Udførelse subretinale Injektioner i Gnavere at levere retinale pigmentepitel celler i suspension

Abstract

Omdannelsen af ​​lys til elektriske impulser forekommer i den ydre retina og opnås i høj grad af stang og kegle fotoreceptorer og retinale pigmentepitel (RPE) celler. RPE giver kritisk støtte til fotoreceptorer og død eller dysfunktion af RPE-celler er karakteristisk for aldersrelateret makuladegeneration (AMD), den førende årsag til permanent synstab i mennesker 55 og ældre. Mens ingen helbredelse for AMD er blevet identificeret, kan implantation af sunde RPE i syge øjne vise sig at være en effektiv behandling, og store antal af RPE-celler kan let genereres ud fra pluripotente stamceller. Flere interessante spørgsmål vedrørende sikkerhed og effekt af RPE-celle levering kan stadig blive undersøgt i dyremodeller, og godt anerkendte protokoller, der anvendes til at injicere RPE er blevet udviklet. Den her beskrevne teknik er blevet anvendt af flere grupper i forskellige undersøgelser og involverer først at skabe et hul i øjet med en skarp nål. Derefter en sprøjte med en blunt nål fyldt med celler indsættes gennem hullet og føres gennem glaslegemet, indtil det rører ved RPE. Ved hjælp af denne injektion metode, der er forholdsvis enkel og kræver minimal udstyr, vi opnå en ensartet og effektiv integration af stamceller celleafledte RPE celler mellem værten RPE der forhindrer betydelig mængde fotoreceptordegenerering i dyremodeller. Mens ikke en del af selve protokollen, vi også beskrive, hvordan at bestemme omfanget af traumer som følge af injektion, og hvordan at kontrollere, at cellerne blev injiceret i subretinarummet ved hjælp af in vivo imaging modaliteter. Endelig er anvendelsen af ​​denne protokol ikke begrænset til RPE celler; den kan anvendes til at injicere enhver forbindelse eller celle i det subretinale rum.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med de etiske retningslinjer, som Scripps Research Institute.

1. Fremstilling af materialer til injektion (~ 20 min)

1. Pre-varm celledissocieringsopløsning (fortrinsvis en, der er inaktiveret ved fortynding, ikke med serum) sterilt PBS, og dyrkningsmediet (Tabel 1).
2. Steriliser sprøjte med en stump nål ved at skille den og koger de dele i vand i 15 min.

2. Fremstilling af RPE celler til injektion (~ 30 min til 1 time)

1. Frigør RPE celler under anvendelse af foropvarmet celledissocieringsopløsningen for 5-8 min ved 37 ° C.
2. Skrab cellerne forsigtigt for at frigive noget, der stadig er fastgjort.
3. Fortynd cellerne med en stor mængde dyrkningsmedier (fylde et 15 ml rør) for at inaktivere dissociation opløsning og tælle dem.
4. Centrifuger ved 800 x g i 5 min for at pelletere cellerne.
5. Resuspender cellerne ved 200.000 celler / pi (til at levere 100.000 celler i en 0,5 pi volumen) i sterilt forvarmet PBS og overføre dem i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
6. Eventuelt tilsættes en levende celle forbigående fluorescerende markør og inkuberes ved 37 ° C i 30-45 min.
7. Læg sprøjte med en stump nål med 0,5 pi celler. Injicer celler så hurtigt som muligt.

3. Sub-retinal Injection (~ 5 min pr Injection)

BEMÆRK: Hvis det er muligt, lære teknikken med voksne albinorotter siden limbus skibe er meget lettere at visualisere. Injicer Fast Green løsning, når læring (før du prøver at injicere celler) til lettere lette visualisering af injektionsstedet.

1. Bedøver gnaveren. Brug intraperitoneale injektioner af 100 mg / ml ketamin og 10 mg / ml xylazin (20 pl / 10 g krop wotte) i isofluoran indånding, da det er vanskeligt at manøvrere gnaver og injicere i øjet med snuden i inhalatoren.
   1. Sørg for, at dyret er dybt bedøvet ved at klemme en af ​​sine poter. Hvis det flinches, vente nogle minutter mere, og prøv igen, før du begynder subretinale injektion.
2. Placer gnaver på sin side, således at øjet, der vil blive injiceret vender loftet.
3. Under et dissektionsmikroskop forsigtigt strække huden, så øjet popper lidt op af soklen (midlertidig exophthalmus) og bliver mere tilgængelig ved at holde sit hoved med to fingre lige over øret og ved sin kæbe og forsigtigt strække huden parallelt med øjenlågene så øjet popper lidt op af soklen (se figur 1C). Fatter ikke gnaver for tæt på halsen.
4. Med en 30 G skarp disponible præ-steriliseret nål, lave et hul lige under limbus (hvis skibene bliver ramt, vil blødningen be betydelig og det være svært at finde hullet senere) og i en vinkel for at undgå at berøre objektivet med nålen (figur 1D). Undgå at røre ved linsen med den skarpe (eller stumpe) nål eller øjeblikkelig kataraktdannelse vil forekomme.
   BEMÆRK: Injektioner arbejde bedre med to personer. På denne måde en person kan passere sprøjten med den stumpe kanyle til den person, der udfører injektionen, efter at de har oprettet det første hul med den skarpe engangsnål at fastholde fokus på, hvor hullet er.
5. Træk den disponible skarp nål fra øjet, samtidig med at grebet om hovedet. Husk præcis, hvor hullet er.
6. Efter enten montering af pre-loaded sprøjte med en stump nål på en mikromanipulator eller holder det i hånden, spidsen af ​​sprøjten med stump nål gennem hullet, pas igen ikke at røre ved objektivet og tryk den forsigtigt gennem øjet meget forsigtigt, indtil føle modstand (figur 1D).
7. Keeping alle bevægelser til et minimum, omhyggeligt injicere RPE celler langsomt ind i subretinarummet.
   BEMÆRK: RPE / nethinden aftagelse blive induceret; dette er uundgåeligt. Men en renere injektion minimerer løsrivelse og i høj grad forbedrer chancerne for refiksation (Figur 1E). Eventuelle overdrevne bevægelser kan flytte nålen tilbage i nethinden, og sidelæns bevægelser kan beskadige nethinden. Anvendelsen af ​​en injektionspumpe er valgfri, men giver mulighed for en meget præcis levering.
8. Træk sprøjten langsomt. Anvend øjet fugtgivende dråber til at holde øje hydreret.
9. Fortsæt med at overvåge dyret, indtil det genvinder brystleje. Efterlad ikke dyr uden opsyn eller vende tilbage til et bur med andre dyr alarm, indtil det genvinder brystleje.

Representative Results

Vi kan levere en suspension af RPE celler i subretinarummet af gnavere hurtigt og konsekvent anvendelse af teknikken beskrevet i dette håndskrift. Selvom det ikke er påkrævet, kan traumer blive kraftigt minimeret ved hjælp af setup vist med en mikromanipulator i figur 1A & B. Hold gnaver som vist i figur 1C til midlertidig exophthalmus. Fremgangsmåden er den samme, hvis udført med mikromanipulator eller i hånden; disse er afbildet i tegneserie i figur 1D. Når udføres rent fluorescens fra mærket RPE-celler kan påvises under anvendelse af en cSLO og den inducerede nethindeløsning kan ses ved hjælp af et OLT-systemet (figur 2). I figur 3 blev et cSLO anvendes til at indfange flere billeder omkring injektionsstedet hele (billederne fra figur 2 og figur 3 blev fanget umiddelbart efter subretinal injektion). Bemærk frigørelsen, der er most dyb (men ikke alvorlig) i midten af ​​billeder (3-5).

Figur 1. subretinal injektion platform og en tegneserie skildring af injektionsteknik. (A) blev boret huller i en metalplade til at anbringe dissektionsmikroskop. (B) A mikromanipulator på et magnetisk stativ kan bevæges ind og ud af stilling under injektionerne. (C) Hold gnaver som vist for midlertidig exophthalmus. ( D) Afbildning af de vigtigste strukturer i øjet (D;. Trin 3.4) Der laves et hul i øjet med en skarp engangsnål lige under limbus og linsen (D;. Trin 3.6) En stump nål indsættes i hullet og gennem den diametralt modsatte nethinden indtil blidt røre RPE (D, trin 3.8). Injektion af cellerne inducerer en midlertidig RETINAL detachement. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2. Fundus billeder taget direkte efter subretinal injektion. (A) Den grønne fluorescens observeret i højre panel (overlay af IR og FAF billeder) udsendes fra iPS-RPE-celler mærket med en forbigående fluorescerende markør. (B) Nethindeløsning af den neurale retina og RPE observeres nær injektion stedet efter subretinal injektion (markeret med pil). Asterisk i (A) etiketter synsnerven. (Dette tal bliver genudgivet i dens oprindelige format fra Krohne et al. ²¹⁾ Scale bar = 200 um Klik hførend at se en større udgave af dette tal.

Figur 3. In vivo imaging ved hjælp oktober omkring injektionsstedet umiddelbart efter injektionen. Brug et OLT-enhed vi kan fange flere billeder omkring injektionsstedet at vurdere, såvel effektiviteten af injektion og omfanget af udstationering. I dette eksempel minimal ubundethed (ses som hævelse især i billeder 3-5) overholdes. Scale barer = 200 um

Discussion

I denne artikel beskriver vi en forholdsvis enkel fremgangsmåde til udførelse af subretinal injektioner af RPE-celler i suspension i rotter og mus. Protokollen er let at lære og mere erfaring med teknikken vil oversætte færre traumer (figur 3; dette repræsenterer en af de bedre injektioner), især hvis en mikromanipulator anvendes (figur 1A). Enhver traumer kan overvåges in vivo med en cSLO og oktober (figur 2), hvis de er tilgængelige. Hvis der ønskes højere opløsning og mindre støjende billeder, state of the art billeddiagnostiske platforme er til rådighed, sammen med fremragende protokoller til udførelse af oktober i murine sygdomsmodeller ^39-41.

De mest almindelige komplikationer forbundet med denne teknik skyldes forkert positionering af dyret under operationen, inducere overdreven nethindeløsning, forårsager choroidale hemorrhages, og tilbagesvaling af RPE-celler fra nålen. Hvis placeretuhensigtsmæssigt, vil det være vanskeligt at skabe det første hul, og endnu sværere at finde det efter. Forskydning af øjet kunne overskygge det hul, hvilket gør gennemtrængning med stump nål umuligt. Selv om det er muligt at foretage et andet hul med en skarp nål, skaber mere traumer. Udtalte retinaløsninger kan medføre alvorlige synstab. Afdelinger fremkalde karakteristiske morfologiske ændringer i retinale neuroner og glia; disse kombinationer af reaktiv gliose og retinal remodeling kan fremme fotoreceptor celledød ^42. Endelig, hvis alt for meget tryk påføres med sprøjten med stump spids, koroidal hemorrhaging kan fremkaldes. Hvis alt for meget tryk påføres, kan observeres gennembrud af RPE og Bruchs membran kan forekomme, og nogle iPS-RPE i årehinden, selvom disse tilfælde er sjældne. Tilbagesvaling af injicerede RPE celler i nethinden og glaslegemet forekommer oftere og er vanskelig at undgå. Dette kan minimeres ved at trække Syringe med den stumpe kanyle meget langsomt efter injektionen (i den forbindelse mikromanipulator er utroligt nyttigt).

Andre teknikker, der anvendes inden for området, er mere sofistikeret, men er også betydeligt mere udfordrende (for en gennemgang se Ramsden et al. ^30). Det er muligt at injicere celler i suspension i subretinarummet ved at indsætte en skarp nål i den modsatte retning gennem sclera, choroidea og RPE. Denne teknik kræver betydeligt mere praksis og ekspertise; indtil styr, vil de fleste af RPE-celler injiceres i årehinden eller retina og aldrig integreret i subretinarummet. (Også på grund af begrænset adgang i øjet, er denne fremgangsmåde uegnet til anvendelse i humane patienter.) Det er også muligt at implantere intakte monolag af polariserede RPE ^43. Dette gøres enten ved udrulning et ark RPE cellerne under nethinden gennem en spalte, eller ved at dyrke cellerne på et kunstigt porøst substrat og inserting både cellerne og proteser i det subretinale rum. Fordelene ved disse teknikker er indlysende, RPE celler ikke behøver at "repolarize" efter implantation, og den potentielle dannelse af pigmenterede områder af RPE celler, der slipper ud i nethinden i vid udstrækning kan undgås ^16,44. Men disse kirurgiske teknikker er i sagens natur endnu mere kompliceret. Endvidere, i mennesker, vil RPE og protese skal indsættes under den gule plet gennem en spalte, der skal ætses med en laser. Dette vil resultere i retinal degeneration omkring ætses region.

Fordelen ved at anvende protokollen skitseret her er, at den kan udføres pålidelighed, er det letteste at lære, og kan anvendes til at levere andre forbindelser eller celler udover RPE. Endvidere, med mindre modifikationer (ved hjælp af skarpe kanyle snarere end stump nål til at levere celler), den samme teknik kan anvendes til at levere celler eller lægemidler intravitrealt. Vichieve konsistente resultater med denne teknik, og har lært at minimere traume forbundet med teknikken gennem erfaring og gennem in vivo imaging overvågning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1