Abstract
מיקרוסקופיה intravital (IVM) היא טכניקת הדמיה אופטית רבת עוצמה שאפשרה את ההדמיה, הניטור והכימות של אירועים ביולוגיים שונים בזמן אמת ובבעלי חיים. טכנולוגיה זו התקדמה מאוד ההבנה של תהליכים פיסיולוגיים ותופעות בתיווך הפתוגן באיברים ספציפיים שלנו.
במחקר זה, IVM מוחל על כבד העכבר ופרוטוקולים נועדו תמונת in vivo מערכת הדם של הכבד ולמדוד תא דם אדום מהירות (RBC) בכלי כבד בודדים. כדי להמחיש את תת כלי שונה המאפיינים את האיבר הכבד ולבצע מדידות זרימת דם מהירות, C57Bl / 6 עכברים מוזרקים לוריד עם מגיב פלזמה ניאון שתוויות כלי הדם הקשורים בכבד. IVM מאפשר in vivo, בזמן אמת, מדידה של RBC מהירות בכלי ספציפי של עניין. הקמת מתודולוגיה זו תאפשר ללחקור פרמטרים המודינמיים כבד בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. סופו של דבר, מתודולוגיה מבוססת הדמיה זה תהיה חשובה ללימוד ההשפעה של ל ' זיהום donovani על פרמטרים המודינמיים בכבד.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מודלים זיהומיות אחרים ואיברי עכבר ועשויה להתארך עוד יותר לפרה-קלינית לבדיקה של ההשפעה של תרופה על ידי דלקת כימות השפעתו על זרימת דם.
Introduction
פרמטרים המודינמיים איברים ספציפיים הם תכונות פיסיולוגיות חשובות של כל איבר של יונקים. הפרעות בזרימת דם יכולות להיות התוצאה של דלקת וסימן לבעיות בתפקוד איבר 1. כך, זרימת דם ארגון, מבנה ותפקוד יופיעו פרמטרים קריטיים כמו לניתוח בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. הטכניקות שהיו בשימוש נפוץ לניתוח זרימת דם באיבר מסוים מכילות מספר מגבלות, כוללים מגבלת הרזולוציה של הטכניקה עצמה (למשל ההדמיה דופלר זרימת דם), היכולת למדידת זרימת דם מוחלטת בלבד (נפח דם ל יחידה משרתת איבר) (למשל טומוגרפיה אופטי קוהרנטיות) והמדידה של שינויים במהירות ממוצע באוכלוסייה גדולה והטרוגנית של כלי דם 2,3. מערכת הדם של כבד קישורים תת כלי שונה ההטרוגנית בגודל, המבנה והתפקוד שלהם. בטכנולוגיית הדמיה מחקר, מיקרוסקופיה intravital (IVM) זה מיושמת להעריך פרמטרים המודינמיים כבד in vivo, בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה ובמקביל לחשוף את המאפיינים של כלי דם הבודדים המרכיבים את האיבר הכבד. הפיתוח האחרון של טכניקת הדמיה זה חזק אופטית מאפשר לחוקר לאסוף נתונים דינמיים בחי בעלי חיים ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה. כך שהוא מאפשר להדמיה הישירה וניטור בזמן אמת של תהליכים ביולוגיים ספציפיים ומהירים in vivo, IVM מספק הזדמנות ייחודית לחוקר לכלי דם בודד תמונה, ולמדוד ולכמת את המהירות של תאי דם אדומים יחידים (RBC) בתוך נבחר במיוחד כלי כבד.
במחקר זה, יישמנו את טכניקת IVM בכבד העכבר כדי לחקור את ההשפעה של זיהום על ידי עכבר טפיל שושנת יריחו hepatotropic על פרמטרים המודינמיים כבד. L. donovaniהוא הסוכן האחראי לleishmaniasis הקרביים, מחלה קשה המתאפיינת בתגובות דלקתיות חריפות-על-כרוני ופתולוגיה שנמצאת באיברים רבים, כולל הטחול והכבד. במודל עכבר ניסיוני של leishmaniasis הקרביים, דלקת הכבד היא ואילו זיהום הטחול הוא פרוגרסיבי 4 פתרון עצמי. תוצאות אלה של זיהום שושנת יריחו ביחס לאיברים הבודדים עדיין לא הבינו לגמרי. חקירה של פרמטרים המודינמיים כבד וטחול במצבים פתולוגיים תשפוך אור חדש על יחסי גומלין מארח-טפיל והיווצרות מחלה.
מערכת המודל הניסיונית שלנו מבוססת על חשיפה והדמית הכבד של עכבר הרדים שקיבל הזרקה תוך ורידית של צבעי ניאון ספציפיים לתיוג של intravasculature הכבד. הכבד הוא איבר חיובי למיקרוסקופיה פנים-חיונית. לאחר ביצוע incisio קטןn בבטן, הכבד מוחצנת בעדינות והניח על גזה רטובה, ולאחר מכן על coverslip עם המטרה של הפחתת כל חפצי תנועה בשל פעימות לב ונשימה. הכבד ממוקם אז במבט של עדשת מיקרוסקופ. בהשוואה לצומת הטחול והלימפה הדורשת השימוש בשני מיקרוסקופיה פוטון ללימודי IVM, היתרון של הכבד הוא בארכיטקטורת 3D הומוגנית / האנטומיה שלה, המאפשרת לשימוש במיקרוסקופ confocal קונבנציונלי, עם עומק חדירה מקסימאלי של כ 50 מיקרומטר, הדמיה מיקרוסקופיה intravital 5-8.
מחקר זה מתאר שתי שיטות הדמיה עצמאיות למדידת כמותית של מהירות וזרימת דם במהירות RBC בכלי דם בודדים. בשיטה הראשונה, זרימת דם בכבד נרכשה באמצעות מצב דו-ממדי XY לאורך זמן. נתונים xyt התוצאה מנותחים באמצעות תוסף MtrackJ בתוכנת ImageJ החופשית, המאפשר למעקב של individרע"מ RBCs לאורך זמן. בשיטה השנייה, כלי דם בודדים שנבחרו ואת זרימת הדם המתאים מנותחת באמצעות מצב רכישה מהירה סריקת קו של מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal. הכלי של העניין נסרק בתדירות גבוהה לאורך הציר המרכזי שלה באמצעות קו צירי. זרימת דם המהירות אז לכמת מבוססת על ההבדל בניגוד בין אריתרוציטים כהים ללא תווית והפלזמה שכותרתו fluorescently. עוצמות הקרינה של תאי דם אדומים ופלזמה שנרכשו לאורך קו הסריקה הם זממו נגד זמן כדי להשיג פסים, הזוויות שלו הן פרופורציונליות למהירויות של RBC בודד.
מטרתו של מאמר זה היא לספק שיטה פשוטה לשחזור להדמיה ומדידת מהירות זרימת דם בתוך כלי דם בודדים של הכבד ולהפוך לזמינים את הכלים הבסיסיים לביצוע המוצלח של ניתוח עכבר, IVM וניתוחים כמותיים של המהירות RBCs הבודד. Tגישתו תאפשר לחוקרים כדי לקבל תובנות חדשות דם מהירות בתנאים פתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות ופרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אקס-מרסיי Université, צרפת. C57Bl / 6 עכברים נקבה ב8-10 שבועות היו מסחריים שהושגו ויטופלו בהתאם לכללים של Décret N ° 8 87-848, 19 אוקטובר 1987, פריז. כל הניסויים באמצעות L. טפילי donovani LD1S נערכו בהתאם לתקנות בטיחות ביולוגית מהחקיקה הצרפתית ואיחוד האירופי.
1. זיהום עכבר עם ל ' donovani Promastigote טפילים
- הכן את מדיום התרבות לתחזוקה במבחנה של ל ' טפילי promastigote donovani, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- השתמש בינוני M199. להשלים בינוני M199 עם 10% עוברי עגל בסרום (חום מומת-על 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות), 25 מ"מ HEPES pH 6.9, 12 מ"מ NaHCO 3, Glu 1 מ"מtamine, RPMI 16040 שילוב ויטמין, חומצה פולית 10 מ"מ, 100 מ"מ אדנוזין, hemin 7.6 מ"מ, 50 U / פניצילין מיליליטר ו 50 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין.
- תרבות LD1S טפילים ב 10 מיליליטר של מדיום M199 מלא ב 26 מעלות צלזיוס בבקבוק מאוורר 25 סנטימטר 2.
- באמצעות צעדי צנטריפוגה ההפרש רצופים, להכין אוכלוסייה של טפילי promastigote שמועשרים בצורות metacyclic.
- קציר תרבות טפילה שלב אמצע יומן. לסמוך על hemocytomer. Resuspend 5 x 10 5 מיליליטר / טפילים ב 10 מיליליטר של מדיום M199 מלא. לגדול התרבות טפילה בתנאים אנאירוביים עד שהם מגיעים לשלב מאוחר הנייח (בכ 5-6 ימים).
- ספין תרבות LD1S ב1,200 XG במשך 10 דקות ב 26 ° C עד גלולה טפילים שאינם metacyclic, לשחזר את supernatant ולסובב אותו שוב ב 2500 XG ב 26 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
הערה: גלולה סופית זה מועשר בטפילי promastigote metacyclic. - Resuspend גלולה ב 100 μl של PBS. להסיר aliquot קטן לקיבוע עם glutaraldehyde 25% 1/100 v: v ולספור טפילים באמצעות hemocytometer.
- לדלל את האוכלוסייה טפילה המועשר-metacyclic בPBS 1 x 10 7/100 μl. להזריק את ההשעיה הטפיל לוריד הזנב של עכבר הרדים (ראה להלן) באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 30 G. לבעלי חיים שליטה, להזריק 100 μl PBS לתוך וריד הזנב.
2. ניתוחים
- לחטא את מקום העבודה עם תרסיס חיטוי הורגות וכל מכשירי הניתוח עם אתנול 70% למשך 30 דקות.
- הכן פתרון הרדמה, בהתאם למשקלו של בעל החיים, המכיל 125 מ"ג / קילוגרם של קטמין ו12.5 מ"ג / קילוגרם של Xylazine מדולל PBS.
- לשקול את העכבר וintraperitoneally להזריק המינון המתאים של הרדמה באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 30 G.
- שמור על העכבר חם ולבדוק שהעכבר הוא anesthe לחלוטיןtized ידי צובט את כרית כף הרגל לפני שתמשיך. להזריק מחדש מחצית מינון של חומר ההרדמה בעכבר בכל 60 דקות.
- לגלח את הבטן של העכבר ולנקות אותו עם Vetedine. לעשות חתך קטן בעור והשרירים מתחת לכלוב בית החזה בצד השמאל של הבטן.
- הנח פיסת הגזה לחה בבטן ממש מתחת לאזור פתח. לחשוף את הכבד ומניח אותו על הגזה. הנח פיסת הגזה לחה מעל הכבד אחר.
- מניחים 24 x 60 מ"מ 2-150 coverslip העבה מיקרומטר, למסגרת מתכת, על הכבד להדמיה תחת מיקרוסקופ-הערובה cyanoacrylate.
- להגן על העיניים של העכבר עם גזה רטובה.
- לאחר פגישת ההדמיה, להרדימו בהרדמה על ידי נקע בצוואר הרחם.
3. מיקרוסקופית Intravital הדמיה של האדריכלות הכבד
- לבצע את ניסויי מיקרוסקופיה intravital במיקרוסקופ confocal הפוכה מצוידים בhermostatic מבוקר קאמרי, מטרת טבילת גליצרול שמן apochromatic 63X (NA 1.4), ארגון (488 ננומטר) וHeNe (543 ננומטר, 633 ננומטר) לייזרים ודיודה כחולה (405 ננומטר).
- מניחים את העכבר על הבמה של מיקרוסקופ עם coverslip מכסה את פניו הכבד על המטרה. הגדר את הטמפרטורה של החדר עד 29 מעלות צלזיוס. התאם את המיקוד באמצעות autofluorescence הכבד כדי לאפשר להדמיה של sinusoids.
- כדי להמחיש את כלי הדם, להכין פתרון של 500 מיקרוגרם BSA-Alexa 647 בדילול המלא של PBS 100 μl, לכל עכבר. להזריק את הפתרון הזה לוריד לוריד הזנב של העכבר הרדים באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 30 G.
- כדי להמחיש את גרעין תא הכבד, להכין פתרון של Hoechst 33342 בPBS. להזריק את הפתרון הזה בשעה 8 מ"ג / קילוגרם של עכבר intraperitoneally באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט G 30.
- השתמש במצב הרגיל רציף, במטרה טבילת 63X והסורק ב 400 הרץ לתמונה הכבדגרעין תא וכלי הדם בכבד. הפעל דיודה 405 ננומטר הכחולה לעירור Hoechst וליזר 633 ננומטר לעירור BSA-Alexa 647. הפעל את לייזר ננומטר ארגון 488 ולהגדיר להקת רכישה גדולה כדי להמחיש את autofluorescence הכבד.
4. מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד למדידת זרימת דם מהיר
- פתח את תוכנת LAS של המיקרוסקופ (הגרסה הצופה לאס-AF 3.1.0 לבנות 8587). בחר את מצב סורק תהודה בעת פתיחת תוכנת מיקרוסקופ.
- לחץ על כרטיסיית התצורה כדי להגדיר את החומרה. לחץ על לייזר ובחר את לייזר HeNe 633. לחץ על הגדרות ובחר ברזולוציה ביטים 12.
- לחץ על תפריט הרכישה. בחלון הגדרות מסלול הקרן, בחר 63X האובייקטיבי ולהגדיר את כוח הלייזר 633 עד 100%. הפעל את רווח אות ואת הפרמטרים שנקבעו על ידי בחירת Alexa-633 מהתפריט הנפתח PM1-3.
- בכרטיסייה לרכוש, בחר את הרכישה 'xyt'מצב. רוחב פורמט נקבע על 1,024 x 1,024. בחר את המהירות ב 8000 הרץ. בחר את חריר של 3 יחידות אווריריות. בחר גורם הזום של 3. אל תבחר במצב דו-כיווני.
5. ניתוח כמותי של RBC מהירות שימוש בתמונות xyt (שיטה 1)
- לחץ על סמל "חי" כדי להמחיש את זרימת הדם במצב חי. בחר תחום עניין ובחר כלי דם ספציפיים לניתוח. הגדר את הכלי של עניין למצב אופקי על ידי התאמת 'X', 'Y' וקואורדינטות סיבוב שדה סריקה בלוח בקרת USB.
- עצור את המצב "חי" ברגע שהספינה של עניין מוגדרת. לשנות את רוחב סט הפורמט ל1,024 x 256 במצב רכישת הגדרת חלון, קו ממוצע = 1, ממוצע מסגרת = 1, בחר "ערימות" 150. לחצו על "התחל" כדי לרכוש תמונות.
- לניתוח כמותי של RBC מהירות באמצעות התמונות "xyt" לפתוח את תוכנת ImageJ. בחר 'הקובץ'כרטיסייה בImageJ, לחץ על "פתח" ואז לבחור את הקובץ של עניין.
- לכו לתפריט "תוסף" בImageJ, בחר לוקוסים וביו-פורמטים לייבא אפשרויות. בחלון זה, בחר את ערימת צפייה פרמטרים כמו 'hyperstack'. באפשרות כדי ערימה, בחר באפשרות: "xyzct". הערה: זה פותח חלון עם כל הסדרה של רכישות.
- לחץ על 'תוספים' בתפריט ImageJ ובחר באפשרות MTrackJ. לחץ על סמל 'הוסף' בחלון הקטן ולחץ על RBC כדי לעקוב אחר. לחץ על אותו RBC בכל מסגרת הבאה ולחץ על סמל 'מידה' כדי למדוד את המהירות.
הערה: הקובץ שנוצר ניתן לשמור בפורמט .exl. - עקוב אחר מינימום של חמישה RBCs לאונייה ולנתח מינימום של שלושה כלי בודדים באותו הגודל.
6. ניתוח כמותי של RBC מהירות שימוש בתמונות קו XT (שיטה 2)
- לחץ על "חי" כדי להמחיש את F הדםנמוך במצב חי. בחר כלי דם ספציפיים לניתוח. הגדר את הכלי של עניין למצב אופקי. עצור את המצב "חי" ברגע שהספינה של עניין מוגדרת.
- בחר את מצב הסריקה 'XT "ולהגדיר את לומן של הכלי הנבחר לאורך קו הסריקה המרכזי. רוחב פורמט סט ב1,024 x 512, מהירות = 8,000Hz, ממוצע הקו = 32, זמן = 512. לחצו על "התחל" ולרכוש את תמונות קו XT.
- צור פסים לניתוח כמותי של RBC מהירות על ידי פתיחת קובץ .lif ופתיחת תמונת קו XT של עניין. בתוכנה לאס-AF, בחר "ניסויים", לפתוח את .lif ובחר את התמונה. הערה: באופן אוטומטי זה ייפתח רשם גלים.
- מדוד את הזמן (t, מתקבל על ציר Y) הנדרש לפס חלקיקים (מראה השתקפות כהה) לנסוע מרחק מסוים (ד, שהושג על ציר X) על רשם גלים זה. בחר באפשרות "לצייר קו" ולמתוח קו אופקי לפס. שים לב למרחק במיקרומטר והזמן בשניות שנוצרו בכרטיסיית התוצאה בחלק התחתון של התמונה.
- חישוב מהירות כV = מרחק / זמן שימוש בערכים המתקבלים מרשם הגלים.
- לכמת מינימום של חמישה פסי חלקיקים לכל תמונת XT ומינימום של שלושה כלי בודדים באותו הגודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הארגון האדריכלי הספציפי של sinusoids בכבד יכול להיות דמיינו מבוסס על רכוש autofluorescent של איבר זה (איור 1, לוח ב 'וג', ירוק), זריקת intraperitoneal של Hoechst לתיוג של גרעיני hepatocyte (איור 1, כחול) וההזרקה תוך ורידית של BSA ניאון להכתמה של מערכת דם בכבד (איור 1 ג, אדום). הכבד מורכב מכמה תת-סוגי כלי שונים עם פונקציות שונות ומבנים וגדלים הנעים 40-700 מיקרומטר 2 בקוטר (D) (D של כלי דם קטנים הוא בין 40-80 מיקרומטר 2 ו- D של כלי גדול הוא מעל 300 מיקרומטר 2 ). הדמיה מיקרוסקופית Intravital של הכבד מאפשרת ההדמיה ברזולוציה גבוהה של הטרוגניות והמורכבות של כלי הדם בכבד (איור 1 ג).
כדי לפקח על מהירות זרימת דם בVess הבודדאלס, שתי שיטות שונות משמשות לניתוח רכישת תמונה ונתונים של כלי דם בכבד in vivo. בשיטה הראשונה, הדמיה של זרימת הדם בכלי ריבית בזמן אמת מתבצעת באמצעות מצב סריקת xyt (סרט 1). ניתוח כמותי של המהירות של RBC בודד בספינה אחת מתבצע באמצעות תוסף MTrackJ בתוכנת ImageJ (איור 2 א ו -2). מינימום של חמישה חלקיקים לכלי הוא איתר בכלים שונים הנעים 40-80 מיקרומטר 2 של קוטר. התוצאות שהתקבלו בשיטה זו נותנת ערכים עקביים ודירות עכברים שונים ולהעריך את מהירות RBC בכלי כבד קטנים בערכים שבין 25-35 מיקרומטר / sec (איור 2 ג).
השיטה השנייה מורכבת מסריקה שוב ושוב לאורך קו מקביל לקיר הכלי, עם הקו ממוקם במרכז של לומן הכלי.איור 3 מראה סריקת מסגרת XY (פנלים משמאל) עם קו סריקת XT המקביל (לוחות מימין). המהירות של RBC פרט ניתנת על ידי V היחס = מרחק / הזמן ומחושבת באמצעות התחזיות המאונכות על X וציר Y של הפס שהושג בתמונה XT. ב3D דמויות ו3E, כל נקודת נתונים מייצגת את המהירות של RBC בודד מכלי דם קטנים או גדולים שונים שנבחרו מעכברים שונים. כפי שניתן לראות מברי השגיאה, הנתונים מראים וריאציה נמוכה יחסית בין מהירויות RBC ומצביעים על כך שזרימת דם במהירות היא באופן דרמטי מהר יותר בכלי גדול יותר מאשר בכלי דם קטנים. בנוסף, וריאציה משמעותית בערכי המהירות המתקבלים מסוגים שונים של כלי גדול נצפתה ואילו זרימת דם המהירות היא יחסית דומה על פני סוגים שונים של כלי דם קטנים. זרימת דם מדידות עם שיטה חדשה זו להפיק נתונים שניתן להשוות לנתונים המתקבלים מלתאר בעברשיטת ד באמצעות MTrackJ (השווה איור 2C איור 3D). התמונה באיור 3 ג מייצגת דוגמא טיפוסית של ניסוי הכי מוצלח שבסריקת מסגרת XY יוצרת תמונת XT בלתי לפרש. במקרה ספציפי זה, הבעיה נובעת משתי i) ההפנמה מהירה של BSA לתוך תאי האנדותל המצפים את כלי ריבית וii) את נוכחותו של צומת בין שני כלי שיט שמדאיג את זרימת הדם באזור שנבחר לרכישה. שיעור ההפנמה של מגיב הפלזמה להאנדותל המצפה את כלי הדם הוא פרמטר קריטי לשקול בעת מדידת זרימת דם במהירות, כהפנמה תשנה את האיכות של תמונת XT המציגה את הפסים. שיעור ההפנמה ביקורתי תלוי במינון של הצבע שמוזרק לוריד. באיור 4 אנו מראים כי 500 מיקרוגרם של BSA-Alexa 647 ו / או 500 kDa של dextran-FITC הם המינונים אופטימליים שShouLD לשמש לכימות של זרימת דם במהירות. מינונים אלה ליצור אות בהירה מאוד שמאפשרת זיהוי של RBC כחלקיקים כהים על רקע בהיר ולאפשר להדמיה של זרימת דם למינימום של שעה 1 ללא הפנמה של הצבע המוזרק (איור 4, פנל תחתון). לעומת זאת, 50 מיקרוגרם של BSA-Alexa 647 ו / או 500 kDa dextran-FITC (לא מוצג), תוך מתן אפשרות להדמיה של רשת כלי הדם של הכבד, הוא מינון אופטימלי למדידת זרימת דם מהירות בשל ההפנמה מהירה מאוד של הצבע, שמתחיל בשעה 5 דקות לאחר הזרקה (איור 4, פנל תחתון).
כאשר מיישם מתודולוגיה זו לכבד של בעלי חיים נגועים, ראה עלייה משמעותית במהירות זרימת הדם בהקדם לאחר זיהום שעה 1. שינוי של מהירות RBC נשמר עד לאחר זיהום 24 שעות. זה סופו של דבר מגיע לערכים נורמליםבהזרקת פוסט-טפילה 72 שעות (איור 5). כך, ניסוי זה מאמת את השימוש במתודולוגיה זו כדי לקבל תובנות חדשות על ההשפעה של מצבים פתולוגיים בפרמטרים המודינמיים כבד.
איור 1: מיקרוסקופית Intravital של כבד העכבר () ניתוח כבד של העכבר.. שטח קטן של אונת כבד חשוף לאחר ניתוח, שתי חתיכות גזה לחות ממוקמות סביבו ושקופיות היא לשים על הבטן כדי לכסות את הכבד לפני העכבר שיוצב על הבמה של מיקרוסקופ confocal. תמונה (B, C) של אזור נציג של הכבד של עכבר שאינו נגוע שמדגים את sinusoids הכבד וגדלים השונים של כלי השיט שמרכיבים את האיבר הכבד. autofluorescence הכבד מוצג בירוק. העכבר מוזרק עם Hoechst 33342 (כחולה) תווית hגרעיני epatocyte (B) והזריק עם BSA-Alexa 647 (אדום) כדי להמחיש את כלי הדם בכבד (C). ברים סולם, 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונת ניתוח כמותי של מהירות RBC מסריקת מסגרת XY שימוש בתוכנת ImageJ () נציג XY של זרימת דם בכלי כבד קטן שנרכש על ידי ההדמיה מיקרוסקופיה intravital של כבד העכבר באמצעות מצב סריקת XY המהיר: איור 2.. אזורים כהים מתאים לRBCs. בר סולם, 10 מיקרומטר. כימות (ב) למהירות של RBC יחיד באמצעות תוסף MTrackJ מImageJ. קווים (אדומים, צהוב, לבן) מייצגים את המסלול לאורך הזמן של RBC בודד. מהירות (C) RBC בסנטימטר בודדכל (ד הוא כ 50 מיקרומטר 2) כלי כבד. הגרף מגרשים את הערך של המהירות של חמישה RBCs העצמאי במעקב בכלי כבד בודדים שנבחרו מחמישה עכברים שונים (1 עד 5). D מייצג את הקוטר של כלי במיקרומטר 2. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: מדידות כבד זרימת דם על ידי מיקרוסקופית Intravital הדמיה של כלי דם באמצעות מצב סריקת קו XT נציג תמונות XY (פנלים משמאל) של כלי כבד שכותרתו עם BSA-Alexa 647 והתמונות שלהם המקבילה XT (לוחות מימין) המתקבל מ. קו-סריקה של לומן של כלי בודד המרכזי. (A, B) קטן (א) וגדולכלי כבד (B). (ג) נציגי נתונים מניסוי תת-אופטימליים מציג את ההצטלבות של שני כלי דם והפנמת BSA לתוך האנדותל. (D, E) הגרפים העלילה הערך של המהירות של שלושה RBCs העצמאי לאונייה (קטן בD וגדול בE) שנבחר מתוך חמישה עכברים שונים. D מייצג את הקוטר של כלי במיקרומטר 2. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. האפקט של המינון של פלורסנט פלזמה הצבע על הפנמתה להאנדותל בטנת Sinusoids תמונה זו עוקבת אחר ההפנמה של BSA וDextran 500 kDa להאנדותל המצפה את sinusoids, כפונקציה של זמן ומינון הזרקה.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: השפעתו של ל ' זיהום donovani על פרמטרים המודינמיים כבד. חלקות זה גרף הערכים של מהירות הדם המתקבלת מכמה כלי דם בודדים מעכברים שאינם נגועים (NI) ועכברים שהיו נגועים בL. donovani וניתח שעה 1, 24 שעות ולאחר זיהום 72 שעות (PI). כל נקודה מייצגת את הערך הממוצע של חמש מדידות RBC מהירות שהושג בכלי דם אחת של כ -50 מיקרומטר 2. בכל מצב (NI, pi 1 שעה, 24 שעות ו -72 pi pi HR) מינימאלי של שלושה עכברים נותחו לזרימת דם מהירה. הכוכבים מצביעים על הבדל משמעותי בזרימת הדם מהירה שהושג 1 שעה ו -24 pi שעות בהשוואה לעכברי NI (P <0.01, בדרך זו אנובה).
סרט 1. זמן לשגות מיקרוסקופית Intravital הדמיה של העכבר כבד. סרט 1 מתאימה לאיור 3. העכבר קיבל הזרקה של BSA-Alexa 647 לדמיין את כלי הדם. זרימת דם בשלושה כלי דם קטנים (ד '50 מיקרומטר 2) מוצגת. אזורים שחורים מתאים לRBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפיתוח האחרון של מיקרוסקופיה intravital של כבד העכבר פותח אפשרויות חדשות לחקירת תגובה הפיזיולוגית לזיהום in vivo ובזמן אמת 5,9,10. זרימת דם איברים היא פרמטר פיסיולוגי קריטי שבו לעתים קרובות שינה במחלות רבות. עם זאת, מעמדו של פרמטרים המודינמיים כבד בתנאים פיסיולוגיים ומדבקים נשאר אזור חקר גרוע. במחקר זה, המבוסס על שיטות IVM, אשר הותאמו בעבר ללימוד של כלי דם הטחול וגידול, יושמו לכמת מהירות זרימת דם בכבד בתוך כלי אחד ולמדוד מהירות RBC בודדת in vivo 11,12. מתודולוגיות משמשות כאן מסתמכות על הניגוד בין fluorophore פלזמה הזרקה תוך ורידית בעכבר, כמו BSA ניאון, ואריתרוציטים, אשר נותרו כהים. בvivo זרימת דם מדידות יש הפוטנציאל לשפר את ההבנה של פרו המחלה שלנוcesses.
כאן, שתי שיטות שמשו והשוואה למדידת זרימת דם בכלי כבד. המתודולוגיה הראשונה זה זמן רב ואנין בטווח של ניתוח נתונים כפי שהוא דורש למשתמשים לעקוב אחר תנועה באופן ידני RBC בכלי בודד באמצעות תוסף MTrackJ בתוכנת ImageJ. המתודולוגיה השנייה היא פשוטה ומהירה, כפי שהוא מורכב מהניתוח של תמונת XT של כלי דם שנוצרו מרכישת סריקת קו עם מצב סורק תהודה. שתי שיטות לתת נתונים דומים לכלי דומים. בשלב זה הוא כמעט בלתי אפשרי להשוות את הנתונים שלנו עם אחרים, כ, למיטב ידיעתנו, זרימת דם המהיר מעולם לא היה לכמת בכלי קטן כזה ובנימי סינוסואידה עכבר ברוחב של כ -10 מיקרומטר. שיטות המבוססות על IVM לאפשר רזולוציה גבוהה בXY של 500 ננומטר המאפשר הניתוח של סינוסואידה ברוחב של 10-50 מיקרומטר 13. לעומת זאת, יש לי טכניקות מבוססות דופלר רק Resol מקסימאליution של 70 מיקרומטר, ובכך להגביל את המדידה של זרימת הדם לעורקים וורידי כבד פורטל 3.
אחד הצעדים המרכזיים שהוא קריטי ליישום המוצלח של שיטות אלו היא ניתוח מוצלח ותחזוקה של העכבר הרדים במצב פיסיולוגי טוב במהלך כל פגישת ההדמיה. לשם כך, יש בזהירות לשלוט על הטמפרטורה של חדר מיקרוסקופ ולהזריק חומר הרדמה בכל שעה. עוד צעד קריטי הוא ההפנמה של מגיב הפלזמה הניאון להאנדותל הרירית שיכולה להתרחש באופן טבעי לאחר הזרקתו. הפנמה כזו תפיק תמונות XT uninterpretable ותמונות XY ניגוד האו"ם. תופעה זו תלויה במינון של הצבע המוזרק וניתן למנוע על ידי הזרקת מינון גבוה של מגיב הפלזמה (איור 4).
חשוב לציין, ההדמיה מיקרוסקופיה intravital המוצלחת של זרימת הדם בכבד דורשת השיקול דואר של כמה היבטים קריטיים. אלה כוללים את המורכבות של מערכת כלי הדם בכבד, את נוכחותו של תת-סוגים שונים של כלי דם המכילים כלי דם קטנים וגדולים עם מבנים שונים ופונקציות, תפוצה דם שונה עם שטף מהיר ואיטי ומהירויות RBC מהירות. המגבלה העיקרית של מתודולוגיה המבוססת על הניתוח של תמונת XT היא המהירות של רכישת הכלי וחוסר החלטת Z, כמו התמונה שנרכשה ב3D (xyt). באופן ספציפי יותר, שיעורי סריקת הקו של מערכות סטנדרטי יגיעו לגבול של רגישות ביחס לרכישה של כלי דם גדולים (הקוטר מעל 180 מיקרומטר 2) המתאפיינים במהירויות RBC גבוהות מאוד, שהוא במקרה עם עורקים. בכלי הגדול, מסלול RBC יכול להיות מחוץ למטוס הדמיה וכל רכיבים שנמצאים בניצב למישור הסרוק נכללים בניתוח.
H מתודולוגיה מוצגתere מייצג כלי אידיאלי עבור in vivo וכימות זמן אמת של כמה זרימת דם פרמטרים תחת מצבים פתולוגיים שונים. החקירה של פרמטרים המודינמיים כבד תשפוך אור חדש על תהליכי מחלה והיווצרות טפילה באיבר ספציפי. המאמצים שלנו כדי לקבל תובנות לתוך מערכת נימי הדם הזעירה בכבד להחיל מודל עכבר ניסיוני של זיהום שושנת יריחו פותחים את האפשרות למתאם של כמה זרימת דם פרמטרים עם כפל טפיל והתפתחות מחלה באיבר זה, בזמן אמת. פיתוח נוסף של חומרים כימיים, כלים ומתודולוגיה לאפיון המשופר של מערכת כלי הדם של הכבד על ידי IVM במהלך הזיהום הוא בעלת חשיבות רבה לחקר ההשפעה של התישבות טפילה על פרמטר פיסיולוגי זה ו, הדדי, ההשפעה של דם לזרום ב פתוגנזה שושנת יריחו. אסטרטגיה זו יכולה להיות פוטנציאל הוארכה עד זיהומיות אחרותמערכות שבן פתוגנים למקד את הכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי INSERM, האוניברסיטה אקס-מרסיי ופרס פיתוח קריירה מHFSPO מתקבל על ידי CL פורסטייה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
