Abstract
活体显微镜（IVM）是已经成为可能在实时和在活体动物各种生物事件的可视化，监测和量化一个强大的光学成像技术。该技术极大地提高了我们的生理过程，并在特定器官病原体介导的现象的理解。
在这项研究中，IVM施加到小鼠肝脏和协议设计为图像在体内肝脏的循环系统，并测量在个体肝脏血管的红血细胞（RBC）的速度。为了显现不同容器亚型表征肝器官和执行血流速度的测量，之C57B1 / 6小鼠进行静脉内注射一种荧光等离子体试剂标签的肝相关脉管。 IVM能够在体内实时，红细胞速度的测量中感兴趣的特定容器中。建立这一方法将使得能够研究生理和病理条件下肝血流动力学。最终，这种基于成像的方法将是非常重要的研究L的影响原虫感染对肝脏血流动力学。
这种方法可以适用于其它感染模型和小鼠的器官和可能进一步扩展通过量化其对血流量的影响预临床的炎症的药物的效果的测试。
Introduction
器官特异性血流动力学是任何哺乳动物器官重要的生理功能。血流异常可能是炎症的后果和器官功能障碍1的标志。因此，血液流动的组织，结构和功能出现生理和病理条件下进行分析的关键参数。已普遍用于分析在特定器官的血流量的技术包含一些限制，包括技术本身的分辨率极限（ 例 如血流的多普勒成像），为的绝对血液流量只（体积的血液每次测量的能力单元服务器官）（ 例如光学相干断层扫描）和在速度在大量异质群体血管2,3的平均变化的测量。肝脏的循环系统链接不同容器亚型是异质在它们的大小，结构和功能。在这项研究中，活体显微镜（IVM）成像技术被应用到评估肝脏血流动力学体内，实时，在高分辨率和在平行于揭露的组成该肝器官的个体的血管的特征。这个强大的光学成像技术的最新发展使研究人员收集的动物生活在高时空分辨率的动态数据。通过允许直接可视化和体内特异性和快速生物过程的实时监控，IVM提供了一个独特的机会，研究者将图像的个别血管，并测量和量化单个红血球内的特别选定的速度（RBC）肝血管。
在这项研究中，我们已经实现了在小鼠肝脏的IVM技术研究小鼠感染的肝血流动力学的嗜肝寄生虫利什曼原虫的影响。L.原虫负责内脏利什曼病，严重的疾病，其特征急性上慢性炎症反应和病理学，其存在于多个器官，包括脾和肝脏中的试剂。内脏利什曼病的实验小鼠模型中，肝感染是自我解决，而脾感染是渐进4。 利什曼原虫属感染的相对于该个体的器官，这些结果仍然没有完全了解。肝，脾血流动力学病理状态下调查将揭示宿主相互作用的寄生虫和疾病发病机制的新光源。
我们的实验模型系统是基于曝光和成像接受静脉注射特异性的荧光染料对肝intravasculature的标记麻醉小鼠的肝脏。肝脏是一个有利的器官内活体显微镜。执行一个小incisio后中的n腹部，肝脏轻轻外在并置于湿纱布，然后在与减少由于心跳和呼吸的任何运动伪影的目标盖玻片。肝脏，然后放置在显微镜透镜的视图内。相比于需要使用两个光子显微镜对IVM研究脾和淋巴结，肝的优势在于其均质3D架构/解剖学，允许使用常规共焦显微镜，具有最大穿透深度约50微米，对于活体显微镜成像5-8。
这项研究描述了两个独立的成像方法是在个别血管红细胞流速和血流速度的定量测量。在第一种方法中，使用的是XY二维的模式随时间获取肝脏血流量。所得XYT数据使用MtrackJ插件在自由的ImageJ软件，其允许individ的跟踪分析UAL红细胞随着时间的推移。在第二种方法中，一个单一的血管被选择及其相应的血流是利用共焦激光扫描显微镜的线扫描快速采集模式进行分析。感兴趣的容器被扫描在沿其中心轴的高频通过的轴线。血流速度，然后根据在未标记暗红细胞和荧光标记的等离子体之间的对比度的差量化。沿着线扫描中获得的红细胞和血浆的荧光强度对时间作图，得到的条纹，角度，其中成比例的单个红细胞的速度。
本文的目的是提供肝个别血管内的简单和可再现的方法进行成像并测量血流速度，并备妥的基本工具小鼠手术，IVM和速度的定量分析的成功表现个别红细胞。 Ť他的做法将允许研究人员获得病理状态下新的见解血流速度。
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Protocol
伦理声明：所有的动物研究是按照批准了埃克斯 - 马赛UNIVERSITE，法国的机构动物护理和使用委员会的指导方针和协议执行。雌性C57BL / 6小鼠在8 - 10周，根据DécretN°8 87-848，1987年10月19日，巴黎的规则购得和处理。全部采用L.实验原虫 LD1S寄生虫根据来自法国和欧洲联盟立法生物安全法规进行。
1.鼠标感染L.原虫鞭毛体寄生虫
- 制备培养基进行体外维持L的原虫鞭毛体寄生虫，LD1S（MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D）。
- 使用M199中。补充M199培养基，用10％胎牛血清（加热灭活在56℃，30分钟），25毫米的HEPES pH值6.9，12mM的碳酸氢钠 ，1mM的谷氨酸tamine，RPMI 16040维生素混合物，10毫叶酸，100mM的腺苷，7.6毫血红素，50U / ml青霉素和50mg / ml链霉素。
- 培养LD1S寄生虫在10ml完全M199培养基的在26℃在25 cm 2的通风烧瓶中。
- 连续使用差速离心步骤，准备一个富含亚循环前鞭毛体形式的寄生虫人口。
- 收获了数中期寄生虫文化。指望一个hemocytomer。重悬5×10 5个寄生虫/ ml的在10ml完整的M199培养基中培养。生长的寄生虫培养在厌氧条件下，直到它们到达晚固定相（在约5-6天）。
- 旋LD1S培养于1200×g离心10分钟，在26℃，以沉淀非亚循环寄生虫，回收上清液，并在2,500 xg离心再次旋转它在26℃下进行10分钟。
注意：此最终沉淀高度富集亚循环前鞭毛体寄生虫。 - 悬浮在1颗粒00微升PBS。删除一个小等份固定用25％戊二醛1/100体积：体积和使用血球计数的寄生虫。
- 稀释富集-亚循环寄生虫种群至1×10 一百分之七微升PBS中。注入寄生虫悬浮到尾静脉麻醉小鼠的（见下文），使用1ml注射器与地下30针。对于对照动物，注入100μl的PBS中至尾静脉。
2.外科手术
- 消毒用杀生物喷雾消毒的工作空间和所有的手术器械用70％乙醇30分钟。
- 制备的麻醉剂溶液，根据动物的体重，含有氯胺酮125毫克/公斤和12.5毫克/千克甲苯噻嗪的在PBS中稀释。
- 称重小鼠并通过腹膜内用1ml注射器与地下30针注射麻醉剂的适当剂量。
- 按住鼠标温暖和检查鼠标是完全anesthe通过继续之前捏垫脚级分配。重新注入在小鼠每隔60分钟的麻醉剂溶液的一半剂量。
- 刮胡子鼠标的腹部，并与Vetedine清洁。使一个小切口在腹部的左侧胸廓下皮肤和肌肉。
- 躺在刚打开面积腹部下方的一块湿纱布。暴露肝脏，将它放在纱布。躺在另一块纱布湿润肝上的。
- 放置一个24×60毫米2到150微米厚的盖玻片，氰基丙烯酸酯，结合到金属框架，在显微镜下肝脏进行可视化。
- 保护的小鼠的眼中，用湿纱布。
- 成像会话后，安乐死颈椎脱位的麻醉动物。
肝脏结构的活体3显微成像
- 开展活体显微镜实验上的倒置共聚焦显微镜配备有hermostatic受控室，复消色差63X油甘油浸没物镜（NA 1.4），氩（488纳米）和氦氖（543纳米，633纳米）激光器和蓝色二极管（405纳米）。
- 将鼠标与盖玻片覆盖肝脏面朝下放在客观的显微镜阶段。设置在腔室的温度升高到29℃。使用肝自发荧光，以允许血窦可视调整焦点。
- 为了显现血管，制备500微克的BSA-Alexa的647中的溶液稀释在100μlPBS中，每只小鼠。静脉内注射该溶液到尾静脉麻醉小鼠用1ml注射器与地下30针。
- 为了显现肝细胞核，制备的Hoechst 33342的在PBS中的溶液。注入此溶液在8毫克/公斤的小鼠腹膜内用1ml注射器与地下30针。
- 使用正常的顺序方式，63X浸没物镜和扫描仪在400赫兹到图像肝细胞核和肝脉管。打开405纳米的蓝色二极管激发赫斯特和BSA-647 Alexa的激发633纳米的激光。打开氩488 nm激光上定义大量收购乐队以可视化的肝自体荧光。
肝脏血流速度测量的活体4显微成像
- 打开显微镜（LAS-AF浏览器版本3.1.0版本8587）的LAS软件。打开显微镜软件时选择共振扫描仪模式。
- 单击配置选项卡上设置硬件。点击激光，然后选择氦氖激光633。点击设置并选择12位分辨率。
- 点击获取菜单上。在光束路径设置窗口中，选择目标63X，并成立了633激光功率为100％。激活信号增益和关闭设定的参数从PM1-3下拉菜单中选择Alexa的-633。
- 在采集选项卡中，选择“XYT”收购模式。设置格式宽1024×1024。在8000赫兹选择速度。选择3艾里单位针孔。选择3，缩放因子不要选择双向模式。
RBC速度的使用XYT图片5.定量分析（方法1）
- 点击“在线”图标，在可视化的实时模式的血流量。选择感兴趣的区域，并选择一个特定的血管进行分析。通过调整USB控制面板上的“X”，“Y”和扫描磁场旋转坐标设定感兴趣的水平位置的容器中。
- 停止“现场”模式，一旦感兴趣的容器设置。更改格式设置宽度为1024×256的采集模式设置窗口，平均线= 1，帧平均= 1，选择“栈”150点击“开始”，以获取图像。
- 对于使用红细胞速度的定量分析“XYT”图片打开ImageJ的软件。选择“文件”在ImageJ的选项卡，单击“打开”，然后选择感兴趣的文件。
- 转至ImageJ的“插件”菜单，选择基因座和生物格式导入选项。在这个窗口中，选择查看栈参数“hyperstack”。在堆叠顺序选项，选择该选项：“xyzct”。注意：这将打开一个窗口，所有的一系列收购。
- 点击ImageJ的菜单上的“插件”，然后选择MTrackJ选项。点击“添加”图标上的小窗口，点击RBC跟踪。点击相同的红细胞中的每个以下框架，然后单击“度量”图标来测量速度。
注：生成可以保存在.exl格式的文件。 - 跟踪至少每容器5 RBC和分析至少相同大小的三个单独的容器中。
RBC速度的使用XT线路图像6.定量分析（方法2）
- 点击“直播”进行可视化血˚F低在实时模式。选择一个特定的血管进行分析。设定感兴趣的水平位置的容器中。停止“现场”模式，一旦感兴趣的容器设置。
- 选择“XT'扫描模式，并设置沿行扫描所选容器的中心内腔中。定格宽1,024×512，速度= 8,000Hz，平均线= 32，时间= 512。点击“开始”，并获得XT线路图像。
- 通过打开.lif文件，并打开感兴趣的XT线图像产生条纹的红细胞速度的定量分析。在LAS-AF软件，选择“实验”，打开.lif并选择图像。注意：它会自动打开一个kymograph。
- 测量所需的颗粒条纹（表示暗反射）的时间（t，获得的在Y轴）的旅行有关此kymograph一定距离（d，所得的X轴）。选择工具“画线”水平画一条线条纹。注意在远处微米，在图像的底部中的结果标签产生秒的时间。
- 计算速度为使用从kymograph获得的值：V =距离/时间。
- 量化最少每XT图像5颗粒条纹和最小的尺寸相同的三个单独的容器中。
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Representative Results
在肝血窦的特定的架构组织可以基于这个器官（ 图1，小图B和C，绿色），腹膜内注射的Hoechst的肝细胞核的标记的自身荧光属性可视（ 图1B，蓝）和静脉注射荧光牛血清白蛋白为肝循环系统（ 图1C，红色）的染色。肝脏是由若干不同容器亚型具有不同的功能和结构以及尺寸范围从40-700微米2直径（D）的（小血管D是间40-80微米2和大血管D是大于300微米2 ）。肝脏活体显微镜成像允许可视化在高分辨率肝脉管（ 图1C）的异质性和复杂性。
监测个别贝丝血流速度ELS，两种不同的方法被用于肝脏血管体内图像采集和数据分析。在第一种方法中，使用XYT扫描模式（ 电影1）进行在感兴趣的血管的血液流动的实时成像。使用单个红细胞在单个容器中的速度的定量分析来执行所述MTrackJ插件中的ImageJ软件（ 图2A和2B）。最低每船5颗粒的跟踪在不同的容器，从40-80微米直径2的。用这种方法获得的结果给在不同的小鼠一致和可重复的值，并评估在小肝血管红细胞速度在25-35微米/秒（ 图2C）之间的值。
第二种方法包括沿平行于容器壁中的线反复扫描，与线置于血管腔的中心。图3示出的xy帧扫描（左面板）与相应的XT线扫描（右图）。单个红细胞的速度由比V =距离/时间定和使用上的XT图像获得的条纹的X和Y轴的正交投影计算。在图3D和3E中，每个数据点代表单个红细胞从来自不同的小鼠中选择不同的小或大血管的速度。如从误差线看到的，数据显示红细胞速度之间相对低的变化，并表明血流速度大大加快大血管比在小血管。此外，在来自不同类型的大血管中得到的速度值一显著变化观察到，而血流速度是在不同类型的小血管比较相似。血流量测量，这种新方法生成的数据相媲美，从先前描述获得的数据使用MTrackJ（比较图2C至图3D）D法。在图3C的图像表示一个次优实验，其中在xy帧扫描产生的未可解释XT图像的一个典型的例子。在这种特定的情况下，这个问题从两个i）所述快速内化的BSA进入内皮细胞衬里感兴趣的容器的效果和ii）两个容器是扰乱在获取所选择的区域中的血流之间的结点的存在。等离子体试剂进入内皮衬血管的内化的速率是测量血流速度时要考虑的，因为内化将改变XT图像，显示条纹的质量的关键参数。内化速率主要取决于被静脉内注射染料的剂量。在图4中我们证明了500 BSA-647 Alexa的和/或500 kDa的葡聚糖-FITC的微克是最佳剂量的寿ld的用于血液流动的速度的量化。这些剂量产生一个非常明亮的信号，允许红细胞的鉴定为背景明亮的黑色颗粒，使血流量最少1小时的可视化，而 不注入染料（ 图4，底部面板）的内化。 与此相反，50的BSA-Alexa的647和/或500 kDa的葡聚糖-FITC（未示出）的微克，同时允许对肝脏的血管网的观察，是次优的剂量用于测量血流速度因的非常快的内化染料，其开始于5分钟注射后（ 图4，下图）。
当应用这种方法对受感染动物的肝，我们观察到在血流速度尽快1小时感染后一个显著增加。红细胞速度的改变被保持长达24小时后感染。它最终达到正常值在72小时后的寄生虫注射（ 图5）。因此，该实验验证了使用这种方法来获得新的见解对肝脏血流动力学的病理条件的影响。
图1：小鼠肝脏活体显微镜鼠标（ 一 ）肝脏手术。肝叶的小面积手术后，二湿润纱布片被放置在其周围和滑动被放置在腹部以覆盖之前的小鼠被放置在一个共焦显微镜的阶段的肝脏暴露。未感染的小鼠，演示了肝血窦和不同的尺寸，其包含肝器官的血管的肝脏的代表性区域（B，C）的图像。肝自体荧光显示为绿色。鼠标注射用Hoechst 33342（蓝色）标注的Hepatocyte核（B）和注射用BSA-的Alexa 647（红色）以可视化的肝脉管（℃）。比例尺50微米请点击此处查看该图的放大版本。
图2：血液循环中通过使用快速XY扫描模式下的小鼠肝脏的活体显微镜成像收购了一家小型船只肝脏从使用ImageJ的软件一个XY帧扫描速度红细胞的定量分析 （ 一 ）代表XY图像。暗区对应的红细胞。比例尺，10微米。 （ 二）量化单一RBC的使用ImageJ的，从该MTrackJ插件的速度。线（红，黄，白）表示的轨迹上的个体的RBC的时间。在个别SM（C）RBC速度所有（D约为50微米2）肝血管。该图绘制的跟踪个别肝脏血管五个独立的红细胞从五个不同的小鼠（1-5）中选定的速度的值。 D代表在2微米的血管的直径。 请点击此处查看该图的放大版本。
从获得使用XT线扫描模式肝血流测量由血管的活体显微镜成像标记用BSA-Alexa的647和其相应的XT图像（右图）肝血管的代表性的xy图像（左图）：图3。行扫描单个容器的中心管腔。 （A，B），小（ 一 ）和大肝容器（B）中 。 （C）从一个次优实验示出两个血管的交点与BSA内在化到内皮代表性数据。 （D，E），该图绘制了来自五个不同的鼠标选择每艘三个独立的红细胞（小D和大E）的速度值。 D代表在2微米的血管的直径。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：荧光等离子体染料的剂量上及其内进内皮衬肝窦的影响该图像跟踪BSA和葡聚糖500 kDa的内化到内皮衬里的正弦，作为时间和注射的剂量的函数。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：L的影响原虫感染对肝脏血流动力学 。这个图形绘制从多个单独的血管获得来自未感染的小鼠（NI）的血液速度的值，小鼠被感染L.原虫并分析1小时，24小时和72小时后的感染（PI）的。每个点代表五红细胞速度测量在约50μm2的单一血管中得到的平均值。在每个条件（NI，1小时PI，24小时pi和72小时PI）最少三只小鼠进行了血流速度分析。星表示所得的血流速度显著差1小时和24小时圆周率相比NI小鼠（P <0.01，单向ANOVA）。
电影小鼠肝脏 。 电影1 1。时间推移活体显微镜成像对应于图3的小鼠接受注射BSA-Alexa的647的可视化的血管。显示在三个小血管（50微米2 D）的血流量。黑色区域对应于红细胞。
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Discussion
小鼠肝脏的活体显微镜的最近发展开辟了在体内和实时5,9,10生理响应于感染的调查新的可能性。器官的血流量是一个关键的生理参数是经常改变的许多疾病。然而，生理和传染性条件下肝脏血流动力学的状态仍然是一个探索不良的区域。在这项研究中，IVM为基础的方法，这在以前适于脾和肿瘤脉管系统的研究中，实施了以量化在单个容器内肝脏血流速度，并测量在体内 11,12个体红细胞速度。此处所使用的方法依赖于等离子体荧光团的小鼠静脉内注射，如荧光牛血清白蛋白之间的对比，和红细胞，这仍然是黑暗， 在体内的血流量测量必须提高我们病亲理解的电位正如事实。
在这里，两种方法被用于比较测量在肝血管的血流量。第一方法是耗时和挑剔数据分析的术语，因为它要求用户在利用MTrackJ插件中的ImageJ软件单个容器手动跟踪红细胞运动。第二方法是简单和快速的，因为它包括从一个线扫描采集与共振扫描仪模式中产生的血管的XT图像的分析。这两种方法给出可比数据类似的船只。在这个阶段，几乎是不可能的我们的数据与其他人相比，因为，据我们所知，血流速度从未量化在这样的小血管和在小鼠正弦毛细管具有大约10μm的宽度。 IVM为基础的方法允许高分辨率为500nm使得正弦曲线的分析用10-50微米13的宽度的xy。与此相反，基于多普勒的技术仅要得甲阶ution为70μm，因此限制了血液流向肝脏动脉和门静脉3的测量。
其中一个主要步骤，是对成功实施这些方法的关键是整个成像会议期间进行了成功的手术和维持麻醉鼠标在良好的生理状态。要做到这一点，必须小心地控制显微镜室的温度，并每隔一小时注射麻醉剂。另一个关键步骤是在荧光等离子体试剂到其注射后可能发生的自然内皮衬里的内化。这样的内部会产生难以解释的XT的图像和非XY对比图像。这一现象决定于注入的染料的量，并可以通过注射高剂量的血浆试剂（ 图4）被防止。
重要的是，肝脏血流成功活体显微镜成像需要第Ë考虑的几个关键环节。这些包括肝脉管系统的复杂性，含小的和大血管具有不同的结构和功能，不同的血液循环以快速和慢速通量和快速红细胞速度血管的不同亚型的存在。是基于一个XT图像的分析方法的主要限制是采集容器和缺乏Z轴分辨率的速度，当图像在三维（XYT）获得的。更具体地说，标准系统的行扫描速率达到灵敏度的限制方面取得大血管（直径高于180微米2），其特征在于非常高的RBC的速度，这是与血管的情况。在大容器中，所述红细胞的轨迹可以是出在成像平面的，并且是垂直于扫描平面的任何组件将被从分析中排除。
该方法提出ħERE表示用于体内和各种病理条件下几个血流参数实时定量的理想工具。肝脏血流动力学的调查将在一个特定的器官揭示疾病过程和寄生虫病机新光源。我们努力洞察施加到利什曼原虫属感染的实验小鼠模型的肝脏微脉管系统开辟的可能性的多个血流参数的相关性与寄生虫的乘法和疾病发展中该器官，在现实的时间。试剂，工具的进一步发展和方法对肝脏的血管系统的感染过程中的改进表征IVM是非常重要的寄生虫殖民的影响对这种生理参数的研究和，相互，血液的影响流上利什曼病机。这种策略可潜在地扩展到其他传染性系统，其中的病原体靶向肝脏。
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Acknowledgments
这项研究是由INSERM，艾克斯 - 马赛大学和HFSPO由CL弗赖斯获得职业发展奖的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
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