Abstract
Burada ticari olarak erişilebilir ve uygun fiyatlı parçalar kullanarak tek kullanımlık "injectrode" yapımı için bir yöntem açıklanmaktadır. Bir tarama sisteminin etkilenen nöronal popülasyonundan elektrofizyolojik sinyalleri kayıt sırasında bir ilacın enjeksiyonu sağlar geliştirildi. Bu yöntem, ticari çözümler için basit ve ekonomik bir alternatif sağlar. Bir cam pipet bir hipodermik iğne ve gümüş filament ile birleştirilmesi suretiyle modifiye edildi. injectrode ilaç iletimi için ticari bir mikroenjektör pompasına bağlanmıştır. Bu ilaç dağıtım sitesinden kaynaklanan çoklu ünite dışı sinyalleri aracılığıyla gerçek zamanlı farmakodinamikler geri bildirim sağlayan teknikle sonuçlanır. Kavramının bir kanıtı olarak, eş zamanlı olarak injectrode yoluyla ilaçların teslimi ile, sıçanlarda ışık yanıp söner tarafından ortaya üstün colliculus gelen nöronal aktivitenin kaydetti. injectrode kayıt kapasitesi inj fonksiyonel karakterizasyonu izin veririlaç dağıtım lokalizasyonu üzerinde hassas kontrol lehine ection sitesi. Injectrode yüklü kimyasal madde seçimi anatomik deneyler için işaretleyiciler izleme dahil olmak üzere, geniş bir şekilde, bu yöntemin uygulanması, aynı zamanda, buradan çok gösterilmiştir ötesine uzanır.
Introduction
kortikal alan ve alt kortikal çekirdeklerin inaktivasyonu, çeşitli beyin yapıları 2-4 arasındaki fonksiyonel ilişkiler çalışmalarında önemlidir. Son literatür beyin yapılarının 2,5 rolünü incelemek için kayıp fonksiyon-kimyasal veya kriyojenik teknikleri istihdam vardır. Çevre doku 6,7 kollateral hasarı en aza indirerek ilaç microinjections ilgili olarak, ilaçların küçük miktarlar kontrollü bir hızda, bir beyin bölgesine uygulanabilir. Bu teknik, nöronal aktivitenin farklı farmakolojik hedeflerin etkisini incelemek için spesifik agonistleri, ters agonistleri veya antagonistleri sunmak için de kullanılabilir. Bu tür etkileri de araştırmacılar, farklı kortikal ve subkortikal yapılar arasındaki ilişkileri incelemek için izin uzak yerlerden nöronal yanıtları değişiklikleri ölçerek ele alınabilir.
Burada, biz bo yeteneğine sahip bir cihazın montajını, injectrode, göstermekelektrofizyolojik sinyaller kayıt ve hedef konumda ilaçların küçük miktarlarda teslim inci. Biz sıçan üstün colliculus, GABA, nöronal aktivitenin ortak bir inhibitörü enjekte edilerek bu sistemin yeteneklerini göstermek. Bu bölge bize injectrode yerelleştirme onaylamak için görsel uyarılmış multiunit aktiviteyi kullanmak için izin görsel uyarı, duyarlıdır. inaktivasyon reversibilitesinin GABA enjeksiyonu bitimini izleyen, normal nöronal aktivitenin iyileşme ile değerlendirildi.
enjeksiyon bölgesinden çok üniteli etkinliğini izlemek için yeteneği istenen farmakodinamik yanıtı elde etmek için gerekli enjeksiyon oranları ve hacimlerin ince ayar için izin verir. En küçük etkili miktarlar enjekte edilir çünkü Bu nedenle, bu tekniğin bir avantajı, Şekilde, mikro neden olduğu doku hasarının sınırlayıcı potansiyelidir. önerilen protokol tek bir donanım necessar üretilmesi için bir maliyet açısından verimli bir yöntem sağlarilaç verme ve yerel nöronal etkinliği kayıt istendiği deneyleri yürütmek için y.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm prosedürler Hayvanları Koruma ve Université de Montréal Etik inceleme kurulu Kanada Konseyi direktifleri doğrultusunda yapıldı.
Kayıt enjeksiyon Pipet 1. Meclisi
- Bir pipet çektirmenin kullanarak yaklaşık 7 cm uzunluğunda bir cam kapiller (1 mm dış çapı) çekin.
- Kılcal ucu kırın ve bir ışık mikroskobu altında diyafram kontrol edin. Iç çapı 40 mikron 30 mikron arasında olduğunu onaylayın.
- Cam pipet olmayan konik ucundan çıkıntılı yaklaşık 1 cm cam kapiller içine 7 cm uzunluğunda gümüş tel yerleştirin.
- Cam kapiller dikey olarak aşırı filament bükün.
- Bir 30 G hipodermik iğnenin mil üzerinde esnek plastik bir yapışkan damlacık uygulanır.
- Şekil 1 'de sunulan şemadaki gibi cam pipet bir 30 G hipodermik iğne takın
- Cam pipet ve hipodermik iğne arasındaki birleşme gelen uygun bir sızdırmazlık sağlamak için yapıştırıcı bir ikinci kaplama ekleyin.
- Ucu tutkal uygun kür sağlamak için yaklaşık 12 saat boyunca yukarı bakacak şekilde kurumaya pipet bırakın. bitmiş sonucu, Şekil 2'de gösterilmiştir.
Not: Bu yordam, akut deneyler ve pipet sterilizasyonu yapılır gerekli değildir.
2. Hayvan hazırlanması
- Bir anestezi kutusuna sıçan yerleştirin.
- 5 ila 10 dakika süreyle% 4 izofluran kullanarak anestezi neden olur.
- 37 ° C'lik bir vücut ısısını korumak için ısıtma yastığı ve rektal prob ile bir stereotaksik tablo hayvan yerleştirin. % 2 izofluran ile anestezi korumak için burun konisi kullanın. Kulak çubukları ve dişlerin tutucu kullanarak sıçan başını sabitleyin.
- Atropin öğrenci genişlemesi yardımcı olmak için damla% 1 dahil oftalmik merhem ya da göz damlaları, uygulayın. Kuruluğunu önlemek için, damla yağlama uygulamakYaklaşık her 30 dk s.
- Kafa Tıraş ve% 10 povidon-iyot ile temizleyiniz.
- Lokal anestezi için, cildi yukarı kaldırma ve iğne ucu takarak 2-3 yerlerde kafa derisi altında% 2 lidokain 0.5 ml enjekte edilir.
- Bir ayak tutam performans ve hareket eksikliği gözlemleyerek anestezi yeterli düzeyde onaylayın. Buna ek olarak, normal değerler (300-400 atım / dak) içinde olduğundan emin olmak için kalp hızı izleme.
- Koronal ve sagital sütür hem duyurmak için bir 10. neşter bıçağı ile medyan boyunca düz bir çizgi derisini İnsizyon.
- Cerrahi spatula ile kafatası kapsayan doku bir kenara iterek Lambda ve Bregma noktaları açığa vurmak.
- Bregma ve Lambda pozisyonları aynı düzlemde olacak şekilde kafatası Seviye.
- Referans noktasını ayarlamak için, sağ bregmadan yukarıda ayarlamak için bir monte edilmiş cam tüp ile bir stereotaksik cihaz kullanın. Bu "sıfır" için ön-arka ve med olacakial yanal ölçümler koordine eder.
- Stereotaksik gerekli koordinatları montaj hareket ettirerek ilgi noktasını ayarlayın stereotaksik koordinatları not ve kraniyotomi yapılacaktır nerede işaretleri hedef alan etrafında bir kare çizin.
- Yavaş yavaş kemik malzemeyi çıkarmak için baskı olmadan yavaş yavaş belirgin meydanda boyunca sterilize matkapla bir cerrahi matkap kullanın. Bu korteks üzerindeki lezyonlar ısı üretmek ve neden olacağından, aynı bölgede çok uzun inebilecek dikkatli olun.
- Kraniotomiye sınırlayan kemik yeterince ince eriştiğinde, dikkatlice korteks maruz cımbız ile kranial bölümü çıkarın.
- Sıkça doku kuruma önlemek için yapay beyin omurilik sıvısı ile maruz korteksi sulamak.
NOT: injectrode ucu nüfuz kadar sağlam olduğu Dura mater kaldırma sıçan üzerinde gereksiz olduğunu.
3. Doldurma ve Enjeksiyon Sistemi montajı
- DoldurmakMineral yağ ile aspirasyon ile 5-10 ul mikroenjektör.
- % 0.5 Chicago Sky Blue (CSB) ile 300 uM γ-aminobutirik asit (GABA) ya da% 0.5 CSB 9% 2 lidokain çözeltisi içeren bir çözelti ile, sabit bir cam pipet ile deri altı iğne doldurun. Tuzlu su ile bütün çözümleri seyreltin.
- Bol bir madde olması halinde, normal bir şırınga kullanılarak girip hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için normal önlemler tekniklerini kullanır.
- Daha pahalı maddeler durumunda, injectrode doldurmak için mineral yağ kullanımı ve kimyasal madde daha sonra aspirasyon ile sokulabilir. Mineral yağ ve su arasındaki yoğunluk farkı nispeten yüksek olduğu için, bu madde, sulu çözeltiler enjeksiyon için iyi bir adaydır.
Not: bir boya iki sıvı arasındaki mesafeyi teyit etmek için ilave edilebilir.
- Enjeksiyon pipet doldurmak için, aspirasyonla çözeltisi ile 1 ml şırınga girip daha sonra yavaş yavaş solüsyon enjekteEnjeksiyon pipet içine.
- Temiz bu alanları swabbing ve ayrıca şırınga ile yavaşça çözüm enjekte ederek kaçaklar gözlemleyerek Şekil 1'de gösterilen bölgelerde sızıntı olup olmadığını dikkat ediniz.
- 1 ml şırınga çıkarın. Bunu yaparken, vakum enjeksiyon pipet gelen çözüm kaldırmaz, böylece pistonu hafif bir basınç tutmak için emin olun.
- Aspirasyon mineral yağ ile mikroenjektör doldurun ve dolu enjeksiyon pipet sıkıca takın, sonra dikkatlice gazlı bez ile bir araya injectrode herhangi bir aşırı çözüm silerek temizleyin.
- Ucu cam pipet ucu şekillendirme küçük bir damla görmek için yeterli çok küçük bir hacim, enjekte edilerek tıkalı olmadığından emin olun.
- Mikropompa sistemi üzerinde injectrode monte ve iyi sabit olduğundan emin olun.
- Dikkatle hedef koordinatlarında injectrode ucunu yerleştirin ve korteks yüzeyine ucu indirin.
- Yavaşça injectr düşürmekUygun anatomik koordinatları kullanarak hedef yapısına stereotaksik aparatı (bu durumda üstün colliculus) kullanarak gazel.
- Doku kuruma önlemek için sıcak agar ile maruz korteksi örtün.
4. Enjeksiyon ve Tersinir İnaktivasyonu
- Enjeksiyonu başlatmak için 40 nl / dak ve basın Run 400 nl 800 enjekte mikroenjeksiyon pompasını ayarlayın. O başak oranı enjeksiyon sırasında azalma gösterecektir unutmayın.
NOT: deney düzeneği, sinirsel aktivite GABA doğum bitiminden sonra bir saat içinde iyileşti. Herhangi bir kalibre mekanik cihaz enjeksiyonu yapmak amacıyla mikroenjeksiyon şırınga baskı uygulamak için kullanılabilir. - Elektrofizyolojik veriler kazanılmasından sonra, yerel Hayvan Etik Topluluğu tarafından onaylanmış bir yöntem kullanılarak euthanize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
injectrode inşaat tel bükülmüş bir kısmı ile bir cam pipet (D) içine beslenir ve açıklıktan dışarı doğru çıkıntı yapan, Şekil 1 bir gümüş tel (C) 'de gösterilmiştir. A 30 G iğne (B) bağlı ve yapıştırıcı ile cam pipet açılmasına kapatılır. Pipet püskürtme maddesi ile doldurulduktan sonra, cam mikro şırınga (A), bir iğne takılır. Mikro şırınga iğnesi (E) ve nerede gümüş tel cam pipet (F) çıkıntı bağlanır iyi bir mühür var olması önemlidir. 2 injectrode Montaj tamamlandıktan sonra neye benzediğini bir fotoğrafı göstermektedir.
Görsel olarak uyarılmış çok birimli aktivitesi, Şekil 3'te gösterildiği gibi, diğer göz için 300 msn flaş aşağıdaki üstün colliculus elde edilmiştir. GABA enjeksiyonu üzerine bastırılan bir flaş uyarıcıya tepki olarak aktivitesi spike. görselEnjeksiyon durduktan sonra uyarılmış multiunit aktivite genellikle 60 dakika ile 45 arasında döndü.
Şekil 4 mikroenjeksiyon sistemi kurulumu gösterilmektedir. Enjeksiyon pompası kontrolör enjeksiyon için ayarlarını belirlemek için izin verir. Bir bahar elektrik konnektörü cam pipet çıkıntı gümüş tel bağlar. bağlayıcı zemin ve referans elektrotlar ile bir kafa aşamasına yol açar ve daha sonra bir amplifikatör takılı. Bir analog / dijital (A / D) arabirimi elektrofizyolojik veri elde etmek için kullanılır ve bir hoparlör nöronal aktivitenin tamamlayıcı ses izlenmesi için kullanılır.
Şekil 1:. Injectrode düzeneğinin şematik temsili bir mikro şırınga (A) 30 g h oluşur kaydedici enjeksiyon pipetine bağlıbir cam pipet (D) içinde bir gümüş tel (C) yapıştırılmış ypodermic iğnesi (B). Kaçakları duyarlı olabilir vurgulamak alanları - Bölgeler (F E) çember.
Şekil 2: 30 G iğne (B), su geçirmez yapıştırıcı tutkal (F), bir gümüş tel (C) ve bir cam pipet (D) kullanılarak inşa pipet bir fotoğraf.
Şekil 3: üstün colliculus görsel uyarılmış çok üniteli aktivitesi üzerine GABA (300 mcM) enjeksiyonu engelleyici etkisinin bir örnek, oklar flaş başlangıcını işaret eder. Elektrikal sinyalleri 30 ve 3000 Hz arasında ayarlanmış bir bant geçiren filtre kullanılarak süzüldü.
Şekil 4: tam mikro-enjeksiyon sisteminin şematik gösterimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önerilen protokol mevcut geri dönüşümlü etkisizleştirme yöntemleri kaynaklanan sorunları çözmek için tasarlanmıştır. Özellikle bu proje özellikle derin beyin yapılarında nöral aktiviteyi modüle maddelerin kimyasal microinjections için kullanılan yöntemleri rafine yönelik. Kurulum bu tür ortaya çıkan bir teknik zorluk, her iki sondalar enjeksiyon yerinde kesin kayıtları elde etmek amacıyla in vivo aynı kısıtlı alanda kolokalize edilmesi ihtiyacıdır. Bu sorun, aynı sitede Enjeksiyon ve kayıt kapasitesine sahip olan bu gibi burada sunulan olarak aygıtları kullanılarak aşılabilir. Alternatif yöntemler, gaz basınç darbeleri göre aygıtların kullanımını içerir. Bu tür araçlar uzun yıllar kullanılabilir olmuştur, ama bir sıkıştırılabilir ara kullanılması enjeksiyon oranları ve hacimleri, reversibilite sigorta kontrol için önemli olan iki parametre üzerinde kontrol azaltır. Böyle İyontoforetik enjeksiyon s olarak diğer yöntemlerystems de kullanılabilir, ancak sıvının difüzyonu dinamikleri inaktivasyonu potansiyel aralığı azaltmak, bolus enjeksiyonu karşı farklıdır. Bu yöntemler, mikro-enjeksiyon için gözlemlenen 7 elips model yerine bir küre difüzyon desenine sahip avantajına sahiptir. Bu nedenle, inaktivasyon yönteminin seçimi hedef bölge ve deneysel tasarımına göre planlanmalıdır. Ticari alternatifler mevcut olsa da, önerilen protokol ilaç madde teslimatı izleme yanı sıra özelleştirme yüksek derecede sağlayan bir maliyet etkin bir şekilde sağlamaktadır. Enjeksiyon cihazının işçiliği Böyle özgürlük özel uygulama bağlamları için deneysel esneklik ve ayar geniş bir ürün yelpazesi yanadır.
Önerilen protokole ile ilgili olarak, kritik bir adım cam pipet doldurma işlemidir. Hava sıkıştırma enjekte izlenmesini hale getirecek şekilde hava kabarcıkları, kaçınılmalıdırinatçı hacimleri. Manuel sistemde serbest akışını teyit pipet aracılığıyla sıvı iterken çok az direnci de hissettim edilmelidir. Manuel enjeksiyonu ile sıvı yokluğu sistemi veya tıkalı ucu ile sonuçlanan yanlış pipet hazırlanmasında bir sızıntı gösterebilir. pipet empedansı istenen türü elektrofizyolojik kayıt elde etmek için ölçülmelidir düşük empedansları ile sonuçlanacaktır büyük uçları boyutları gibi, (işgücüne katılımını, potansiyelleri, çoklu ünite aktivitesi, vs. uyarılmış).
Enjeksiyon başarılı olursa, 400-800, 300 uM GABA çözeltisi nl veya% 2 lidokain çözeltisinin bir hacmi aktivitesi spike ortadan kaldırmak için yeterlidir. Uzay ve zaman içinde yayılan enjeksiyon bir fikir sahibi olmak, ağar sinir dokusu simüle etmek için de kullanılabilir. Enjeksiyon yayılması daha sonra kolayca CSB çözeltisi ile görülebilir. Simülasyonlar sonra, o kullanımı yoluyla histolojik yaymak enjeksiyon karakterize etmek esastırradyo işaretli ilaç kullanılarak otoradyografi ile veya nöral faaliyet 1 aktivasyonu ya da inaktivasyonunu ölçmek için, glukoz otoradyografi dolaylı vekiller gibi metabolik yaklaşımı ile CSB olarak f boyalar.
Büyük olasılıkla tam reversibilite ulaşılamaz hale lezyonlar yol açacağı hızlı enjeksiyonları (≥100 nl / dak) dikkat etmek de önemlidir. Önerilen protokolün önemli bir avantajı, bir dizi nöronal aktivite düzeyi için enjeksiyon hızını geribildirim-kontrol edecek yazılımı ile enjeksiyon sistemi entegre potansiyelidir. Böyle bir uygulama araştırmacılar parametreleri etkisizleştirme (ya da aktivasyon) ziyade dikkate uygulama için ilacın sadece doğru miktarda sunarken böyle bir enjeksiyon oranları veya hacimleri gibi teknik parametrelere odaklanmak için izin verecek. Bu, ilaç dağıtım daha fazla zaman duyarlı kontrol için izin gerekli ilaç hacmini optimize ederek prob deplasman minimize tekrarlanabilirlik ve tüm lehine olurVerilerin ow doğrudan eşleştirilmiş karşılaştırılması.
Bu teknik, elektrofizyolojik sinyallerin madde sağlama ve kayıt için bir sistem bir araya getirir. Biz 11 uyaranlara işlevsel flaş kullanarak çoklu birim faaliyet trenler uyararak üstün kollikulusu bulmak için bizim pipet kayıt kapasitesi ile etkinliğini göstermiştir. Inaktive sırasında, çoklu birim faaliyet azalmış ve giderek enjeksiyon ofset sonra kurtarıldı. Böyle Burada sunulan biri olarak Tersinir inaktivasyon teknikleri, devamsızlık veya kötü iyileşme 3. sağlayan mekanik veya kimyasal lezyonlar tekniklere göre önemli avantajlar sağlamaktadır. Eşleştirilmiş karşılaştırmalar 3 mümkündür çünkü Tersinir inaktivasyon teknikleri böylece kendine özgü farklılıkları ortadan kaldırarak, deneylerin istatistiksel olarak anlamlı güçlendirir. Biz madde teslimat ve sağlam süresi üzerinde hassas kontrol sağlayan bir maliyet etkin ve özelleştirilebilir teknik geliştirdikhedef beyin alanına sondalama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection pump (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Injection console (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Hamilton syringe | Hamliton | (80301) 701LT 10 µL SYR | Syringes between 5 and 10 μl used |
| Flexible plastic adhesive | Lepage | 393915 | The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry. |
| Glass pipettes | WPI | #TW100F-4 | Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used |
| 720 Needle Pipette Puller | Kopf | 720 | |
| Silver wire | A-M Systems, Inc. | 782500 | Bare 0.010” |
References
- Martin, J. H., Ghez, C. Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).
- Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT. The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).
- Lomber, S. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).
- Malpeli, J., Schiller, P. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).
- Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).
- Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats. Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).
- Malpeli, J. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Minville, K., Casanova, C. Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex. Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).
- Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat. Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).
