) in steriele voorverwarmde PBS en overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg desgewenst een levende cel voorbijgaande fluorescente merker en incubeer bij 37 ° C gedurende 30-45 min.
- Plaats de spuit met een stompe naald met 0,5 ul van cellen. Injecteer de cellen zo spoedig mogelijk.
3. Sub-retinale Injectie (~ 5 min per injectie)
OPMERKING: Als het mogelijk is, leren de techniek met volwassen albino ratten sinds de limbus schepen zijn veel gemakkelijker te visualiseren. Injecteer Fast Green oplossing bij het leren (voordat u cellen injecteren) visualisatie van de injectieplaats gemakkelijker vergemakkelijken.
- Verdoven van het knaagdier. Gebruik intraperitoneale injecties van 100 mg / ml ketamine en 10 mg / ml xylazine (20 gl / 10 g lichaamsgewicht wacht) over isofluorane inhalatie omdat het moeilijk is om het knaagdier manoeuvreren en injecteren in het oog met de snuit in de inhalator.
- Zorg ervoor dat het dier diep wordt verdoofd door knijpen een van zijn poten. Als het flinches, wacht u nog enkele minuten en probeer het opnieuw voor het begin van de subretinale injectie.
- Plaats het knaagdier op zijn zijkant zodat het oog, dat zal worden geïnjecteerd wordt geconfronteerd met het plafond.
- Onder een dissectiemicroscoop voorzichtig rekken van de huid, zodat het oog springt iets omhoog uit het stopcontact (tijdelijke proptosis) en wordt meer toegankelijk te houden haar hoofd met twee vingers net boven het oor en door zijn kaak en voorzichtig rekken de huid parallel aan de oogleden zodat het oog springt iets omhoog uit het stopcontact (zie figuur 1C). Niet begrijpen het knaagdier te dicht bij de keel.
- Met een 30 G scherpe wegwerp-pre gesteriliseerde naald, maak een gat direct onder de limbus (als de schepen worden getroffen, zal bloeden be significante en moeilijk zijn om het gat vinden later) en onder een hoek met raak de lens met de naald (figuur 1D). Raak de lens met de scherpe (of stompe) naald of onmiddellijke vorming cataract zal optreden.
OPMERKING: Injecties werken beter met twee mensen. Op deze manier kan één persoon de spuit pas met de stompe naald naar de persoon die de injectie nadat ze het eerste gat hebt gemaakt met de scherpe naald voor eenmalig gebruik om de focus te houden op waar het gat is. - Trek de disposable scherpe naald uit het oog terwijl het handhaven van de grip op het hoofd. Vergeet niet precies waar het gat is.
- Na ofwel de montage van de vooraf geladen spuit met een stompe naald op een micromanipulator vasthoudt of aan de hand, steek de punt van de spuit met de stompe naald door het gat, het verzorgen wederom de lens niet aanraakt en duw het door het oog heel zachtjes tot het gevoel weerstand (figuur 1D).
- Keeping alle bewegingen tot een minimum voorzichtig injecteer de RPE cellen langzaam in de subretinale ruimte.
OPMERKING: RPE / netvlies detachement zal worden opgewekt; dit onvermijdelijk is. Echter, een schonere injectie minimaliseert het losmaken en verbetert de kans heraanhechting (figuur 1E). Elke overdreven bewegingen kan de naald terug te gaan naar het netvlies, en zijwaartse bewegingen kan het netvlies beschadigen. Het gebruik van een injectiepomp optioneel, maar maakt een zeer nauwkeurige levering. - Trek de spuit langzaam. Solliciteer oog hydraterende daalt voor het oog gehydrateerd.
- Blijven toezien op het dier totdat het herwint borstligging. Laat dier niet onbeheerd of terug te keren naar een kooi met andere alert dieren totdat hij herwint borstligging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We kunnen een opschorting van RPE cellen te leveren in de subretinale ruimte van knaagdieren snel en consistent gebruik van de in dit manuscript beschreven techniek. Terwijl het niet nodig is, kan trauma's sterk worden geminimaliseerd via het getoond met een micromanipulator in figuur 1A & B-setup. Houd het knaagdier zoals getoond in figuur 1C tijdelijke proptosis. De stappen zijn hetzelfde als uitgevoerd met de micromanipulator of met de hand; deze worden afgebeeld in de cartoon in figuur 1D. Indien ze schoon fluorescentie van de gelabelde RPE cellen kan worden gedetecteerd met een cSLO en de geïnduceerde retinale loslating te zien met een oktober systeem (figuur 2). In figuur 3 is een cSLO gebruikt om meerdere beelden rond de gehele injectieplaats vangen (de beelden van Figuur 2 en Figuur 3 werden onmiddellijk gevangen na de subretinale injectie). Let op het detachement dat is most diepe (maar niet ernstig) in het midden afbeeldingen (3-5).
Figuur 1. De subretinal injectie platform en een cartoon afbeelding van de injectietechniek. (A) werden gaten geboord in een metalen plaat om de dissectiemicroscoop aanbrengen. (B) een micromanipulator op een magnetische standaard kan in en uit positie tijdens de injecties worden bewogen. (C) Houd het knaagdier zoals tijdelijke proptosis. ( D) Afbeelding van de belangrijkste structuren van het oog (D;. Stap 3.4) wordt een gat gemaakt in het oog met een scherp wegwerpnaald net onder de limbus en lens (D;. Stap 3.6) Een stompe naald wordt in het gat gestoken en door de lijnrecht tegenover netvlies tot zachtjes aanraken van de RPE (D; Stap 3.8). Injectie van de cellen induceert een tijdelijke retrechtelijke onthechting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Fundus beelden direct na subretinal injectie genomen. (A) De groene fluorescentie waargenomen in het rechterpaneel (overlay van de IR en FAF afbeeldingen) wordt uitgestoten uit iPS-RPE cellen gelabeld met een tijdelijke fluorescente merker. (B) Netvliesloslating van de neurale retina en RPE waargenomen bij de injectie nadat het subretinale injectie (aangeduid met pijl). Sterretje in (A) labelt de oogzenuw. (Dit cijfer wordt gepubliceerd in het oorspronkelijke formaat van Krohne et al. 21) Schaal bar = 200 pm Klik here om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. In vivo beeldvorming met oktober rond de injectieplaats onmiddellijk na de injectie. Met een oktober apparaat kunnen we meerdere beelden rond de injectieplaats vast aan de effectiviteit van de injectie en de omvang van de onthechting bepalen. In dit voorbeeld minimaal onthechting (waargenomen zwelling bijzonder in beeld 3-5) waargenomen. Schaal bar = 200 urn
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor het uitvoeren subretinale injecties van RPE cellen in suspensie bij ratten en muizen. Het protocol is eenvoudig te leren en ervaring met de techniek zal vertalen in minder trauma (figuur 3; dit is een van de betere injecties), vooral een micromanipulator wordt gebruikt (figuur 1A). Elk trauma kan worden gevolgd in vivo met een cSLO en oktober (zie figuur 2), indien beschikbaar. Als afbeeldingen hogere resolutie en minder lawaaierige gewenst zijn, state of the art beeldvorming platforms zijn beschikbaar, samen met een uitstekende protocollen voor het uitvoeren van oktober in muizen ziekte modellen 39-41.
De meest voorkomende complicaties in verband met deze techniek ontstaan door onjuiste plaatsing van het dier tijdens de operatie, het induceren van overmatige netvliesloslating, waardoor choroidale bloedingen, en reflux van de RPE cellen van de naald. Als gepositioneerdonjuist, zal het moeilijk zijn om de eerste gaatje te maken, en nog moeilijker te vinden na. Verschuiven van het oog kon het gat te verdoezelen, waardoor penetratie met de stompe naald onmogelijk. Hoewel het mogelijk is om een gat te maken met een scherpe naald, creëert meer trauma. Uitgesproken netvliesloslatingen kan leiden tot ernstige verlies van gezichtsvermogen. Detachementen veroorzaken karakteristieke morfologische veranderingen in retinale neuronen en glia; deze combinaties van reactieve gliosis en retinale verbouwing kan fotoreceptorcel dood 42 te bevorderen. Tot slot, als er te veel druk wordt toegepast met de spuit met de stompe punt, choroidale bloedingen kan worden opgewekt. Wanneer te veel druk wordt uitgeoefend, kan doorbraak van de RPE en de membraan van Bruch kan optreden en sommige iPS-RPE worden waargenomen in het vaatvlies, maar deze gevallen zijn zeldzaam. Reflux geïnjecteerde RPE cellen in het netvlies en glasachtig komt vaker voor en is moeilijk te vermijden. Dit kan worden geminimaliseerd door het terugtrekken van de syringe met de stompe naald heel langzaam na de injectie (in dit verband de micromanipulator is ongelooflijk nuttig).
Andere technieken die in het veld verfijnder maar ook aanzienlijk moeilijker (voor review zie Ramsden et al. 30). Het is mogelijk om cellen in suspensie te injecteren in de subretinale ruimte door een scherp naald in tegengestelde richting door de sclera, choroid en RPE. Deze techniek vergt aanzienlijk meer praktijken en expertise; tot de knie, de meeste van de RPE cellen worden geïnjecteerd in het vaatvlies of retina en nooit integreren in de subretinale ruimte. (Ook, vanwege de beperkte toegankelijkheid van de ogen, deze benadering is niet geschikt voor gebruik bij menselijke patiënten.) Het is ook mogelijk om intacte monolagen van gepolariseerde RPE 43 implanteren. Dit gebeurt door afrollen een vel van RPE cellen onder de retina door een spleet of door de cellen te kweken op een kunstmatige poreuze substraat en insertinG zowel de cellen en prothetische in de subretinale ruimte. De voordelen van deze technieken zijn duidelijk als de RPE cellen niet nodig om "repolarize" bij implantatie en de mogelijke vorming van gepigmenteerde gebieden van RPE cellen die ontsnappen in het netvlies kan grotendeels worden vermeden 16,44. Echter, deze chirurgische technieken zijn inherent nog ingewikkelder. Bovendien, bij de mens, de RPE en prothetische moet onder de macula door een spleet die moet worden dichtgeschroeid met een laser te voegen. Dit resulteert in retinale degeneratie rond de cauterized regio.
Het voordeel van het protocol hier beschreven is dat het kan worden uitgevoerd betrouwbaarheid is het gemakkelijkst om te leren, en kan worden gebruikt om andere verbindingen of cellen leveren naast RPE. Bovendien, met geringe modificaties (met de scherpe naald in plaats van de stompe naald om de cellen te leveren), dezelfde techniek kan worden gebruikt om cellen of geneesmiddelen intravitreaal leveren. We eenChieve consistente resultaten met deze techniek, en hebben geleerd om het trauma verbonden met de techniek door ervaring en door in vivo beeldvorming controle minimaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21985-023 | 50 ml x 1 |
| Cell Scapers | VWR | 89260-222 | Case x 1 |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C34552 | 50 µg x 20 |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | 500 ml x 1 |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | 25 g x 1 |
| Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops | Walmart | 4060941 | 25 ml x 1 |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| Magnetic Stand | Leica Biosystems | 39430216 | Stand x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Gibco | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Micromanipulator | Leica Biosystems | 3943001 | Manipulator x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | 100 ml x 1 |
| Slip Tip Syringes without Needles BD (3 ml) | VWR | BD309656 | Pack x 1 |
| Specialty-Use Needles BD (30 G, 1") | VWR | BD305128 | Box x 1 |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | 100 ml x 1 |
References
- Bird, A. C. Therapeutic targets in age-related macular disease. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).
- Jong, P. T. Age-related macular degeneration. Med, N. . E. ngl. J. . 355 (14), 1474-1485 (2006).
- Abe, T. Auto iris pigment epithelial cell transplantation in patients with age-related macular degeneration: short-term results. The Tohoku Journal Of Experimental Medicine. 191 (1), 7-20 (2000).
- Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 232, 707-716 (1994).
- Binder, S. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am. J. Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).
- Juan, E., Loewenstein, A., Bressler, N. M., Alexander, J. Translocation of the retina for management of subfoveal choroidal neovascularization II: a preliminary report in humans. Am. J. Ophthalmol. 125 (5), 635-646 (1998).
- Falkner-Radler, C. I. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study. British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).
- Joussen, A. M. How complete is successful 'Autologous retinal pigment epithelium and choriod translocation in patients with exsudative age-related macular degeneration: a short-term follow-up' by Jan van Meurs and P.R. van Biesen. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 241 (12), 966-967 (2003).
- Lai, J. C. Visual outcomes following macular translocation with 360-degree peripheral retinectomy. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1317-1324 (2002).
- Machemer, R., Steinhorst, U. H. Retinal separation, retinotomy, and macular relocation: II. A surgical approach for age-related macular degeneration? Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 231 (11), 635-641 (1993).
- MacLaren, R. E. Autologous transplantation of the retinal pigment epithelium and choroid in the treatment of neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 114 (3), 561-570 (2007).
- Peyman, G. A. A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring. Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).
- Buchholz, D. E. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Carr, A. J. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15 (4), 283-295 (2009).
- Carr, A. J. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Hirami, Y. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).
- Idelson, M. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Klimanskaya, I. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).
- Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE. Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).
- Krohne, T. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).
- Lund, R. D. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Meyer, J. S. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Osakada, F. In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction. J. Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).
- Vugler, A. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp. Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Westenskow, P. D. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch. Ophthalmol. 122 (10), 598-614 (2004).
- Li, Y., et al. Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Molecular Medicine. 18, 1312-1319 (2012).
- Wang, N. K. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa). Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).
- Ramsden, C. M. Stem cells in retinal regeneration: past, present and future. Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- Schwartz, S. D. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Carr, A. J. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).
- Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. The New Visual Neurosciences. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).
- Westenskow, P., Sedillo, Z., Friedlander, M. Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from iPS. J. Vis. Exp. , Forthcoming Forthcoming.
- Furhmann, S., Levine, E. M., Friedlander, M. Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development. 127 (21), 4599-4609 (2000).
- Lu, B. Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration). Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).
- Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. Journal Of Visualized Experiments. , e50932 (2014).
- Huber, G. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5888-5895 (2009).
- Kim, K. H. Monitoring mouse retinal degeneration with high-resolution spectral-domain optical coherence tomography. Journal of Vision. 53 (8), 4644-4656 (2008).
- Pennesi, M. E. Long-term characterization of retinal degeneration in rd1 and rd10 mice using spectral domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 4644-4656 (2012).
- Fisher, S. K., Lewis, G. P., Linberg, K. A., Verardo, M. R. Cellular remodeling in mammalian retina: results from studies of experimental retinal detachment. Progress in Retinal And Eye Research. 24 (3), 395-431 (2005).
- Hu, Y. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Diniz, B. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).
