Abstract
Здесь мы опишем метод для строительства одноразовой "injectrode", используя коммерчески доступные и недорогие запчасти. Зондирующего система была разработана, что позволяет инъекции препарата во время записи электрофизиологических сигналов от пораженной нейронной население. Этот метод обеспечивает простой и экономичной альтернативой коммерческим решениям. Стеклянной пипетки была модифицирована путем объединения ее с иглой для подкожных инъекций и серебряной нити. Injectrode прикреплен к коммерческой микрошприц насос для доставки лекарственных средств. Это приводит в технике, что обеспечивает в режиме реального времени обратной связи фармакодинамики через многоквартирных внеклеточного сигналов, исходящих от места доставки наркотиков. Как доказательство концепции, мы записали активность нейронов от двухолмия вызванной вспышками света у крыс, одновременно с доставкой наркотиков через injectrode. Емкость записи injectrode позволяет функциональную характеристику инъекцотражения на сайте пользу точный контроль над локализацией поставки наркотиков. Применение этого метода также простирается далеко за пределы того, что показали здесь, как выбор химического вещества загружаются в injectrode огромен, в том числе отслеживание маркеры для анатомических опытов.
Introduction
Инактивация областях коры и подкорковых ядер важно в изучении функциональных связей между различными структурами мозга 2-4. Последние исследования использованы потери из-функции химического или криогенные методы, чтобы изучить роль структур головного мозга 2,5. В отношении фармакологических микроинъекций, небольшие объемы препаратов можно вводить в область головного мозга с контролируемой скоростью при сведении к минимуму побочного ущерба окружающей ткани 6,7. Этот метод может быть использован для получения конкретной агонисты, обратные агонисты или антагонисты для изучения влияния различных фармакологических мишеней на нейронной активности. Такие эффекты могут быть изучены путем измерения изменения в нейронных ответов из дальних мест, что позволяет исследователям изучать отношения между различными корковыми и подкорковыми структурами.
Здесь мы демонстрируем сборку устройства, в injectrode, способный бой записи электрофизиологических сигналов и доставки небольших количеств препаратов в целевом местоположении. Мы продемонстрировать возможности этой системы путем введения ГАМК, общий ингибитор активности нейронов, в крысиной двухолмия. Этот регион является чувствительным к визуальной стимуляции, которая позволила нам использовать визуально вызвавший многоместными деятельность, чтобы подтвердить локализацию injectrode. Обратимость инактивации оценивали по восстановлению нормальной нейронной активности после окончания ГАМК инъекции.
Возможность контролировать мульти-блок активности из места инъекции позволяет тонкой настройки скоростей впрыска и объемов, необходимых для достижения желаемого фармакодинамического ответа. Таким образом, преимуществом этого метода является возможность ограничивающим повреждение тканей, вызванного microperfusion, так наименьшей эффективной объемы инъекции. Предложенный протокол обеспечивает экономически эффективный способ для генерации одноразового аппаратного necessarу для проведения экспериментов, в которых доставки лекарств и местных нейронов записи деятельность желаемых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры были выполнены в соответствии с директивами Канадского совета по защите животных и наблюдательный совет по этике в Университете Монреаля.
1. Ассамблея Запись впрыска пипетки
- Потяните приблизительно 7 см длинный стеклянный капилляр (1 мм наружный диаметр), используя пипетки съемник.
- Перерыв кончик капилляра и проверить отверстие под световым микроскопом. Убедитесь, что внутренний диаметр составляет от 30 мкм до 40 мкм.
- Вставьте длиной 7 см серебряной проволоки с в стеклянный капилляр с примерно 1 см, выступающих из Неклиновидная конце стеклянной пипетки.
- Изгиб избыток нити ортогонально стеклянного капилляра.
- Нанесите капельку гибкой пластиковой клей на вал 30 G иглы для подкожных инъекций.
- Вставьте 30 G иглу в стеклянной пипетки в соответствии с схемами, представленными в рисунке 1
- Добавление второго покрытие клеем, чтобы обеспечить надлежащее уплотнение в сочленении между стеклянной пипетки и подкожных инъекций.
- Оставьте пипетки для сухой с кончик направлен вверх около 12 часов, чтобы обеспечить надлежащее отверждение клея. Готовое Результат показан на рисунке 2.
Примечание: Эта процедура выполняется на острых опытах и стерилизации наконечника пипетки не требуется.
2. Подготовка животных
- Поместите крысу в анестезии поле.
- Индуцировать анестезию с использованием 4% изофлуран от 5 до 10 мин.
- Место животное на стереотаксической стол с грелку и ректального зонда, чтобы поддерживать температуру тела 37 ° С. Используйте носовой конус для поддержания анестезии с 2% изофлуран. Безопасный голову крысы с помощью уха баров и держатель зубы.
- Применить глазная мазь или глазные капли, которые включают 1% атропина капли, чтобы помочь в расширением зрачка. Чтобы предотвратить сухость, применяются смазочные падениеS примерно каждые 30 мин.
- Бритье головы и очистить его с 10% повидон-йод.
- Для местной анестезии, вводят 0,5 мл 2% лидокаина в кожу головы 2-3 в местах, подняв кожу и вставки кончик иглы.
- Подтвердите адекватный уровень анестезии, выполняя носок щепотку и наблюдая отсутствие движения. Кроме того, контролировать частоту сердечных сокращений, чтобы гарантировать, что он находится в пределах нормальных значений (от 300 до 400 уд / мин).
- Надрезать кожу головы в прямой линии вдоль медианы с # 10 лезвие скальпеля, чтобы выставить как корональные и сагиттального швов.
- Выявить лямбда и темени точки от расталкивая ткань, которая покрывает череп с хирургической шпателем.
- Уровень череп, так что брегмы и лямбда-позиции в одной плоскости.
- Чтобы установить точку отсчета, использовать стереотаксической устройства с установленным стеклянной трубки, чтобы установить его прямо над брегмы. Это будет "ноль" для передне-задней и медIAL-боковые измерения координат.
- Установите точку интереса путем перемещения стереотаксической крепление к требуемые координаты, обратите внимание на стереотаксических координат и нарисовать квадрат вокруг целевой области, отмечает, где будет выполняться трепанация черепа.
- Используйте хирургическую дрель с стерилизованной сверла вдоль отмеченной площади медленно, без давления медленно удалить материал костной ткани. Будьте осторожны, чтобы не просверлить слишком долго в том же районе, как это будет производить тепло и вызвать повреждения на коре.
- Когда кости делимитации трепанацию черепа стала достаточно тонкой, осторожно удалите черепную раздел с помощью пинцета, чтобы разоблачить мозга.
- Часто поливать открытую кору с искусственным спинномозговой жидкости, чтобы предотвратить обезвоживание тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дура-матер удаление ненужно на крысах, как верхушка injectrode достаточно крепким, чтобы проникнуть.
3. Заполнение и монтаж системы впрыска
- Заполните5-10 мкл микрошприц стремлением с минеральным маслом.
- Заполните шприц с фиксированной стеклянной пипетки с раствором 0,5% Чикаго голубой (CSB) и 300 мкМ γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) или раствором 2% лидокаина с 0,5% CSB 9. Развести все решения с физиологическим раствором.
- В случае обильного вещества, заполните с помощью регулярного шприц и использовать обычные методы предосторожности, чтобы избежать образования воздушных пузырьков.
- В случае более дорогих веществ, используют минеральное масло, чтобы заполнить injectrode и химический агент может быть введен с помощью аспирации. В отличие плотности между минерального масла и воды является относительно высокой, это вещество является хорошим кандидатом для инъекций водных растворов.
Примечание: краситель может быть добавлен, чтобы подтвердить расстояние между обеих жидкостей.
- Для заполнения инъекционной пипетки, заполнить шприц емкостью 1 мл с раствором аспирацией и затем медленно вводят растворв инъекционной пипетки.
- Обратите особое внимание на герметичность в регионах, указанных на рисунке 1, моечные эти области чистой и наблюдая утечки путем дальнейшего нагнетания медленно раствор с шприцем.
- Удалите шприц 1 мл. При этом, не забудьте сохранить светового давления на поршень таким образом, чтобы вакуум не удалить раствор из пипетки инъекции.
- Заполните микрошприца с минеральным маслом стремлением и надежно прикрепите его к заполненной пипетки инъекции, затем тщательно вытереть излишки раствора из собранного injectrode марлей.
- Убедитесь, что наконечник не блокируется путем введения очень небольшой объем, достаточный, чтобы увидеть небольшую каплю формирования на кончике стеклянной пипетки.
- Установите injectrode в системе микронасосу и убедиться, что он хорошо фиксируется.
- Осторожно установите наконечник injectrode в целевых координат и снизить наконечник к поверхности коры.
- Медленно опустите injectrОда помощью стереотаксической аппарат к целевой структуре (двухолмия в данном случае), используя соответствующие анатомические координаты.
- Накройте подвергается кору теплой агар, чтобы предотвратить высыхание ткани.
4. Инъекции и реверсивный Инактивация
- Установите микроинъекции насос придать от 400 до 800 п на 40 л / мин и пресс-Run, чтобы начать инъекцию. Обратите внимание, что скорость шип покажет снижение во время инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментальной установке, нервная деятельность восстанавливается в течение часа после окончания поставки ГАМК. Любая калибровка механическое устройство может быть использовано, чтобы оказать давление на микроинъекции шприца для того, чтобы провести инъекцию. - После приобретения электрофизиологических данных, усыпить, используя метод, утвержденный местным животных этике сообщества.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конструкция injectrode показано на рисунке 1. серебряной проволоки (C) подается в стеклянную пипетку (D) с частью проволочной тяги и выступающие из отверстия. 30 G иглу (B) прикреплен и уплотнен к открытию стеклянной пипетки с клеем. После пипетка была заполнена веществом инъекции, стекло микро шприца (А) присоединен к игле. Важно, что есть хорошее уплотнение, где микро шприц соединяется с иглой (E) и где серебряный провод выступает из стеклянной пипетки (F). Рисунок 2 показывает фотографию, что injectrode выглядит после завершения сборки.
Визуально вызванных многоместными активность, были получены в следующем двухолмия 300 мс вспышки до второго глаза, как показано на фиг.3. После инъекции GABA, пики активности в ответ на флэш-стимул был подавлен. визуальновызвала многоместными деятельность, как правило, возвращается от 45 до 60 мин после инъекции перестал.
Рисунок 4 иллюстрирует настройку системы микроинъекции. Контроллер ТНВД позволяет пользователю указать параметры для инъекций. Пружина электрический соединитель соединяет серебряной проволоки, которая выступает из стеклянной пипетки. Разъем приводит к стадии головы с наземными и электродов, а затем подключен к усилителю. Аналоговый / цифровой интерфейс (A / D) используется для получения электрофизиологических данных, и динамик для дополнительного аудио мониторинга активности нейронов.
Рисунок 1:. Схематическое представление injectrode сборки микро шприца (А) крепится к записи впрыска пипетки, которые состоят из 30 г чypodermic иглы (В) приклеена к серебряной проволоки (C) внутри стеклянной пипетки (D). Регионы кружил (Е - Ж) яркие участки, которые могут быть подвержены утечкам.
Рисунок 2: фото построенной с использованием пипетки 30 G иглу (B), водонепроницаемый клей клей (F), серебряной проволоки (C) и стеклянную пипетку (D).
Рисунок 3: Иллюстрация тормозного эффекта инъекции GABA (300 мкМ) на визуально вызывал многоквартирных деятельности в двухолмия, стрелки указывают флэш начало. ЭлектрическийAl сигналы фильтруют, используя полосовой фильтр установлен между 30 и 3000 Гц.
Рисунок 4: Схематическое представление полной системы микро-инъекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предложенный протокол был разработан, чтобы решить проблемы, связанные с текущим обратимых методов инактивации. В частности, этот проект направлен на уточнение методов, используемых для химических микроинъекций веществ, модулирующих активность нейронов, особенно в глубинных структурах головного мозга. Техническая задача выхода из этого типа установки является необходимость для обеих зондов для локализуется в той же ограниченного пространства в естественных условиях в целях получения точных записей в месте инъекции. Эта проблема может быть преодолена с помощью устройств, таких как тот, представленного здесь, которые способны как инъекции и записи на том же сайте. Альтернативные методы включают использование устройств на основе импульсов давления газа. Такие инструменты были доступны в течение многих лет, но использование промежуточного сжимаемого снижает контроля за скоростью впрыска и объемов, двух параметров, которые важны для контроля, чтобы обеспечить обратимость. Другие методы, такие как инъекции ионтофоретическое сystems также доступны, но динамика диффузии жидкости отличаются по сравнению с болюсной инъекции, снижение потенциального диапазона инактивации. Эти методы имеют то преимущество, что сферический образец диффузии в отличие от эллиптической наблюдаемой картине для микро-инъекций 7. Следовательно, выбор метода инактивации должна планироваться в соответствии с целевой областью и эксперимента. Даже несмотря на существование коммерческие альтернативы, предложенный протокол является экономически эффективным образом мониторинга доставки лекарственного вещества, а также позволяет с высокой степенью кастомизации. Такая свобода в обработке инъекционного устройства способствует широкий спектр экспериментальных гибкости и настройки для конкретных прикладных контекстов.
Что касается предлагаемого протокола, критическим этапом является процесс заполнения стеклянной пипетки. Пузырьки воздуха, следует избегать, так как сжатие воздуха будет оказывать мониторинг вводятОбъемы неразрешимыми. Очень минимальное сопротивление следует также чувствовал, когда вручную нажатием жидкости через пипетку, подтверждающие свободный поток в системе. Отсутствие жидкости с ручным инъекции может указывать на утечку в системе или неправильной подготовки пипетки, в результате затрудненных наконечником. Импеданс пипетки также должна быть измерена, чтобы получить желаемый тип электрофизиологические записи (LFP, вызванные потенциалы, мульти-блок активность и т.д.), как больших размеров подсказки приведет к более низким импедансом.
Если инъекция прошла успешно, объем от 400 до 800 нл на мкМ ГАМК раствора 300 или 2% -ным раствором лидокаина достаточно, чтобы отменить пики активности. Чтобы иметь представление о том, инъекции распространения в пространстве и времени, агар может быть использован для имитации нервной ткани. Распространение инъекций могут быть легко наблюдается раствором CSB. После моделирования, важно, чтобы охарактеризовать инъекции распространения гистологически путем использования OF красители, такие как ЦСУ, по авторадиографией использованием радиоактивно меченных препаратов или с помощью метаболических подходов, таких как глюкоза Авторадиография как косвенные прокси для измерения активации или инактивации нейронной активности 1.
Важно также отметить, что быстрые инъекции (≥100 Нл / мин), скорее всего, привести к патологическим изменениям в полной обратимости недостижимой. Основным преимуществом предлагаемого протокола потенциал интеграции системы впрыска с помощью программного обеспечения, которые обратной связи управления скоростью впрыска для заданного уровня активности нейронов. Такое внедрение позволит исследователям сосредоточиться на инактивации (или активации) параметров, а не на технических параметрах, таких как темпы инъекций или объемов, обеспечивая при этом только нужное количество препарата для рассматриваемого приложения. Это позволит свести к минимуму смещение зонда путем оптимизации необходимого объема наркотиков, позволяют более срочным контроля доставки лекарств, в пользу воспроизводимость и всевл прямым попарное сравнение данных.
Эта техника сочетает в себе систему доставки вещества и записи электрофизиологических сигналов. Мы продемонстрировала свою эффективность с помощью емкость записи нашего пипетки функционально найти двухолмия, вызывая поезда многоквартирных деятельности с использованием вспышки стимулы 11. Во время инактивации, мульти-блок деятельность уменьшилась, и постепенно восстановился после смещения впрыска. Реверсивные методы инактивации, такие как тот, представленной здесь, обеспечивают значительные преимущества по сравнению с механическими или химическими методами поражений, которые обеспечивают отсутствует или плохое восстановление 3. Реверсивные методы инактивации укрепить статистическую значимость экспериментов с парные сравнения можно 3, тем самым устраняя особенные отличия. Мы разработали экономичную и настраиваемый метод, который позволяет точно контролировать продолжительность доставки веществ и надежныйзондирования в области целевой мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection pump (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Injection console (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Hamilton syringe | Hamliton | (80301) 701LT 10 µL SYR | Syringes between 5 and 10 μl used |
| Flexible plastic adhesive | Lepage | 393915 | The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry. |
| Glass pipettes | WPI | #TW100F-4 | Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used |
| 720 Needle Pipette Puller | Kopf | 720 | |
| Silver wire | A-M Systems, Inc. | 782500 | Bare 0.010” |
References
- Martin, J. H., Ghez, C. Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).
- Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT. The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).
- Lomber, S. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).
- Malpeli, J., Schiller, P. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).
- Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).
- Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats. Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).
- Malpeli, J. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Minville, K., Casanova, C. Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex. Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).
- Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat. Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).
