Samtidig Elektro Opptak og Micro-injeksjoner av hemmende midler i gnager Brain

Abstract

Her beskriver vi en metode for bygging av en engangs "injectrode" ved hjelp av kommersielt tilgjengelige og rimelige deler. Sentret system ble utviklet som tillater injeksjon av et medikament ved opptak av elektrofysiologiske signaler fra den berørte neuronal populasjon. Denne metoden tilveiebringer en enkel og økonomisk alternativ til kommersielle løsninger. Et glass pipette ble modifisert ved å kombinere den med en kanyle og en sølvtråd. Den injectrode er knyttet til kommersiell mikrosprøyte pumpe for levering av legemidler. Dette resulterer i en teknikk som gir sanntids farmakodynamikk tilbakemeldinger gjennom multi-unit ekstracellulære signaler som stammer fra stedet til levering av legemidler. Som et bevis på konseptet, registrerte vi neuronal aktivitet fra den overlegne colliculus utløst av lysglimt i rotter, samtidig med levering av legemidler gjennom injectrode. Den injectrode opptakskapasitet tillater den funksjonelle karakterisering av den injection stedet favorisere presis kontroll over lokalisering av levering av legemidler. Anvendelsen av denne metoden også strekker seg langt utover det som er vist her, som valg av kjemiske stoffet lastes inn i injectrode er enorme, inkludert sporing markører for anatomiske eksperimenter.

Introduction

Inaktivering av kortikale områder og subkortikale kjerner er viktig i studiet av funksjonelle relasjoner mellom ulike strukturer i hjernen ^2-4. Nyere litteratur har anvendt tap-av-funksjon kjemiske eller kryogene teknikker for å studere rollen til hjernestrukturer ^2,5. Med hensyn til farmakologiske microinjections, kan små mengder av medikamenter administreres til en hjerneregion ved en kontrollert hastighet samtidig som utilsiktet skade på det omgivende vev ^6,7. Denne teknikken kan brukes til å levere spesifikke agonister, inverse agonister eller antagonister for å studere effekten av forskjellige farmakologiske mål på neuronal aktivitet. Slike effekter kan også bli studert ved å måle endringer i nevronale svar fra fjerne steder, slik at forskerne å studere sammenhenger mellom ulike kortikale og subkortikale strukturer.

Her viser vi montering av en enhet, injectrode, kan both opptak elektrofysiologiske signaler og levere små mengder narkotika på målet stedet. Vi viser egenskapene til dette systemet ved å injisere GABA, en felles inhibitor av neuronal aktivitet hos rotte superior colliculus. Denne regionen er følsom for visuell stimulering, som tillot oss å bruke visuelt fremkalt multiunit aktivitet for å bekrefte injectrode lokalisering. Reversibilitet av inaktivering ble bestemt ved gjenvinning av normal neuronal aktivitet etter slutten av GABA injeksjon.

Evnen til å overvåke flere enheter aktivitet fra injeksjonsstedet gir mulighet for finjustering av injeksjonsmengder og volumer for å oppnå den ønskede farmakodynamiske respons. Derfor er en fordel med denne teknikken potensialet begrensning av vevsskade forårsaket av microperfusion, ettersom de minste effektive volum injisert. Den foreslåtte protokollen gir en kostnadseffektiv metode for å generere engangs hardware imidlertid nødvendigy for gjennomføre eksperimenter der levering av legemidler og lokal neuronal aktivitet opptak er ønskelig.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer ble utført i samsvar med direktivene fra den kanadiske Rådet for beskyttelse av dyr og etikk gjennomgang styret i Université de Montréal.

1. Montering av Recording-injeksjon Pipette

1. Trekk en ca 7 cm lang glasskapillar (1 mm ytre diameter) ved hjelp av en pipette avtrekker.
2. Bryt tuppen av kapillaren og kontrollere åpningen under et lysmikroskop. Bekrefte at den indre diameter er mellom 30 um til 40 um.
3. Sett en 7 cm lang sølvtråd i glasset kapillar med omtrent 1 cm som stikker ut fra den ikke-koniske enden av glasset pipette.
4. Bøy skytende filament ortogonalt til glasskapillar.
5. Påfør en dråpe med fleksibel plast lim på skaftet av en 30 G kanyle.
6. Sette inn en 30 G kanyle i glasset pipette i henhold til skjema som er presentert i Figur 1
7. Legg et andre lag med lim for å sikre en forsvarlig tetning fra krysset mellom glasset pipette og kanyle.
8. Forlater pipetten tørke med spissen vendt oppover i omtrent 12 timer for å sikre tilstrekkelig herding av limet. Det ferdige resultatet er vist i figur 2.

MERK: Denne prosedyren er gjort på akutte eksperimenter og sterilisering av pipettespissen er ikke nødvendig.

2. Animal Forberedelse

1. Plasser rotte i en anestesi-boksen.
2. Indusere anestesi ved bruk av 4% isofluran i 5 til 10 min.
3. Plasser dyret på en stereotaksisk bord med varmeputen og rektal probe for å opprettholde en kroppstemperatur på 37 ° C. Bruk en nese kjegle for å opprettholde anestesi med 2% isofluran. Sikre rotte hode hjelp øre barer og tennene holder.
4. Påfør oftalmologiske salve eller øyedråper, som inkluderer 1% Atropin synker til hjelp i elev utvidelse. For å hindre tørrhet, gjelder smøring dråpeer ca hver 30 min.
5. Barbere hodet og rengjøre den med 10% povidonjodid.
6. For lokalbedøvelse, injisere 0,5 ml 2% lidokain under hodebunnen i 2-3 steder ved å løfte opp huden og stikke spissen av nålen.
7. Bekrefte tilstrekkelig grad av anestesi ved å utføre en tå klemme og observere den manglende bevegelse. I tillegg overvåke puls for å sikre at det er innenfor normale verdier (300 til 400 slag / min).
8. Incise hodebunnen i en rett linje langs midt med en # 10 skalpellblad for å avdekke både de koronale og sagittale suturer.
9. Avsløre Lambda og Bregma poeng ved å skyve til side vevet som dekker kraniet med en kirurgisk slikkepott.
10. Nivå kraniet slik at Bregma og Lambda stillinger er på samme plan.
11. Slik angir referansepunktet, bruk en stereotaksisk enhet med en montert glassrør å sette det riktig ovenfor Bregma. Dette vil være den "null" for antero-posterior og MEDial-laterale målinger koordinater.
12. Still severdigheten ved å flytte stereotaxic festet til de nødvendige koordinater, noterer stereotaksiske koordinatene og tegne en firkant rundt målområdet som markerer hvor craniotomy vil bli utført.
13. Bruk en kirurgisk drill med en sterilisert drill langs torvet sakte uten press for å sakte fjerne beinmateriale. Vær forsiktig med å bore for lenge i samme område, som det vil produsere varme og forårsake skader på hjernebarken.
14. Når benet avgrenser craniotomy har blitt tilstrekkelig tynn, forsiktig fjerne hjernedelen med pinsett for å avsløre cortex.
15. Vanlige vanne den eksponerte cortex med kunstig cerebral spinalvæske for å forhindre vev uttørking.
    MERK: Dura mater fjerning er unødvendig på rotte som spissen av injectrode er solid nok til å trenge gjennom.

3. Fylle og Montering av innsprøytningssystemet

1. Fyll5-10 mL mikrosprøyte ved aspirasjon med mineralolje.
2. Fyll den hypodermiske nålen med den faste glass pipette med en oppløsning av 0,5% Chicago himmelen blå (CSB) og 300 uM γ-aminosmørsyre (GABA), eller en løsning av 2% lidokain med 0,5% CSB ^9. Fortynne alle løsninger med saltvann.
   1. I tilfelle av en rikelig substans, fylle ved hjelp av en vanlig sprøyte og benytte de vanlige forholdsregler teknikker for å unngå dannelse av luftbobler.
   2. I tilfelle av mer kostbare stoffer, brukes mineralolje til å fylle injectrode og det kjemiske midlet kan deretter bli innført ved aspirasjon. Ettersom forskjellen i tetthet mellom mineralolje og vann er relativt høy, er dette stoff som en god kandidat for injeksjon av vandige oppløsninger.
      NB: Et fargestoff kan tilsettes for å bekrefte at avstanden mellom begge væsker.
3. For å fylle pipetten injeksjon, fyll en 1 ml sprøyte med løsningen ved avsuging og deretter langsomt injisere oppløsningeni injeksjons pipette.
4. Vær spesielt oppmerksom på lekkasjer i regionene som er angitt i figur 1 ved pensling disse områdene rene og observerer lekkasjer ved ytterligere å injisere løsningen sakte med sprøyten.
5. Fjern 1 ml sprøyte. Når du gjør dette, sørg for å holde et lett trykk på stempelet slik at vakuumet ikke fjerner løsning fra injeksjons pipette.
6. Fyll mikrosprøyte med mineralolje ved aspirasjon og fest den godt til den fylte injeksjon pipette, deretter forsiktig tørke bort overflødig oppløsning fra den sammensatte injectrode med gasbind.
7. Kontroller at spissen ikke er blokkert ved å injisere et meget lite volum, nok til å se en liten dråpe som danner på spissen av glasset pipette.
8. Monter injectrode på mikropumpe system og sørge for at det er godt festet.
9. Posisjonere forsiktig injectrode spissen på målet koordinatene og senke spissen til overflaten av hjernebarken.
10. Sakte senke injectrODE hjelp av stereotaktisk apparat til målstrukturen (superior colliculus i dette tilfelle) ved å bruke de riktige anatomiske koordinater.
11. Dekke utsatte cortex med varmt agar for å hindre vev uttørking.

4. Injeksjon og Vendbar Inaktive

1. Sett mikroinjeksjon pumpe å injisere 400-800 nl ved 40 nl / min og trykk på Kjør for å starte injeksjon. Merk at spike sats vil vise reduksjon under injeksjonen.
   MERK: I den eksperimentelle oppsett, nevrale aktiviteten reverseres innen en time etter slutten av GABA levering. Enhver kalibrert mekanisk anordning kan brukes til å påføre trykk på den mikroinjeksjon sprøyten for å utføre injeksjonen.
2. Etter oppkjøpet av de elektrofysiologiske data, avlive ved hjelp av en metode som er godkjent av den lokale dyreetikk fellesskap.

Representative Results

Konstruksjonen av injectrode er illustrert i Figur 1. En sølvtråd (C) mates inn i en glasspipette (D) med en del av tråden bøyes og stikker ut fra åpningen. A 30 G nål (B) er festet og forseglet til åpningen av glasset pipette med lim. Etter at pipetten er blitt fylt med injeksjonsstoffet, er en glassmikrosprøyte (A) som er festet til nålen. Det er viktig at det er en god tetning, hvor mikro forbinder sprøyten med kanylen (E), og der sølvtråd stikker ut fra glasspipette (F). Figur 2 viser et bilde av hva injectrode ser ut etter fullført montering.

Visuelt fremkalt multiunit aktivitet ble oppnådd på colliculus superior etter en 300 msek flash til den kontralaterale øyet, som vist i figur 3. Ved injeksjon av GABA, spiking aktivitet som svar på en flash-stimulus ble undertrykket. visueltfremkalt multiunit aktivitet typisk tilbake mellom 45 til 60 min etter injeksjon er opphørt.

Figur 4 viser oppsettet av mikroinjeksjon system. Injeksjonspumpe kontrolleren tillater brukeren å angi innstillingene for injeksjon. En fjær elektrisk Kontakten kobler sølvtråd som stikker fra glasset pipette. Kontakten fører til et hode scenen med bakken og referanseelektroder og deretter koblet til en forsterker. En analog / digital (A / D) grensesnittet brukes til å skaffe de elektrofysiologiske data, og en høyttaler brukes for utfyllende audio overvåking av neuronal aktivitet.

Fig. 1: Skjematisk fremstilling av injectrode sammenstilling En mikrosprøyte (A) er festet til opptaks-injeksjonen pipette som består av en 30 G Hypodermic nål (B) festet til en sølvtråd (C) inne i en glass pipette (D). Regioner sirklet (E - F) høylys områder som kan være utsatt for lekkasjer.

Figur 2: Et bilde av den konstruerte pipetten ved hjelp av en 30 G nål (B), vannfast lim lim (F), en sølvtråd (C) og en glass pipette (D).

Figur 3: En illustrasjon av den hemmende effekten av injeksjon av GABA (300 uM) på visuelt fremkalt multi-enhet aktivitet i superior colliculus, pilene viser flash utbruddet. Electrical signaler ble filtrert ved anvendelse av et båndpassfilter som ligger mellom 30 og 3000 Hz.

Figur 4: Skjematisk representasjon av den komplette mikroinjeksjonssystem.

Discussion

Den foreslåtte protokollen ble utviklet for å løse utfordringer som følge av dagens reversible inaktive metoder. Spesielt dette prosjektet tar sikte på å avgrense de metoder som brukes for kjemiske microinjections av stoffer modulerende nevrale aktiviteten, spesielt i dype strukturer i hjernen. En teknisk utfordring dukker opp fra denne typen oppsett er behovet for begge sondene skal colocalized i samme begrenset plass in vivo for å utlede presise opptak på injeksjonsstedet. Dette problemet kan løses ved hjelp av enheter, for eksempel den som presenteres her, som er i stand til både injeksjon og opptak på samme sted. Alternative fremgangsmåter omfatter bruk av enheter basert på gass trykkpulser. Slike verktøy har vært tilgjengelig i mange år, men bruk av et sammentrykkbart mellomprodukt reduseres kontroll over injeksjonsrater og volumer, to parametere som er viktige for å kontrollere for å sikre reversibilitet. Andre metoder som iontoforetiske injeksjon systems er også tilgjengelige, men de diffusjon dynamikken i væsken er forskjellig versus bolus-injeksjon, noe som reduserer den potensielle rekkevidde av inaktivering. Disse metoder har fordelen av å ha en sfærisk spredning mønster i motsetning til den elliptiske mønsteret observert for mikroinjeksjoner ^7. Derfor bør valget av inaktiveringsfremgangsmåten planlegges i henhold til målområdet, og den eksperimentelle design. Selv om kommersielle alternativer finnes, gir den foreslåtte protokollen en kostnadseffektiv måte å overvåke den farmasøytiske stoffet levering samt åpner for en høy grad av tilpasning. Slik frihet i laging av injeksjonsutstyr favoriserer et stort spekter av eksperimentelle fleksibilitet og tuning for spesifikke bruksområder sammenhenger.

Med hensyn til den foreslåtte protokoll, er det kritiske trinn i prosessen med å fylle glass pipette. Luftbobler bør unngås, da komprimert luft vil gjøre overvåkingen av injisertevolumer problematiske. En meget minimal motstand bør også merkes ved manuelt å trykke væske gjennom pipetten, bekrefter fri flyt i systemet. Et fravær av væske med manuell injeksjon kan tyde på en lekkasje i systemet eller feil pipette forberedelse resulterer i en hindret spissen. Impedansen av pipetten bør også bli målt for å oppnå den ønskede typen elektro opptak (LFP, fremkalt respons, multi-enhet aktivitet, etc.), som større støpsler størrelser vil resultere i lavere impedanse.

Hvis injeksjonen er vellykket, er et volum på fra 400 til 800 nl av 300 uM GABA løsning eller 2% lidokain-løsning nok til å avskaffe spiking aktivitet. Å ha en idé om injeksjons spredt i tid og rom, kan agar brukes til å simulere nervevev. Spredningen av injeksjonen kan da lett observeres med en CSB-løsning. Etter simuleringer, er det nødvendig å karakterisere injeksjons spre histologisk ved anvendelse of fargestoffer som CSB, ved autoradiography bruker radiomerkede legemidler eller ved hjelp av metabolske tilnærminger som glukose autoradiografi som indirekte fullmakter til å måle aktivering eller inaktivering av nevral aktivitet ^1.

Det er også viktig å merke seg at raske injeksjoner (≥100 nl / min) vil trolig føre til lesjoner gjøre full reversibilitet uoppnåelig. En stor fordel med den foreslåtte protokoll er potensialet med å integrere innsprøytningssystem med programvare som ville feedback-kontroll injeksjonshastigheten for et sett neuronal aktivitet. En slik implementering vil tillate forskere å fokusere på inaktivering (eller aktivering) parametere i stedet for på tekniske parametre som injeksjonsrater eller volumer mens levere bare riktig mengde legemiddel for anses søknaden. Dette vil minimalisere sonden forskyvning ved å optimalisere ønsket medikament volum, tillater mer tid-sensitive kontroll av medikamentavgivelse, favoriserer reproduserbarheten og alleow direkte koblet sammenligning av data.

Denne teknikken kombinerer et system for substans levering og opptak av elektrofysiologiske signaler. Vi viste sin effektivitet ved å bruke kapasiteten vår pipette opptak til funksjonelt finne den overlegne colliculus ved å fremkalle tog av multi-unit aktivitet blits stimuli ^11. Under inaktivering, multi-unit aktivitet redusert og gradvis gjenvunnet etter injeksjon utlignet. Reversible inaktiveringsteknikker, slik som den er presentert her, gir betydelige fordeler i forhold til mekaniske eller kjemiske lesjoner teknikker som gir fraværende eller dårlig gjenvinning ^3. Reversible inaktive teknikker forsterke den statistiske signifikans av eksperimentene siden parvise sammenligninger er mulig ^3, for derved å eliminere idiosynkratiske forskjeller. Vi har utviklet en kostnadseffektiv og tilpasses teknikk som tillater presis kontroll over varigheten av stoffavgivelsen og robustsondering av et mål cerebral område.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Injection pump (UltraMicroPump III)	WPI	#UMP3
Injection console (Micro4 Controller)	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton syringe	Hamliton	(80301) 701LT 10 µL SYR	Syringes between 5 and 10 μl used
Flexible plastic adhesive	Lepage	393915	The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry.
Glass pipettes	WPI	#TW100F-4	Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used
720 Needle Pipette Puller	Kopf	720
Silver wire	A-M Systems, Inc.	782500	Bare 0.010”