Medicine

Выполнение субретинальных инъекции грызунов для доставки пигментного эпителия сетчатки клеток в суспензии

Published: January 23, 2015 doi: 10.3791/52247

Peter D. Westenskow^1,2, Toshihide Kurihara¹, Stephen Bravo¹, Daniel Feitelberg¹, Zack A. Sedillo², Edith Aguilar¹, Martin Friedlander^1,2

¹Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, ²Lowy Medical Research Institute

Abstract

Превращение света в электрические импульсы происходит в наружной сетчатке и осуществляется в основном с помощью палочек и колбочек фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (RPE) клеток. НПП обеспечить необходимую поддержку для фоторецепторов и смерти или дисфункции ПЭС клеток характерно возрастной макулярной дегенерации (ВМД), основной причиной необратимой потере зрения у людей в возрасте от 55 лет и старше. Хотя никакого лечения для AMD, выявлено не было, имплантация здорового ПЭС в пораженных глаз, может оказаться эффективным средством для лечения и большое число клетках ПЭС может быть легко генерируется из плюрипотентных стволовых клеток. Несколько интересных вопросов, касающихся безопасности и эффективности НПП доставки клеток все еще может быть рассмотрен на животных моделях, и хорошо принимаются протоколы, используемые для введения ППД были разработаны. Техника, описанная здесь была использована несколькими группами в различных исследованиях и предполагает в первую очередь создание дыру в глаза с острой иглой. Тогда шприц с BluNT иглы загружен клеток вставляется через отверстие и проходит через стекловидное тело, пока она слегка не коснется RPE. С помощью этого метода впрыска, который относительно прост и требует минимального оборудования, мы достигаем последовательное и эффективной интеграции клеток, полученных клеток RPE в стволовых между принимающей ПЭС, который предотвращает значительное количество дегенерации фоторецептора на животных моделях. Хотя это и не часть фактической протокола, но также описывают, как определить степень травмы, вызванной инъекцией, и как проверить, что клетки вводили в субретинальной пространства с помощью методов визуализации в естественных условиях. Наконец, использование данного протокола не ограничивается клетках ПЭС; он может быть использован для введения любое соединение или клетки в субретинальной пространстве.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были обработаны в соответствии с этическими принципами, установленными в научно-исследовательском институте Скриппса.

1. Подготовка материалов для инъекций (~ 20 мин)

Предварительно теплый раствор диссоциации клеток (предпочтительно тот, который инактивируется через разведении, а не с сывороткой), стерильной PBS и культуральные среды (таблица 1).
Стерилизацию шприц с тупой иглой путем разборки и кипячения части в воде в течение 15 мин.

2. Подготовка клетки ПЭС для инъекций (~ 30 мин до 1 ч)

Отделить ПЭС клеток с использованием предварительно нагретого раствора для диссоциации клеток в течение 5-8 мин при температуре 37 ° С.
Очистите клетки осторожно, чтобы освободить тех, которые были до сих пор прилагается.
Развести клетки с большим объемом культуральной среды (пополнить 15 мл трубки), чтобы инактивировать диссоциации решение и считать их.
Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин для осаждения клеток.
Ресуспендируют клеток в 200 000 клеток / мкл (для доставки 100 000 клеток в объеме 0,5 мкл) в стерильной подогретого PBS и передавать их в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
При желании можно добавить живой клетке переходных флуоресцентный маркер и инкубировать при 37 ° С в течение 30-45 мин.
Загрузка шприц с тупой иглой с 0,5 мкл клеток. Вводить клетки как можно скорее.

3. Sub сетчатки инъекции (~ 5 мин на инъекций)

ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, изучить технику со взрослыми белых крыс с лимба суда значительно легче визуализировать. Вводите Быстрый зеленый раствор при изучении (перед тем, как вводить клетки) до более упростить и ускорить визуализацию в месте инъекции.

Обезболить грызуна. Использование внутрибрюшинные инъекции 100 мг / мл кетамина и 10 мг / мл ксилазина (20 мкл / 10 г тела швосемь) изофлураном более ингаляции, поскольку трудно маневрировать грызуна и ввести в глаз с мордой в ингаляторе.
1. Убедитесь, что животное глубоко под наркозом, зажимая одну из его лап. Если вздрагивает, подождите еще несколько минут и повторите попытку перед началом субретинальной инъекции.
Установите грызуна на бок, так что глаз, который будет введен сталкивается с потолка.
Под микроскопом рассекает мягко растянуть кожу так, глаз появляется немного вверх из гнезда (временное Экзофтальм) и становится более доступным, удерживая его голову двумя пальцами чуть выше уха и по его челюсти и аккуратно растянуть параллельно кожи на веки так что глаз появляется немного вверх из гнезда (Смотрите рисунок 1С). Не беритесь грызуна слишком близко к горлу.
С 30 соль-диез одноразового предварительно стерилизуют иглы, сделать отверстие непосредственно под лимба (если сосуды поражены, кровотечение бэлектронной значительным и это будет трудно найти отверстие позже) и под углом, чтобы не касаться объектива с иглой (рис 1D). Не прикасайтесь к линзам с острым (или тупой) иглой или формирования непосредственной катаракты произойдет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции работать с двумя людьми лучше. Таким образом, один человек может пройти шприц с тупой иглой лицу, осуществляющему инъекции после того как они создали первое отверстие с резким одноразовой иглой, чтобы сохранить фокус на котором отверстие.
Уберите одноразовые острую иглу из глаз, сохраняя при этом сцепление на голове. Помните, именно там, где отверстие.
После завершения работы установки предварительно загруженных шприц с тупой иглой на микроманипулятора или держа его за руку, вставьте кончик шприца с тупой иглой через отверстие, заботясь снова не прикасайтесь к объективу и аккуратно нажмите на него через глаз не очень мягко, пока чувство сопротивления (рис 1D).
Кeeping все движения к минимуму, тщательно вводить клетки ПЭС медленно в субретинальной пространстве.
ПРИМЕЧАНИЕ: НПП / отслойки сетчатки будет наводиться; это неизбежно. Тем не менее, чище впрыска минимизирует отряд и значительно повышает шансы на прикрепления (рис 1E). Любые преувеличенные движения могут переместить иглу обратно в сетчатке, и боковых движений может привести к повреждению сетчатки. Использование топливного насоса не является обязательным, но позволяет очень точной доставки.
Уберите шприц медленно. Применить глаз увлажнение падает держать глаз о водой.
Продолжайте следить за животное, пока он не восстановит грудины лежачее положение. Не оставляйте животное без присмотра или вернуться в клетку с другими оповещения животных, пока он вновь не грудины лежачее положение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы можем доставить суспензии клетках ПЭС в субретинальной пространстве грызунов быстро и последовательно, используя методику, описанную в этой рукописи. Хотя это и не требуется, травмы могут быть значительно минимизированы с помощью установки, показанной с микроманипулятором на рисунке 1А и B. Держите грызунов, как показано на рисунке 1С для временного экзофтальм. Шаги же, если производится с микроманипулятора или вручную; они изображены в мультфильме на рис 1D. При выполнении чисто флуоресценции от меченых клетках ПЭС могут быть обнаружены с помощью cSLO и индуцированного отслоение сетчатки можно увидеть с помощью системе ОКТ (рисунок 2). На рисунке 3 cSLO был использован для захвата нескольких изображений по всему месте инъекции (изображения с рисунках 2 и 3 были захвачены сразу после субретинальной инъекции). Обратите внимание на отряд, который мOST глубокое (но не тяжелая) в центре изображения (3-5).

Рисунок 1. субретинальная платформа впрыска и мультфильм изображение технике инъекции. (A) Отверстия были просверлены в металлической пластине для прикрепления рассекает микроскопом. (В) микроманипулятор на магнитной подставке может быть перемещен в и из позиции в течение инъекций. (С) проведение грызуна, как показано на временной экзофтальм. ( D) изображение основных структур глаза (D;. Шаг 3,4) делают отверстие в глаза с острым одноразового иглы только под лимба и объектив (D;. Шаг 3,6) тупым игла вставлена в отверстие и через диаметрально противоположные сетчатки до слегка касаясь RPE (D; Шаг 3,8). инъекции клеток не индуцирует временную RETИнал отряд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. глазного дна снимки, сделанные сразу после субретинальной инъекции. (А) зеленая флуоресценция наблюдается в правой панели (наложения изображений ИК и FAF) излучается из IPS-RPE клеток, меченных переходного флуоресцентным маркером. (В) Отслойка сетчатки нейронной сетчатки и РПЭ наблюдается вблизи инъекции сайт после субретинальной инъекции (отмечены стрелкой). Asterisk в (А) этикетки на зрительный нерв. (Эта цифра в настоящее время переиздан в своем первоначальном виде с Krohne и др. ²¹⁾ Шкала бар = 200 мкм Пожалуйста, нажмите часпрежде чем, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3. В естественных изображений с помощью октября вокруг места инъекции непосредственно после инъекции. Использование устройства октября мы можем захватить несколько изображений вокруг места инъекции, чтобы определить, как эффективность инъекции и степени отряда. В этом примере минимальной отряда (рассматривается как отек, особенно в образах 3-5) наблюдается. Масштабные линейки = 200 мкм

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы расскажем относительно простой способ для выполнения субретинальных инъекции ПЭС клеток в суспензии у крыс и мышей. Протокол проста в освоении и более опыт работы с техникой будет переводить в меньшем количестве травм (Рисунок 3, это является одним из лучших инъекций), особенно если микроманипулятор используется (рис 1а). Любая травма может контролироваться в естественных условиях с системой cSLO и восьмеричные (рис 2), если таковой имеется. Если более высокое разрешение и менее шумные изображения желании, состояние платформ искусство визуализации доступны, наряду с отличными протоколов для выполнения октябре в мышиных моделях болезни ^39-41.

Наиболее распространенные осложнения, связанные с этой техникой возникает из-за неправильного позиционирования животного во время операции, вызывающие чрезмерное отслоение сетчатки, сосудистой оболочки вызывая кровоизлияния и обратным НПП клеток из иглы. Если расположитьненадо, это будет трудно создать первое отверстие, и еще труднее найти его после. Переход глаза может заслонить отверстие, что делает проникновение с тупой иглой невозможно. Хотя это можно сделать другое отверстие с острой иглой, это создает больше травм. Выраженные отслойки сетчатки может привести к серьезным потери зрения. Отряды вызвать характерные морфологические изменения в нейронов сетчатки и глии; эти комбинации реактивного глиозом и сетчатки ремоделирования может способствовать фоторецепторов гибель клеток ^42. И, наконец, если слишком много давления применяется со шприцем с тупым кончиком, сосудистой оболочки кровотечение может быть вызвано. Если слишком много давления применяется, прорыв ПЭС и мембраной Бруха может произойти и некоторое IPS-РПЭ может наблюдаться в сосудистой оболочке глаза, хотя эти случаи редки. Рефлюкс инжектированных ПЭС клеток в сетчатке и стекловидном теле происходит более часто, и трудно избежать. Это может быть сведено к минимуму путем втягивания СиринGE с тупой иглой очень медленно после инъекции (в этой связи микроманипулятор невероятно полезно).

Другие методы, используемые в области являются более сложными, но также значительно более сложной (для обзора см Рамсден и др. ^30). Можно вводить клетки в суспензии в субретинальной пространстве, вставляя острую иглу в обратном направлении через склеру, сосудистой оболочки, и ПЭС. Этот метод требует значительно больше практики и опыта; до тех пор, пока освоено, большинство клеток RPE будет введен в сосудистой оболочке глаза или сетчатки и никогда не интегрироваться в субретинальной пространстве. (Кроме того, из-за ограниченного доступа в глаза, этот подход не годится для применения у больных человека.) Также можно имплантировать нетронутыми монослоя поляризованных ПЭС ^43. Это делается либо разворачивая лист ПЭС клеток под сетчатку через щель, или путем выращивания клеток на искусственном пористой подложки и insertinг и клетки и протезирование в субретинальной пространстве. Преимущества этих методов очевидны, как клетки ПЭС не нужно "реполяризовать" на имплантации, и возможного образования пигментных сферах клетках ПЭС, что бежать в сетчатке могут быть в значительной степени избежать ^16,44. Тем не менее, эти хирургические методы по своей природе еще более сложной. Кроме того, у людей, НПП и протезирование должны быть вставлены в соответствии с макулы через щель, которая должна быть прижигаемым с помощью лазера. Это приведет к дегенерации сетчатки вокруг прижигаемым области.

Преимущество использования протокола, описанную здесь, в том, что она может быть выполнена надежность, это самый простой, чтобы узнать, и может быть использован для доставки других соединений или клеток, кроме ПЭС. Кроме того, с небольшими изменениями (с использованием острой иглой, а не тупой иглы для доставки клеток), этот же метод может быть использован для доставки клеток или препаратов в стекловидное тело. МыКьеве последовательные результаты с этой техникой, и узнали, чтобы свести к минимуму травмы, связанные с техникой через опыт и через в естественных условиях мониторинга изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1