Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

Abstract

La conversión de la luz en impulsos eléctricos se produce en la retina externa y se lleva a cabo en gran medida por conos y bastones fotorreceptores y células del epitelio pigmentario de la retina (RPE). RPE proporcionar apoyo crítico a los fotorreceptores y la muerte o la disfunción de las células del EPR es característico de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de la pérdida permanente de la visión en personas mayores de 55 años. Si bien no hay cura para la DMAE ha sido identificado, la implantación de RPE saludable en ojos enfermos puede llegar a ser un tratamiento efectivo, y un gran número de células del EPR puede generarse fácilmente a partir de células madre pluripotentes. Varias preguntas interesantes sobre la seguridad y eficacia de la entrega de células RPE todavía pueden ser examinadas en modelos animales, y los protocolos bien aceptados utilizados para inyectar RPE se han desarrollado. La técnica descrita aquí ha sido utilizado por varios grupos en diversos estudios y consiste en crear primero un agujero en el ojo con una aguja afilada. A continuación, una jeringa con una blunt aguja cargada con células se inserta a través del agujero y pasa a través del humor vítreo hasta que toque suavemente el RPE. El uso de este método de inyección, que es relativamente simple y requiere un mínimo de equipo, logramos la integración coherente y eficaz de las células RPE derivadas de células madre en entre el RPE host que impide cantidad significativa de degeneración de los fotorreceptores en modelos animales. Aunque no es parte del protocolo real, también se describe cómo determinar la extensión de la trauma inducido por la inyección, y cómo verificar que las células fueron inyectadas en el espacio subretiniano en el uso de técnicas de imagen in vivo. Finalmente, el uso de este protocolo no se limita a las células del RPE; puede utilizarse para inyectar cualquier compuesto o de células en el espacio subretiniano.

Protocol

NOTA: Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las normas éticas establecidas por el Instituto de Investigación Scripps.

1. Preparación de los materiales para la inyección (~ 20 min)

1. Solución de disociación celular Pre-caliente (preferiblemente uno que se inactiva a través de la dilución, no con suero), PBS estéril y medios de cultivo (Tabla 1).
2. Esterilizar la jeringa con una aguja de punta roma por el desmontaje y hervir las partes en agua durante 15 min.

2. Preparación de las células del EPR para inyección (~ 30 min a 1 hr)

1. Separe las células del EPR utilizando solución de disociación de células pre-calentado por 5-8 minutos a 37 ° C.
2. Raspe las células suavemente para liberar cualquier que todavía esté conectado.
3. Diluir las células con un gran volumen de medios de cultivo (llenar un tubo de 15 ml) para inactivar la solución de disociación y contarlos.
4. Centrifugar a 800 xg durante 5 min para sedimentar las células.
5. Resuspender las células a 200.000 células / l (para entregar 100.000 células en un volumen de 0,5 l) en PBS precalentado estéril y transferirlos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
6. Opcionalmente, añada un marcador fluorescente transitoria de células vivas y se incuba a 37 ° C durante 30-45 min.
7. Cargar la jeringa con una aguja roma con 0,5 l de células. Inyectar las células tan pronto como sea posible.

3.-Sub retina Inyección (~ 5 min por inyección)

NOTA: Si es posible, aprender la técnica con ratas albinas adultas desde los vasos del limbo son mucho más fáciles de visualizar. Inyectar solución verde cuando el aprendizaje rápido (antes de tratar de inyectar las células) para facilitar más fácilmente la visualización del sitio de la inyección.

1. Anestesiar el roedor. Utilice inyecciones intraperitoneales de 100 mg / ml de ketamina y 10 mg / ml de xilazina (20 l / 10 g cuerpo wocho) sobre la inhalación de isofluorano ya que es difícil de maniobrar el roedor y se inyecta en el ojo con el hocico en el inhalador.
   1. Asegúrese de que el animal se anestesió profundamente pellizcando una de sus patas. Si se estremece, esperar varios minutos y vuelva a intentarlo antes de comenzar la inyección subretiniana.
2. Coloque el roedor a su lado para que el ojo que se inyecta se enfrenta el techo.
3. Bajo un microscopio de disección estirar suavemente la piel para que el ojo aparece ligeramente arriba de la toma (proptosis temporal) y se vuelve más accesible mediante la celebración de su cabeza con dos dedos justo por encima de la oreja y por su mandíbula y estirar suavemente la piel en paralelo a los párpados por lo que el ojo aparece ligeramente arriba de la toma (Ver Figura 1 C). No agarre el roedor demasiado cerca de la garganta.
4. Con una aguja previamente esterilizada desechable afilada 30 G, hacer un agujero justo debajo del limbo (si los vasos son golpeados, sangrado bE significativa y ser difícil de encontrar el agujero más adelante) y en un ángulo para evitar tocar la lente con la aguja (Figura 1D). Evite tocar la lente con la aguja (o roma) o la formación de cataratas inmediata va a producir.
   NOTA: Las inyecciones funcionan mejor con dos personas. De esta manera una persona puede pasar a la jeringa con la aguja roma a la persona que realiza la inyección después de haber creado el primer agujero con la aguja desechable afilado para mantener la atención en el dónde está el agujero.
5. Retraer la aguja desechable desde el ojo mientras se mantiene el agarre en la cabeza. Recuerde exactamente dónde está el agujero.
6. Después de cualquiera de montar la jeringa precargada con una aguja roma en un micromanipulador o sosteniéndolo con la mano, inserte la punta de la jeringa con la aguja roma a través del agujero, cuidando de nuevo de no tocar la lente, y empuje suavemente a través del ojo muy suavemente hasta sentir resistencia (Figura 1D).
7. Keeping todos los movimientos a un mínimo, inyectar cuidadosamente las células del EPR lentamente en el espacio subretiniano.
   NOTA: desprendimiento del EPR / retina se inducirá; esto es inevitable. Sin embargo, una inyección limpio minimiza el desprendimiento y mejora en gran medida las posibilidades de una reparación (Figura 1E). Cualquier movimientos exagerados pueden mover la aguja de nuevo en la retina, y movimientos laterales pueden dañar la retina. El uso de una bomba de inyección es opcional, pero permite una entrega muy precisa.
8. Retraer la jeringa lentamente. Aplicar hidratante gotas para los ojos para mantener el ojo hidratado.
9. Continúe controlando el animal hasta que recupera decúbito esternal. No deje de animales sin vigilancia o volver a una jaula con otros animales de alerta hasta que recupera decúbito esternal.

Representative Results

Podemos entregar una suspensión de células del EPR en el espacio subretiniano de roedores rápida y consistente con la técnica descrita en este manuscrito. Aunque no es necesario, traumas pueden minimizar en gran medida el uso de la configuración se muestra con un micromanipulador en la figura 1A & B. Mantenga el roedor como se muestra en la Figura 1C para proptosis temporal. Los pasos son los mismos si se realiza con el micromanipulador oa mano; éstas se representan en los dibujos animados en la Figura 1D. Cuando se realiza limpiamente la fluorescencia de las células del EPR marcado puede ser detectado mediante un cSLO y el desprendimiento de retina inducida puede ser visto utilizando un sistema OCT (Figura 2). En la figura 3 un cSLO se utilizó para capturar múltiples imágenes alrededor de todo el sitio de la inyección (las imágenes de la Figura 2 y la Figura 3 fueron capturados inmediatamente después de la inyección subretiniana). Tenga en cuenta el desapego que es most profunda (pero no grave) en las imágenes centrales (3-5).

Figura 1. La plataforma de inyección subretiniana y una representación de dibujos animados de la técnica de inyección. Los agujeros (A) fueron perforados en una placa de metal para fijar el microscopio de disección. (B) un micromanipulador en un soporte magnético se puede mover dentro y fuera de su posición durante las inyecciones. (C) Mantenga el roedor como se muestra para proptosis temporal. ( D) Representación de las estructuras clave del ojo (D;. Paso 3.4) Se hace un orificio en el ojo con una aguja desechable agudo justo debajo de la limbo y la lente (D;. Paso 3.6) Una aguja de punta roma se inserta en el agujero y a través de la retina diametralmente opuesta hasta tocar suavemente el RPE (D; Paso 3.8). La inyección de las células induce un ret temporalinal desapego. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. imágenes de fondo de ojo toman directamente después de la inyección subretiniana. (A) La fluorescencia verde observada en el panel de la derecha (superposición de las imágenes IR y FAF) se emite desde iPS-RPE células marcadas con un marcador fluorescente transitoria. (B) El desprendimiento de retina de la retina neural y RPE se observa cerca de la inyección El sitio después de la inyección subretiniana (marcada con flecha). Asterisk en (A) etiqueta el nervio óptico. (Esta cifra se vuelve a publicar en su formato original de Krohne et al. ²¹⁾ Barra de escala = 200 micras Haga clic here para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 3. En imágenes in vivo en OCT alrededor del sitio de la inyección inmediatamente después de la inyección. El uso de un dispositivo de OCT podemos capturar múltiples imágenes alrededor del sitio de la inyección para determinar tanto la eficacia de la inyección y la magnitud del desprendimiento. En este ejemplo desprendimiento mínima (visto como hinchazón en particular en las imágenes 3-5) se observa. Las barras de escala = 200 micras

Discussion

En este artículo se describe un método relativamente simple para realizar inyecciones subretinianas de células del EPR en suspensión en ratas y ratones. El protocolo es fácil de aprender y más experiencia con la técnica se traducirá en un menor número de traumas (Figura 3, lo que representa uno de los mejores inyecciones), especialmente si se utiliza un micromanipulador (Figura 1A). Cualquier trauma se puede monitorizar in vivo con un sistema de cSLO y OCT (Figura 2) si está disponible. Si se desea mayor resolución y menos ruidosos imágenes, estado de las plataformas de imágenes de arte están disponibles, junto con excelentes protocolos para la realización de octubre en modelos murinos de enfermedad ^39-41.

Las complicaciones más comunes asociados con esta técnica se deben a la colocación incorrecta del animal durante la cirugía, lo que induce el desprendimiento de retina excesiva, causando hemorragias coroideas, y el reflujo de las células del EPR de la aguja. Si se colocainapropiadamente, será difícil crear el primer hoyo, y aún más difícil de encontrar después. Cambio de la vista podía ocultar el agujero, por lo que la penetración de la aguja roma imposible. Si bien es posible hacer otro agujero con una aguja, esto crea más trauma. Desprendimientos de retina pronunciadas pueden resultar en la pérdida visual severa. Destacamentos inducen cambios morfológicos característicos en las neuronas de la retina y células gliales; estas combinaciones de gliosis reactiva y la remodelación de la retina pueden promover la muerte de las células fotorreceptoras ^42. Finalmente, si se aplica demasiada presión con la jeringa con la punta roma, hemorragia coroidea puede ser inducida. Si se aplica demasiada presión, avance de la RPE y la membrana de Bruch puede ocurrir y algunos iPS-RPE se puede observar en la coroides, aunque estos casos son raros. Reflujo de células del EPR inyecta en la retina y el vítreo se produce con más frecuencia, y es difícil de evitar. Esto puede ser minimizado mediante la retracción de la Syringe con la aguja roma muy lentamente después de la inyección (en este sentido, el micromanipulador es increíblemente útil).

Otras técnicas utilizadas en el campo son más sofisticados, pero también son significativamente más difícil (para revisión ver Ramsden et al. ^30). Es posible inyectar las células en suspensión en el espacio subretiniano mediante la inserción de una aguja en la dirección opuesta a través de la esclerótica, la coroides, y RPE. Esta técnica requiere mucho más práctica y experiencia; hasta dominado, la mayoría de las células del RPE se inyectará en la coroides o la retina y nunca se integran en el espacio subretiniano. (También, debido al acceso limitado del ojo, este enfoque no es adecuado para su uso en pacientes humanos.) También es posible implantar monocapas intactas de RPE polarizado ^43. Esto se hace ya sea por desenrollar una lámina de células de RPE debajo de la retina a través de una hendidura, o haciendo crecer las células sobre un sustrato artificial poroso y inserting tanto las células y prótesis en el espacio subretiniano. Las ventajas de estas técnicas son evidentes como las células del EPR no necesitan "repolarizar" tras la implantación, y la potencial formación de esferas pigmentadas de las células RPE que se escapan en la retina se pueden evitar en gran medida ^16,44. Sin embargo, estas técnicas quirúrgicas son inherentemente aún más complicado. Además, en los seres humanos, tendrán que ser insertada debajo de la mácula través de una rendija que debe ser cauterizado con un láser la RPE y protésica. Esto dará lugar a la degeneración de la retina alrededor de la región cauterizado.

La ventaja de usar el protocolo descrito aquí es que se puede realizar la fiabilidad, es la más fácil de aprender, y se puede utilizar para administrar otros compuestos o células además de RPE. Además, con ligeras modificaciones (utilizando la aguja afilada en lugar de la aguja de punta roma para entregar las células), esta misma técnica se puede utilizar para administrar células o fármacos por vía intravítrea. Tenemos unChieve resultados consistentes con esta técnica, y han aprendido a minimizar el trauma asociado con la técnica mediante la experiencia y a través de la vigilancia de formación de imágenes en vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1