Abstract
여기서 우리는 상업적으로 접근하고 저렴한 부품을 이용하여 단일 사용 "injectrode"의 건설 방법을 설명한다. 프로빙 시스템은 영향받은 뉴런 집단에서 전기 생리 신호를 기록하는 동안 약물의 주입을 허용하는 개발되었다. 이 방법은 상용 솔루션을 간단하고 경제적 인 대안을 제공합니다. 유리 피펫은 피하 주사 바늘과 실버 필라멘트와 결합하여 수정되었습니다. injectrode은 약물 전달을위한 상업 마이크로 실린 펌프에 연결되어 있습니다. 이것은 약물 전달의 사이트에서 유래 다세대 세포 외 신호를 통해 실시간 약력학 피드백을 제공하는 기술을 초래한다. 개념의 증거로서, 우리는 병용 injectrode을 통해 약물의 배달, 쥐에서 빛의 섬광에 의해 유발 우수한 둔덕에서 신경 세포의 활동을 기록했다. injectrode 기록 용량 INJ의 기능적 특성을 허용약물 전달의 현지화를 정확하게 제어 선호 ection 사이트. injectrode에로드 된 화학 물질의 선택은 해부학 실험 마커를 추적 포함, 광대로이 방법의 응용 프로그램은 또한, 지금까지 여기에 입증되는 것 이상으로 확장합니다.
Introduction
피질 영역과 서브 피질 핵의 불 활성화는 다양한 뇌 구조 2-4 사이의 기능적 관계의 연구에서 중요하다. 최근 문학 뇌 구조 2,5의 역할을 연구하는 기능 상실 화학 물질 또는 극저온 기술을 채용하고있다. 주변 조직에 -6,7- 담보 손상을 최소화하면서 약리학 microinjections에 관련하여, 약물의 작은 볼륨 조절 된 속도로 뇌 영역으로 투여 될 수있다. 이 기술은 신경 세포 활성도에 대한 다른 약물 표적의 효과를 연구하기 위해 특정한 효능 제, 역 효능 제 또는 길항제를 전달하는데 사용될 수있다. 이러한 효과는 또한 다른 연구자 피질과 피질 하 구조 사이의 관계를 연구 할 수 있도록 먼 위치에서 신경 반응의 변화를 측정함으로써 조사 될 수있다.
여기서는 보 수있는 장치의 조립, injectrode을 보여전기 생리 신호를 기록 및 목표 위치에서의 약물 전달을 소량 번째. 우리 래트에서 우수한 둔덕, GABA, 신경 세포 활성도의 일반적인 억제제를 주입하여이 시스템의 능력을 입증한다. 이 지역은 우리가 injectrode 현지화를 확인하기 위해 시각적으로 유발 멀티 유닛 활동을 사용할 수 시각적 자극에 민감하다. 불 활성화의 가역성은 GABA 분사 종료 후 정상적인 신경 활성의 회복에 의해 평가 하였다.
주사 부위에서 멀티 유닛 활동을 모니터링 할 수있는 능력은 바람직한 약물 동태 학적 반응을 달성하는데 필요한 사출 속도와 볼륨의 미세 조정을 허용한다. 최소 유효 부피가 주입되기 때문에, 따라서,이 기술의 장점은, microperfusion으로 인한 조직 손상을 제한하는 전위이다. 제안 된 프로토콜은 일회용 하드웨어 necessar를 생성하기위한 비용 효율적인 방법을 제공한다약물 전달과 지역의 연결 활동 기록이 요구되는 수행 실험 Y.
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Protocol
참고 : 모든 절차는 동물의 보호와 몬트리올 대학교의 윤리 검토위원회의 캐나다 협의회의 지침에 따라 수행되었다.
녹화 주입 피펫 1. 총회
- 피펫 풀러를 사용하여 약 7cm 긴 유리 모세관 (1mm 외경)을 당깁니다.
- 모세관의 끝을 휴식과 가벼운 현미경 조리개를 확인합니다. 내부 직경이 40 μm의 30 μm의 사이에 있는지 확인합니다.
- 유리 피펫의 비 테이퍼 끝에서 돌출 약 1cm와 유리 모세관에 7cm 길이 실버 와이어를 삽입합니다.
- 유리 모세관에 직교 초과 필라멘트를 구부리고.
- 30 G 피하 주사 바늘의 축에 유연한 플라스틱 접착제의 방울을 적용합니다.
- 그림 1에서 제시 한 설계도에 따라 유리 피펫에 30 G 피하 주사 바늘을 삽입
- 유리 피펫 및 피하 주사 바늘 사이의 접합에서 적절한 밀봉을 보장하기 위해 접착제의 두 번째 코팅을 추가합니다.
- 끝이 접착제의 적절한 경화를 보장하기 위해 약 12 시간 동안 위로 향과 건조 피펫을 남겨주세요. 최종 결과는 그림 2에 표시됩니다.
참고 :이 절차는 급성 실험과 피펫 팁의 살균에 수행 할 필요가 없습니다.
2. 동물 준비
- 마취 상자에 쥐를 놓습니다.
- 5 내지 10 분 동안 4 % 이소 플루 란을 이용하여 마취를 유도한다.
- 37 ° C의 체온을 유지하기 위해 가열 패드 및 직장 프로브 정위 테이블에 동물을 놓는다. 2 % 이소 플루 란 마취를 유지하기 위해 코 원뿔을 사용한다. 귀 바, 치아 홀더를 사용하여 쥐의 머리를 고정합니다.
- 아트로핀은 동공 팽창에 도움이 떨어진다 1 %를 포함 안과 연고 또는 눈 방울을 적용합니다. 건조 함을 방지하기 위해, 드롭 윤활 적용약 30 분마다이야.
- 머리를 면도 10 % 포비돈 - 요오드로 청소.
- 국소 마취를 들면, 피부를 리프팅하고 바늘의 선단부를 삽입하여 위치 2-3에서 두피 아래에 2 % 리도카인 0.5 ml를 주입.
- 발가락 핀치를 수행하고 운동의 부족을 관찰하여 마취의 적절한 수준을 확인합니다. 또한, 정상 값 (300-400 비트 / 분) 이내인지 확인 심박수를 모니터링.
- 관상 및 시상 봉합을 모두 노출 # 10 메스 블레이드와 중간을 따라 직선으로 두피를 절개.
- 수술 주걱으로 두개골을 덮고있는 조직을 옆으로 밀어 람다와 브레 그마 점을 알 수있다.
- 브레 그마 및 람다 위치가 동일 평면에 있도록 수평을 두개골.
- 참조 포인트를 설정하기 위해, 바로 위의 브레 그마로 설정하도록 장착 된 유리 튜브로 정위 장치를 사용한다. 이것은 "제로"에 대한 안테 - 후방 및 의대 될 것입니다IAL-측면 측정을 조정합니다.
- , 정위 필요한 좌표로 마운트 이동하여 관심 영역을 설정 정위 좌표를 기록하고 개두술이 수행 될 위치를 표시하는 대상 영역 주위에 사각형을 그립니다.
- 천천히 뼈 물질을 제거하기 위해 압력없이 천천히 표시된 사각형 따라 멸균 드릴 수술 드릴을 사용합니다. 이 피질에 병변이 열을 발생 원인이되므로, 같은 지역에 너무 오래 드릴하지 않도록주의하십시오.
- 개두술을 구분 뼈가 충분히 얇은 될 때,주의 깊게 피질을 노출 핀셋 두개골 부분을 제거합니다.
- 자주 조직 탈수를 방지하기 위해 인공 뇌척수액에 노출 된 피질을 관개.
주 : injectrode의 끝이 침투 할만큼 튼튼한 같이 경막 제거가 쥐에 필요하지 않습니다.
3. 채우고 주입 시스템의 설치
- 작성미네랄 오일과 흡인에 의해 5 ~ 10 μL를 마이크로 실린.
- 0.5 % 시카고 스카이 블루 (CSB) 및 300 μM의 γ - 아미노 부티르산 (GABA) 또는 0.5 % CSB 9 2 % 리도카인 용액의 용액으로 고정 유리 피펫으로 피하 주사 바늘을 입력합니다. 식염수 모든 솔루션을 희석.
- 풍부한 물질의 경우에, 주사기를 사용하여 정기적으로 채우고 기포의 형성을 피하기 위해 평소 예방 기법을 사용한다.
- 더 비싼 물질의 경우, injectrode 채우기 위해 미네랄 오일을 사용하고 화학 제는 다음 흡인에 의해 도입 될 수있다. 미네랄 오일과 물 사이의 밀도 차이가 비교적 높고,이 물질은 수용액의 주입을위한 좋은 후보이다.
주 : 염료 모두 액체 사이의 거리를 확인하기 위해 추가 될 수있다.
- 주입 피펫을 채우려면, 흡인에 의한 용액 1 ML의 주사기를 기입 한 후 천천히 솔루션을 주입주입 피펫으로.
- 깨끗한이 지역을 보라고 더욱 주사기와 천천히 용액을 주입하여 누출을 관찰하여 그림 1에 표시된 지역에서 누출 세심한주의를 기울이십시오.
- 1 ML의 주사기를 제거합니다. 이렇게되면, 진공 주입 피펫의 용액을 제거하지 않도록 플런저에 가벼운 압력을 유지해야합니다.
- 흡인에 의해 미네랄 오일과 마이크로 실린를 채우고 가득 주입 피펫에 단단히 부착, 조심스럽게 거즈와 조립 injectrode에서 초과 솔루션을 닦아.
- 끝이 유리 피펫의 끝에서 형성 작은 방울을 볼 수있을만큼 아주 작은 볼륨을 주입에 의해 차단되지 않았는지 확인합니다.
- 마이크로 시스템의 injectrode를 탑재하고 잘 고정되어 있는지 확인합니다.
- 조심스럽게 목표 좌표 injectrode 팁을 놓고 피질의 표면에 팁을 낮 춥니 다.
- 천천히 injectr을 낮출적절한 해부 좌표를 사용하여 상기 타겟 구조 정위 장치 (이 경우에는 우수한 둔덕)를 사용 ODE.
- 조직의 탈수를 방지하기 위해 따뜻한 한천에 노출 된 피질을 커버.
4. 사출 및 가역 불 활성화
- 주입을 시작하는 40 NL / 분 키를 누릅니다 실행에 400 NL (800)에 주입하는 미세 주입 펌프를 설정합니다. 그 스파이크 속도가 주입 동안 감소를 보여줍니다 있습니다.
참고 : 실험 설정에서 신경 활동은 GABA 전달의 종료 후 시간 이내에 복구. 상관 조정 기계 장치는 분사를 실시하기 위해 마이크로 인젝션 주사기에 압력을 적용하는데 사용될 수있다. - 전기 생리 데이터를 수집 한 후, 지역의 동물 윤리 커뮤니티 승인 한 방법을 사용하여 안락사.
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Representative Results
injectrode의 구조는 와이어의 절곡 부와 유리 피펫 (D)로 공급되고, 개구로부터 밖으로 돌출되어있다도 1은 와이어 (C)에 도시되어있다. 30 G 바늘 (B)는 부착 접착제와 유리 피펫의 개통에 밀봉된다. 피펫은 주입 물질로 충전 된 후, 유리 마이크로 주사기 (A)가 바늘에 부착된다. 이것은 마이크로 주사기 바늘 (E) 및 여기서 은선은 유리 피펫 (F)로부터 돌출와 연결 양호한 시일이 존재하는 것이 중요하다. 2 injectrode가 조립 완료 후의 모습의 사진을 보여준다.
멀티 유닛 시각 유발 활성은도 3에 도시 된 바와 같이 반대편 눈에 300 밀리 초 플래시 다음 우수한 둔덕 얻었다. GABA의 주입시 억제 플래시 자극에 응답하여 활성을 급상승. 시각적분사가 정지 한 후 유발 멀티 유닛 활동은 일반적으로 60 분에 45 사이에 돌아왔다.
도 4는 마이크로 인젝션 장치의 설치를 도시한다. 분사 펌프 컨트롤러는 주사에 대한 설정을 지정할 수있는 사용자 수 있습니다. 봄 전기 커넥터는 유리 피펫에서 돌출은 와이어를 연결합니다. 커넥터는 접지 전극과 기준 전극으로 머리 단계로 연결하고 앰프에 연결. 아날로그 / 디지털 (A / D) 인터페이스는 전기 생리 데이터를 수집하는 데 사용되며, 스피커가 신경 세포 활성도의 상보 오디오 모니터링에 사용된다.
그림 1. injectrode 조립체의 도식 표현 마이크로 주사기 (A)를 30 G (H)의 기록으로 구성 주입 피펫에 부착되고유리 피펫 (D) 내부 은선 (C)에 부착 ypodermic 니들 (B). 누수에 취약 할 수있다 하이라이트 영역 - 지역은 (F E)를 동그라미.
도 2 : 30 G 바늘 (B), 방수 접착제 접착제 (F)은 선 (C)과 유리 피펫 (D)를 사용하여 구성 피펫의 사진.
그림 3 : 우수한 둔덕에서 시각 유발 멀티 유닛 활동에 GABA (300 μM)의 주입의 억제 효과의 그림, 화살표는 플래시의 시작을 나타냅니다. 전기의알 신호는 30 Hz에서 3,000 사이에 밴드 패스 필터를 사용하여 여과 하였다.
그림 4 : 전체 미세 분사 시스템의 도식 표현.
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Discussion
현재 제안 된 프로토콜은 가역적 불활 방법에서 발생하는 문제점을 해결하기 위해 설계되었다. 특히,이 프로젝트는 특히 깊은 뇌 구조에서, 신경 활동을 조절 물질의 화학 microinjections에 사용되는 방법을 구체화하기위한. 이러한 유형의 설정 신흥 기술 과제는 모두 프로브는 주사 부위에서 정확한 기록을 유도하기 위해 생체 내에서 같은 제한된 공간에서 colocalized하기 위해서는 필요하다. 이 문제는 동일한 사이트에서 모두 주입하고, 기록 할 수있는 예컨대 여기에 제시된 것과 같은 장치를 사용하여 극복 될 수있다. 다른 방법은 가스 압력 펄스에 기초하여 장치의 사용을 포함한다. 이러한 툴은 수년 동안 사용되어 왔지만, 압축성 중간체의 사용은 사출 속도 및 양, 가역성을 보장하도록 제어하는 것이 중요하다 개의 파라미터에 대한 제어를 감소시킨다. 이러한 이온 삼투압 주입 같은 다른 방법들하여 점검도 가능하지만, 액체의 확산은 불 활성화 동력학의 전위 범위를 감소 루스 주사 대 다르다. 이러한 방법은 마이크로 주사 (7)에 대해 관찰 타원형 패턴에 반대되는 구면 확산 패턴을 갖는 장점이있다. 따라서, 불 활성화 방법의 선택은 타깃 영역과 실험 디자인에 따라 계획한다. 상업적 대안이 존재하더라도, 제안 프로토콜은 약학 물질 전달을 모니터링뿐만 아니라, 고도의 맞춤화를 허용하는 비용 효율적인 방법을 제공한다. 사출 장치의 공예 이러한 자유는 특정 애플리케이션 컨텍스트에 대한 실험적인 유연성 및 조정의 큰 범위 호의.
제안 된 프로토콜에 관해서, 주요 공정은 유리 피펫을 충전하는 공정이다. 압축 공기 주입의 모니터링 렌더링되므로 기포는 피해야다루기 힘든 볼륨. 수동으로 시스템의 자유로운 흐름을 확인, 피펫을 통해 액체를 밀어 때 아주 최소한의 저항도 생각해야한다. 수동 주입 액체의 부재는 시스템 또는 방해 끝의 결과로 잘못된 피펫 준비에 누수가있을 수 있습니다. 피펫의 임피던스는 또한 원하는 유형 전기 생리 학적 기록 얻기 위해서는 측정되어야 낮은 임피던스 초래할 것이다 큰 팁 크기로서, (LFP를 전위, 다중 유닛 활동 등을 유발).
주입이 완료되면, 400-800 300 μM GABA 용액 NL 또는 2 % 리도카인 용액의 부피는 활성을 급상승 폐지 충분하다. 공간 및 시간 확산 분사 개념을 가지고, 한천은 신경 조직을 시뮬레이션하는데 사용될 수있다. 분사의 확산은 용이 CSB 용액으로 관찰 할 수있다. 시뮬레이션 한 결과, O를 사용하여 조직 학적으로 확산 분사를 특성화하는 것이 필수적이다방사성 표지 된 약물을 사용하여자가 방사선 또는 신경 활동 (1)의 활성화 또는 불 활성화를 측정하는 글루코스자가 방사선 간접 프록시로서 대사 접근법을 사용하여 이러한 CSB 같은 F 염료.
그것은 가능성이 전체 가역성이 얻기 어려운 만드는 병변을 초래할 것이다 빠른 주사 (≥100 NL / 분)주의하는 것도 중요하다. 제안 된 프로토콜의 주요한 장점은 신경 활성 세트 레벨 분사량을 피드백 제어 할 소프트웨어와 함께 분사 시스템 통합의 가능성이다. 이러한 구현은 연구원이 매개 변수를 비활성화 (또는 활성화)보다는 고려 응용 프로그램에 대한 약물의 정확한 양을 제공하는 동시에 사출 속도 나 볼륨 등의 기술적 인 매개 변수에 초점을 맞출 수있다. 이것은, 약물 전달의 시간에 민감한 제어를 허용 필요한 약물 부피를 최적화함으로써 프로브 변위를 최소화하고 모든 재현성을 선호 할데이터의 흐름 직접 짝을 비교.
이 기술은 전기 생리 신호를 물질 전달 및 기록하기위한 시스템을 결합한다. 우리는 (11)를 기능적으로 자극 플래시를 사용하는 다중 유닛 활동 열차를 유도함으로써 우수한 둔덕를 찾기 위해 우리 피펫의 기록 용량을 이용하여 그 유효성을 입증 하였다. 불 활성화하는 동안, 멀티 유닛 활동은 감소하고 서서히 주입 오프셋 후 회복되었다. 이러한 여기에 제시된 것과 같은 가역 비활성화 기술은, 없거나 가난한 복구 (3)를 제공 기계적 또는 화학적 병변 기술을 통해 상당한 이점을 제공한다. 한 쌍의 비교가 가능하기 때문에 3 가역 불활 기술함으로써 특이한 차이를 제거 실험 통계적 유의성을 강화한다. 우리는 물질 전달 및 강력한의 기간에 걸쳐 정확한 제어를 허용하고 비용 효율적인 맞춤형 기술을 개발했다대상 뇌 영역의 프로빙.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection pump (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Injection console (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Hamilton syringe | Hamliton | (80301) 701LT 10 µL SYR | Syringes between 5 and 10 μl used |
| Flexible plastic adhesive | Lepage | 393915 | The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry. |
| Glass pipettes | WPI | #TW100F-4 | Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used |
| 720 Needle Pipette Puller | Kopf | 720 | |
| Silver wire | A-M Systems, Inc. | 782500 | Bare 0.010” |
References
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