Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

Abstract

Die Umwandlung von Licht in elektrische Impulse erfolgt in der äußeren Netzhaut und wird weitgehend von Stäbchen und Zapfen-Photorezeptoren und retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellen durchgeführt. RPE liefern wichtige Unterstützung für Photorezeptoren und den Tod oder Dysfunktion der RPE-Zellen ist charakteristisch für die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), die häufigste Ursache für dauerhafte Sehverlust bei Menschen im Alter von 55 und älter. Während keine Heilung für AMD identifiziert worden ist, kann die Implantation von gesunden RPE in erkrankten Augen sich als eine wirksame Behandlung sein, und eine große Zahl von RPE-Zellen können leicht aus pluripotenten Stammzellen erzeugt werden. Einige interessante Fragen hinsichtlich der Sicherheit und Wirksamkeit von RPE-Zell Lieferung noch in Tiermodellen untersucht werden, und gut anerkannten Protokollen zur RPE injizieren entwickelt. Die hier beschriebene Technik ist von mehreren Gruppen in verschiedenen Studien verwendet und beinhaltet zunächst ein Loch in das Auge mit einer spitzen Nadel schaffen. Dann wird eine Spritze mit einer Blunt Nadel mit Zellen beladen ist, durch das Loch eingeführt und geleitet durch den Glas bis es leicht berührt RPE. Mit dieser Einspritzverfahren, das relativ einfach und erfordert minimale Ausrüstung wir konsistente und effiziente Integration von Stammzellen abgeleiteten RPE Zellen zu erreichen zwischen dem Host RPE, die signifikante Menge an Photorezeptordegeneration verhindert in Tiermodellen. Obwohl nicht Teil der tatsächlichen Protokoll beschreiben wir auch, wie das Ausmaß des Traumas durch die Injektion und zum Überprüfen, ob die Zellen in den subretinalen Raum unter Verwendung von in vivo-Bildgebungsverfahren injiziert induziert wird. Schließlich wird die Verwendung dieses Protokoll nicht RPE Zellen begrenzt; es kann verwendet werden, um jede Verbindung oder Zelle in den subretinalen Raum zu injizieren.

Protocol

HINWEIS: Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien des Scripps Research Institute gegründet behandelt.

1. Vorbereitung der Materialien für die Injektion (~ 20 min)

1. Vorwärmen Zelldissoziationslösung (vorzugsweise eine, die durch den Verdünnungs inaktiviert wird, nicht mit Serum), sterile PBS und Kulturmedien (Tabelle 1).
2. Sterilisieren Sie die Spritze mit einer stumpfen Nadel durch Demontage und es Kochen Sie die Teile in Wasser 15 min.

2. Herstellung der RPE-Zellen für die Injektion (~ 30 min bis 1 h)

1. Lösen Sie die RPE-Zellen mit vorgewärmten Zelldissoziationslösung für 5-8 Minuten bei 37 ° C.
2. Kratzen Sie die Zellen vorsichtig zu einem noch angebracht sind freizugeben.
3. Verdünnen Sie die Zellen mit einem großen Volumen von Kulturmedien (füllen einen 15-ml-Tube), um die Dissoziationslösung inaktivieren und gezählt.
4. Zentrifuge bei 800 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren.
5. Die Zellen auf 200.000 Zellen / ul (100.000 Zellen in einem 0,5 ul Volumen zu liefern) in sterile vorgewärmten PBS und übertragen diese in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Fügen Sie optional einen Live Cell transienten Fluoreszenzmarker und bei 37 ° C für 30-45 min.
7. Legen Sie die Spritze mit einer stumpfen Nadel mit 0,5 ul der Zellen. Injizieren die Zellen so schnell wie möglich.

3. Unternetzhaut Injection (~ 5 min pro Injektion)

HINWEIS: Wenn möglich, zu lernen, die Technik mit Erwachsenen Albinoratten, da die Limbus Gefäße sind viel einfacher zu visualisieren. Injizieren Fast Green-Lösung, wenn das Lernen (bevor Sie versuchen, Zellen injizieren), um die Visualisierung der Injektionsstelle leichter zu erleichtern.

1. Anesthetize das Nagetier. Verwenden intraperitoneale Injektionen von 100 mg / ml Ketamin und 10 mg / ml Xylazin (20 & mgr; l / 10 g Körper wacht) über Isofluoran Inhalation, da es schwierig ist, das Nagetier manövrieren und zu injizieren, in dem Auge mit der Schnauze in dem Inhalator.
   1. Stellen Sie sicher, dass das Tier tief durch Kneifen einer seiner Pfoten betäubt. Wenn er zuckt zusammen, einige Minuten warten und erneut versuchen, bevor Sie den subretinalen Injektion.
2. Positionieren Sie das Nagetier auf die Seite, so dass das Auge, das injiziert wird wird mit Blick auf die Decke.
3. Unter einem Binokular sanft dehnen die Haut, so dass die Augen öffnet leicht nach oben aus dem Sockel (temporäre Exophthalmus) und leichter zugänglich, indem Sie den Kopf mit zwei Fingern direkt über dem Ohr und durch seinen Kiefer und sanft dehnen die Haut parallel zu den Augenlidern so dass das Auge springt leicht nach oben aus dem Sockel (siehe Abbildung 1C). Fassen Sie nicht die Nager zu nahe an der Kehle.
4. Mit einem 30 gis Einweg vorsterilisiert Nadel, machen Sie ein Loch direkt unter dem Limbus (wenn die Gefäße betroffen sind, werden Blutungen bE signifikant und es schwierig sein, das Loch später zu finden) und in einem Winkel zu vermeiden, berühren Sie das Objektiv mit der Nadel (1D). Berühren Sie das Objektiv mit der scharfen (oder stumpf) Nadel oder unmittelbaren Kataraktbildung auftreten.
   HINWEIS: Die Injektionen besser mit zwei Personen. Auf diese Weise kann eine Person die Spritze mit der stumpfen Nadel auf die Person, die die Injektion, nachdem sie das erste Loch mit der scharfen Nadel Einweg erstellt, um den Fokus auf das zu halten, wo das Loch spielte.
5. Fahren Sie den Einweg-spitzen Nadel aus dem Auge und gleichzeitig die Haftung auf den Kopf. Denken Sie daran, genau dort, wo das Loch ist.
6. Nachdem sowohl die Montage des vorinstallierten Spritze mit einer stumpfen Nadel auf einem Mikromanipulator oder halten Sie es von Hand, legen Sie die Spitze der Spritze mit der stumpfen Nadel durch das Loch, kümmert sich wieder das Objektiv nicht zu berühren und drücken Sie sie vorsichtig durch das Auge sehr vorsichtig, bis das Gefühl Widerstand (1D).
7. Keeping alle Bewegungen auf ein Minimum, sorgfältig zu injizieren die RPE-Zellen langsam in den subretinalen Raum.
   HINWEIS: RPE / Netzhautablösung induziert wird; dies unvermeidbar ist. Jedoch eine sauberere Injektion minimiert die Ablösung und die Chancen der Wiederbefestigung (1E) stark verbessert. Alle übertriebenen Bewegungen kann die Nadel wieder in die Netzhaut zu bewegen und Seitwärtsbewegungen kann die Netzhaut schädigen. Die Verwendung einer Einspritzpumpe ist optional, aber ermöglicht eine sehr präzise Lieferung.
8. Ziehen Sie die Spritze langsam. Bewerben Auge Feuchtigkeitstropfen auf das Auge hydratisiert.
9. Weiter, um das Tier zu überwachen, bis sie Brustlage gewinnt. Lassen Sie das Tier unbeaufsichtigt oder in einen Käfig mit anderen Alarm Tiere, bis sie Brustlage gewinnt.

Representative Results

Wir können eine Aussetzung der RPE-Zellen schnell und konsequent in den subretinalen Raum von Nagetieren zu liefern mit dem in dieser Handschrift beschriebenen Technik. Obwohl nicht erforderlich, können Traumata stark mit dem mit einem Mikromanipulator in 1A & B gezeigten Aufbau minimiert werden. Halten Sie den Nager wie in 1C für temporäre Exophthalmus gezeigt. Die Schritte sind die gleichen, wenn der Mikromanipulator oder von Hand durchgeführt wird; diese werden in der Karikatur in 1D dargestellt. Wenn sich sauber von der markierten RPE-Zellen durchgeführt Fluoreszenz kann unter Verwendung eines cSLO und die induzierte Netzhautablösung kann mit einem OCT-System (Figur 2) ersichtlich, detektiert werden. In Figur 3 a cSLO wurde verwendet, um mehrere Bilder auf der gesamten Injektionsstelle zu erfassen (die Bilder aus Abbildung 2 und 3 wurden sofort erfasst folgenden subretinalen Injektion). Beachten Sie die Distanz, most tiefe (aber nicht schwer) in den Mittelpunkt Bilder (3-5).

Abbildung 1. Die subretinalen Injektion Plattform und ein Cartoon Darstellung der Injektionstechnik. (A) Es wurden Löcher in ein Metallblech, das Binokular befestigen gebohrt. (B) für einen Mikromanipulator auf einer magnetischen Ständer kann in die und aus der Position während der Injektion bewegt werden. (C) Halten des Nagers wie für temporäre proptosis gezeigt. ( D) Darstellung der wichtigsten Strukturen des Auges (D;. Schritt 3.4) wird ein Loch in die Augen mit einer scharfen Nadel Einweg knapp unterhalb des Limbus und Linse (D;. Schritt 3.6) eine stumpfe Nadel wird in das Loch eingeführt und durch die diametral entgegengesetzte Netzhaut bis sanft berühren die RPE (D; Schritt 3.8). Injektion der Zellen induziert eine vorübergehende retinal Ablösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2. Fundus Bilder direkt nach subretinaler Injektion entnommen. (A) Die grüne Fluoreszenz auf der rechten Seite (Überlagerung der IR und FAF-Aufnahmen) beobachtet wird aus iPS-RPE-Zellen mit einem fluoreszierenden Marker markiert transiente emittiert. (B) Netzhautablösung des neuronalen Netzhaut und RPE in der Nähe der Injektion beobachtet Website nach subretinaler Injektion (mit Pfeil markiert). Asterisk in (A) bezeichnet die Sehnerven. (Dieser Wert wird im Originalformat von Krohne et al veröffentlicht. ^21), Maßstabsbalken = 200 & mgr; Bitte klicken here um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. In vivo-Bildgebung mit Oktober um die Injektionsstelle direkt nach dem Einspritzen. Unter Verwendung eines OCT-Vorrichtung kann man mehrere Bilder an der Injektionsstelle zu erfassen, um sowohl die Wirksamkeit der Injektion und das Ausmaß der Ablösung zu bestimmen. In diesem Beispiel minimalen Ablösung beobachtet wird (als Quell insbesondere Bilder 3-5 zu sehen ist). Maßstabsbalken = 200 & mgr;

Discussion

In diesem Artikel beschreiben wir ein relativ einfaches Verfahren zum Durchführen subretinalen Injektion von RPE-Zellen in Suspension in Ratten und Mäusen. Das Protokoll ist einfach zu erlernen und mehr Erfahrung mit der Technik zu weniger Verletzungen zu übersetzen (3; dies stellt eine der besseren Injektionen), insbesondere wenn ein Mikromanipulator verwendet wird (1A). Jede Trauma kann in vivo mit einem cSLO und OCT-System (2), wenn vorhanden überwacht werden. Wenn eine höhere Auflösung und weniger laut Bilder gewünscht werden, modernste bildgebende Plattformen zur Verfügung stehen, zusammen mit ausgezeichneten Protokolle für die Durchführung Oktober in murinen Krankheitsmodellen ^39-41.

Die häufigsten Komplikationen bei dieser Technik entstehen durch falsche Positionierung des Tieres während der Operation, Induktion übermäßiger Netzhautablösung, was Aderhautblutungen und Rückfluss von RPE-Zellen aus der Nadel. Wenn positioniertunangemessen, wird es schwierig sein, die erste Öffnung zu schaffen, und noch schwieriger, sie nach finden. Verschiebung des Auges könnte das Loch zu verschleiern, so dass das Eindringen der stumpfen Nadel unmöglich. Während es möglich ist, ein weiteres Loch mit einer spitzen Nadel zu machen, schafft dies mehr Trauma. Ausgeprägte Netzhautablösung kann zu schweren Sehverlust führen. Detachments induzieren charakteristischen morphologischen Veränderungen der Netzhaut Neuronen und Glia; Diese Kombinationen von reaktiven Gliose und Netzhaut Umbau kann Photorezeptor Zelltod ⁴² zu fördern. Schließlich, wenn zu viel Druck mit der Spritze mit stumpfer Spitze angelegt wird, kann choroidalen hemorrhaging induziert werden. Wenn zu viel Druck ausgeübt wird, kann Durchbruch der RPE und Bruch-Membran auftreten und einige iPS-RPE in der Aderhaut zu beobachten, obwohl diese Fälle sind selten. Rückfluß des eingespritzten RPE-Zellen in der Netzhaut und des Glaskörpers tritt häufiger auf und ist schwer zu vermeiden. Dies kann durch Zurückziehen des syrin minimiert werdenge mit der stumpfen Nadel sehr langsam nach der Injektion (in diesem Zusammenhang der Mikromanipulator ist unglaublich nützlich).

Andere Techniken, die in dem Gebiet verwendet werden, sind weiter entwickelt, aber auch erheblich schwieriger (für einen Überblick siehe Ramsden et al. ^30). Es ist möglich, Zellen in Suspension durch Einführen einer Nadel in die entgegengesetzte Richtung durch die Lederhaut, Aderhaut und RPE in den subretinalen Raum zu injizieren. Diese Technik erfordert deutlich mehr Praxis und Know-how; bis beherrschen, werden die meisten der RPE-Zellen in die Aderhaut und Netzhaut injiziert werden und zu integrieren nie in den subretinalen Raum. (Auch wegen der beschränkten Zugang des Auges, ist dieser Ansatz zur Verwendung bei menschlichen Patienten geeignet sind.) Es ist auch möglich, intakte Monoschichten von polarisierten RPE ⁴³ zu implantieren. Dies wird entweder durch Abrollen eines Blatt RPE-Zellen unterhalb der Netzhaut durch einen Schlitz oder durch Züchten der Zellen auf einer künstlichen porösen Substrat und insertin getang sowohl die Zellen als prothetische in den subretinalen Raum. Die Vorteile dieser Technik liegen auf der Hand, da die RPE-Zellen brauchen nicht zu "repolarisieren" bei der Implantation und die potentielle Bildung von pigmentierten Bereiche der RPE-Zellen, die in die Netzhaut zu entgehen weitgehend vermieden ^16,44 werden. Jedoch sind diese chirurgischen Techniken inhärent noch komplizierter. Weiterhin beim Menschen, wird die RPE und prothetischen müssen unter der Makula durch einen Schlitz, der mit einem Laser geätzt werden müssen, eingesetzt werden. Dies wird bei Netzhautdegeneration um die kauterisiert Region führen.

Der Vorteil der Verwendung des Protokolls hier skizziert ist, dass es durchgeführt werden kann Zuverlässigkeit, ist am einfachsten zu lernen, und kann verwendet werden, um andere Verbindungen oder Zellen neben RPE zu liefern. Weiterhin mit leichten Modifikationen (mit der spitzen Nadel anstatt der stumpfen Nadel, um die Zellen zu liefern), kann das gleiche Verfahren verwendet, um Zellen oder Drogen intravitreal zu liefern. Wir einchieve konsistente Ergebnisse mit dieser Technik und haben gelernt, das Trauma, das mit der Technik durch Erfahrung und durch in vivo-Bildgebung Überwachung zu minimieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1