Abstract
Intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) वास्तविक समय में और जीवित पशुओं में विभिन्न जैविक घटनाओं के दृश्य, निगरानी और मात्रा का ठहराव संभव बना दिया है कि एक शक्तिशाली ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक है। यह तकनीक काफी शारीरिक प्रक्रियाओं और विशिष्ट अंगों में रोगज़नक़ की मध्यस्थता घटना के बारे में हमारी समझ को विकसित किया है।
इस अध्ययन में, IVM माउस जिगर के लिए लागू किया जाता है और प्रोटोकॉल तैयार कर रहे हैं छवि के लिए vivo में जिगर की संचार प्रणाली और व्यक्तिगत यकृत वाहिकाओं में लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) वेग को मापने। यकृत अंग की विशेषताएँ कि विभिन्न पोत उपप्रकार कल्पना और रक्त प्रवाह की गति मापन का प्रदर्शन करने के लिए, C57BL / 6 चूहों नसों के जिगर से जुड़े वैसक्यूलेचर लेबल है कि एक फ्लोरोसेंट प्लाज्मा अभिकर्मक इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं। IVM ब्याज की एक विशिष्ट पोत vivo में, वास्तविक समय, आरबीसी वेग की माप में सक्षम बनाता है। इस पद्धति की स्थापना के लिए यह संभव कर देगाशारीरिक और रोग की शर्तों के तहत जिगर hemodynamics की जाँच। अंततः, इस इमेजिंग आधारित पद्धति एल के प्रभाव के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण होगा यकृत hemodynamics पर डोनोवनी संक्रमण।
इस विधि अन्य संक्रामक मॉडल और माउस अंगों को लागू किया जा सकता है और आगे रक्त के प्रवाह पर उसके प्रभाव को बढ़ाता द्वारा सूजन पर एक दवा के प्रभाव का परीक्षण नैदानिक पूर्व करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Introduction
अंग-विशेष hemodynamics किसी भी स्तनधारी अंग की महत्वपूर्ण शारीरिक विशेषताएं हैं। रक्त के प्रवाह में असामान्यताएं सूजन का परिणाम और अंग में शिथिलता 1 का संकेत हो सकता है। इस प्रकार, रक्त का प्रवाह संगठन, संरचना और समारोह शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत विश्लेषण के लिए के रूप में महत्वपूर्ण पैरामीटर दिखाई देते हैं। आमतौर पर एक विशेष अंग में रक्त के प्रवाह का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि तकनीक तकनीक के ही संकल्प सीमा सहित कई सीमाओं के होते हैं (उदाहरण के लिए रक्त के प्रवाह की डॉपलर इमेजिंग), प्रति रक्त की केवल (मात्रा पूर्ण रक्त के प्रवाह की माप के लिए क्षमता एक अंग) (जैसे ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी) और रक्त वाहिकाओं 2,3 के एक बड़े और विषम जनसंख्या में गति में औसत परिवर्तन की माप की सेवा करने वाली इकाई। जिगर की संचार प्रणाली उनके आकार, संरचना और समारोह में विषम रहे हैं कि अलग पोत उपप्रकार जोड़ता है। मेंइस अध्ययन, intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) इमेजिंग तकनीक उच्च संकल्प पर वास्तविक समय में, विवो में जिगर hemodynamics मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जाता है और समानांतर में यकृत अंग शामिल है कि व्यक्ति के रक्त वाहिकाओं की विशेषताओं को उजागर करने के लिए। इस शक्तिशाली ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के हाल ही के विकास के शोधकर्ता एक उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प पर जानवरों के रहने पर गतिशील डेटा एकत्र करने के लिए अनुमति देता है। प्रत्यक्ष दृश्य और vivo में विशिष्ट और तेजी से जैविक प्रक्रियाओं के वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देकर, IVM छवि व्यक्ति रक्त वाहिकाओं के लिए शोधकर्ता के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है, और मापने के लिए और एक विशेष रूप से चयनित भीतर ही लाल रक्त कोशिकाओं के वेग (आरबीसी) यों यकृत पोत।
इस अध्ययन में, हम जिगर hemodynamics पर hepatotropic लीशमैनिया परजीवी द्वारा माउस संक्रमण के प्रभाव की जांच करने के लिए माउस जिगर में IVM तकनीक को लागू किया है। एल डोनोवनीआंत लीशमनियासिस, तीव्र-पर-जीर्ण सूजन प्रतिक्रियाओं द्वारा विशेषता एक गंभीर बीमारी है और प्लीहा और यकृत सहित कई अंगों में मौजूद है कि एक विकृति के लिए जिम्मेदार एजेंट है। आंत लीशमनियासिस के एक प्रयोगात्मक माउस मॉडल में, यकृत संक्रमण स्वयं को हल करने प्लीहा संक्रमण 4 प्रगतिशील है, जबकि है। अभी भी पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं अलग-अलग अंगों के संबंध में लीशमैनिया संक्रमण के इन परिणामों। रोग की स्थिति के तहत जिगर और तिल्ली hemodynamics की जांच मेजबान परजीवी बातचीत और रोग रोगजनन पर नया प्रकाश डाला जाएगा।
हमारे प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली को उजागर करने और यकृत intravasculature की लेबलिंग के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंगों की नसों में इंजेक्शन प्राप्त है कि एक anesthetized माउस के जिगर इमेजिंग पर आधारित है। जिगर इंट्रा-महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोपी के लिए एक अनुकूल अंग है। एक छोटे से incisio प्रदर्शन के बादएन पेट, जिगर धीरे externalized जाता है और फिर दिल की धड़कन और श्वसन की वजह से किसी भी प्रस्ताव कलाकृतियों को कम करने के लक्ष्य के साथ एक coverslip पर, गीला धुंध पर रख दिया गया। जिगर फिर एक माइक्रोस्कोप के लेंस के दृश्य के अंदर रखा गया है। IVM अध्ययन के लिए दो photon माइक्रोस्कोपी के उपयोग की आवश्यकता है, जो प्लीहा और लिम्फ नोड की तुलना में, जिगर का लाभ की एक अधिकतम प्रवेश गहराई के साथ एक पारंपरिक confocal खुर्दबीन के उपयोग के लिए अनुमति देता है कि इसके समरूप 3 डी वास्तुकला / शारीरिक रचना में निहित है लगभग 50 माइक्रोन, intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग 5-8 के लिए।
इस अध्ययन से व्यक्ति की रक्त वाहिकाओं में आरबीसी वेग और रक्त प्रवाह की गति के मात्रात्मक माप के लिए दो स्वतंत्र इमेजिंग तरीकों का वर्णन है। पहली विधि में, जिगर रक्त के प्रवाह को समय के साथ एक XY द्वि-आयामी मोड का उपयोग कर हासिल कर ली है। जिसके परिणामस्वरूप xyt डेटा individ की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है जो मुक्त ImageJ सॉफ्टवेयर में MtrackJ प्लगइन का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैंसमय के साथ यौन लाल रक्त कोशिकाओं। दूसरी विधि में, एक भी रक्त वाहिका चयन किया जाता है और अपनी इसी रक्त प्रवाह में confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की लाइन स्कैनिंग तेजी से अधिग्रहण मोड का उपयोग कर विश्लेषण किया है। ब्याज के पोत एक अक्षीय लाइन के माध्यम से अपनी केंद्रीय धुरी के साथ उच्च आवृत्ति पर जांच होती है। रक्त का प्रवाह वेग तो unlabeled अंधेरे एरिथ्रोसाइट्स और fluorescently लेबल प्लाज्मा के बीच इसके विपरीत में अंतर के आधार पर मात्रा निर्धारित है। स्कैन लाइन के किनारे का अधिग्रहण लाल रक्त कोशिकाओं और प्लाज्मा के प्रतिदीप्ति तीव्रता धारियाँ प्राप्त करने के लिए समय के खिलाफ साजिश रची है, कोण, जिनमें से एक व्यक्ति आरबीसी के वेग के लिए आनुपातिक हैं।
इस अनुच्छेद के लक्ष्य जिगर के अलग-अलग रक्त वाहिकाओं के भीतर एक इमेजिंग के लिए सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि और मापने के रक्त प्रवाह वेग प्रदान करने के लिए और माउस सर्जरी, IVM और के वेग के मात्रात्मक विश्लेषण के सफल प्रदर्शन के लिए बुनियादी उपकरण उपलब्ध कराने के लिए है व्यक्तिगत लाल रक्त कोशिकाओं। टीअपने दृष्टिकोण शोधकर्ताओं रोग की स्थिति के तहत रक्त वेग में नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए अनुमति देगा।
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Protocol
आचार बयान: सभी जानवरों के अध्ययन ऐक्स मारसैल यूनिवर्सिटी, फ्रांस के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है कि दिशा निर्देशों और प्रोटोकॉल के अनुसार में प्रदर्शन किया गया। 8 में महिला C57BL / 6 चूहों - पुराने 10 सप्ताह व्यावसायिक तौर पर Décret एन ° 8 87-848, 19 अक्टूबर, 1987, पेरिस के नियमों के अनुसार प्राप्त की है और संभाल रहे थे। एल का उपयोग करते हुए सभी प्रयोगों डोनोवनी LD1S परजीवी फ्रांसीसी और यूरोपीय संघ के कानून से जैव सुरक्षा नियमों के अनुसार में आयोजित की गई।
एल के साथ 1. माउस संक्रमण डोनोवनी Promastigote परजीवियों
- एल की इन विट्रो रखरखाव के लिए संस्कृति के माध्यम तैयार डोनोवनी promastigote परजीवी, LD1S (MHOM / एसडी / 62 / 1S-CL2D)।
- M199 मध्यम का प्रयोग करें। (30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस गर्मी निष्क्रिय) 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ M199 मध्यम पूरक, 25 मिमी HEPES पीएच 6.9, 12 मिमी 3 NaHCO, 1 मिमी ग्लूtamine, RPMI 16,040 विटामिन मिश्रण, 10 मिमी फोलिक एसिड, 100 मिमी एडेनोसाइन, 7.6 मिमी hemin, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन और 50 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन।
- संस्कृति एक 25 सेमी 2 हवादार फ्लास्क में 26 डिग्री सेल्सियस पर पूरा M199 माध्यम के 10 एमएल में परजीवी LD1S।
- लगातार अंतर centrifugation कदम का उपयोग करना, metacyclic रूपों में समृद्ध कर रहे हैं कि promastigote परजीवी की आबादी तैयार करते हैं।
- एक मध्य लॉग चरण परजीवी संस्कृति हार्वेस्ट। एक hemocytomer पर भरोसा रखो। पूरा M199 माध्यम के 10 एमएल में 5 एक्स 10 5 परजीवी / एमएल Resuspend। वे (लगभग 5-6 दिनों में) देर से स्थिर चरण तक पहुंचने तक अवायवीय स्थितियों में परजीवी संस्कृति विकसित।
- गैर-metacyclic परजीवी गोली सतह पर तैरनेवाला की वसूली और 10 मिनट के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर 2500 XG पर इसे फिर से स्पिन करने के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,200 XG पर LD1S संस्कृति स्पिन।
नोट: यह अंतिम गोली अत्यधिक metacyclic promastigote परजीवी में समृद्ध है। - 1 में गोली Resuspendपीबीएस के 00 μl। वी और एक hemocytometer का उपयोग परजीवी गिनती: 25% glutaraldehyde के साथ 1/100 वी निर्धारण के लिए एक छोटे से विभाज्य निकालें।
- पीबीएस में 1 एक्स 10 7/100 μl को समृद्ध-metacyclic परजीवी जनसंख्या पतला। एक anesthetized माउस की पूंछ नस में परजीवी निलंबन इंजेक्षन एक 30 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर (नीचे देखें)। नियंत्रण जानवरों के लिए, पूंछ नस में 100 μl पीबीएस इंजेक्षन।
2. सर्जिकल प्रक्रियाओं
- 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ एक biocidal निस्संक्रामक स्प्रे के साथ काम करने की जगह और सभी सर्जिकल उपकरणों कीटाणुरहित।
- 125 मिलीग्राम / किग्रा ketamine का और 12.5 मिलीग्राम / पीबीएस में पतला Xylazine किलो युक्त, पशु के वजन के अनुसार, एक संवेदनाहारी समाधान तैयार है।
- माउस वजन और intraperitoneally के एक 30 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर संवेदनाहारी की उचित खुराक इंजेक्षन।
- गर्म माउस रखें और माउस पूरी तरह से anesthe है कि जाँचआगे बढ़ने से पहले पैर पैड pinching द्वारा tized। माउस के लिए हर 60 मिनट में संवेदनाहारी समाधान की एक आधा खुराक पुनः इंजेक्षन।
- माउस के पेट दाढ़ी और Vetedine के साथ साफ। पेट के बाईं ओर वक्ष पिंजरे के नीचे त्वचा और मांसलता में एक छोटा सा चीरा बनाओ।
- अभी खोला क्षेत्र के नीचे पेट पर नम धुंध का एक टुकड़ा निर्धारित करना। जिगर बेनकाब और धुंध पर जगह है। कलेजे के ऊपर नम धुंध का एक टुकड़ा निर्धारित करना।
- जगह 24 x 60 मिमी 2-150 माइक्रोन मोटी coverslip, cyanoacrylate बंधुआ एक खुर्दबीन के नीचे दृश्य के लिए जिगर पर, एक धातु फ्रेम करने के लिए।
- एक गीला धुंध के साथ माउस की आँखों को सुरक्षित रखें।
- इमेजिंग सत्र के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से anesthetized जानवर euthanize।
लिवर आर्किटैक्चर 3. intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग
- पर साथ सुसज्जित एक औंधा confocal खुर्दबीन पर intravital माइक्रोस्कोपी प्रयोगों से बाहर ले जाने केhermostatic कक्ष, एक apochromatic 63X तेल ग्लिसरॉल विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.4), आर्गन (488 एनएम) और HeNe (543 एनएम, 633 एनएम) लेज़रों और एक नीले डायोड (405 एनएम) नियंत्रित।
- उद्देश्य पर जिगर चेहरा नीचे को कवर coverslip के साथ खुर्दबीन के मंच पर माउस रखें। 29 डिग्री सेल्सियस के लिए चैंबर के तापमान सेट करें। Sinusoids के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए जिगर autofluorescence का उपयोग कर फोकस समायोजित करें।
- वैसक्यूलेचर कल्पना करने के लिए, प्रत्येक माउस के लिए पीबीएस के 100 μl में पतला 500 माइक्रोग्राम बीएसए-एलेक्सा 647 का एक समाधान है, तैयार करते हैं। एक 30 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग anesthetized माउस की पूंछ नस में नसों के इस समाधान इंजेक्षन।
- जिगर सेल नाभिक कल्पना, पीबीएस में Hoechst 33342 के समाधान तैयार है। Intraperitoneally के एक 30 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग माउस के 8 मिलीग्राम / किग्रा में इस समाधान इंजेक्षन।
- छवि यकृत के लिए 400 हर्ट्ज पर सामान्य अनुक्रमिक मोड, 63X विसर्जन उद्देश्य और स्कैनर का उपयोगसेल नाभिक और जिगर वैसक्यूलेचर। हेक्स्ट उत्तेजना के लिए 405 एनएम नीले डायोड और बीएसए-एलेक्सा 647 उत्तेजना के लिए 633 एनएम लेजर चालू करें। आर्गन 488 एनएम लेजर पर मुड़ें और जिगर autofluorescence कल्पना करने के लिए एक बड़े अधिग्रहण के बैंड को परिभाषित।
रक्त प्रवाह की गति मापन के लिए जिगर के 4. intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग
- माइक्रोस्कोप (लास वायुसेना दर्शक संस्करण 3.1.0 का निर्माण 8587) के लास सॉफ्टवेयर खोलें। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर को खोलते समय गूंज स्कैनर मोड का चयन करें।
- हार्डवेयर स्थापित करने के लिए विन्यास टैब पर क्लिक करें। लेजर पर क्लिक करें और HeNe 633 लेजर का चयन करें। सेटिंग्स पर क्लिक करें और 12 बिट संकल्प का चयन करें।
- अधिग्रहण मेनू पर क्लिक करें। किरण मार्ग सेटिंग्स विंडो में, उद्देश्य 63X का चयन करें और 100% करने के लिए 633 लेजर शक्ति की स्थापना की। संकेत लाभ और PM1-3 ड्रॉप डाउन मेनू से एलेक्सा 633 का चयन करके निर्धारित मापदंडों बंद को सक्रिय करें।
- अधिग्रहण टैब में, 'xyt' अधिग्रहण का चयनमोड। 1024 X 1024 में निर्धारित प्रारूप चौड़ाई। 8000 हर्ट्ज पर गति का चयन करें। 3 हवादार इकाइयों के पिनहोल का चयन करें। द्विदिश मोड का चयन न करें 3. का एक कारक ज़ूम का चयन करें।
आरबीसी वेग 5. मात्रात्मक विश्लेषण xyt छवियाँ का उपयोग (विधि 1)
- एक लाइव मोड पर रक्त के प्रवाह में कल्पना करने के लिए 'लाइव' आइकन पर क्लिक करें। रुचि के क्षेत्र चुनें और विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट रक्त वाहिनियों का चयन करें। यूएसबी नियंत्रण कक्ष पर 'एक्स', 'वाई' और स्कैन क्षेत्र रोटेशन समन्वय का समायोजन करके क्षैतिज स्थिति के लिए ब्याज की पोत सेट करें।
- ब्याज की पोत के लिए निर्धारित है एक बार 'लाइव' मोड को बंद करें। चयन, खिड़की, रेखा औसत = 1, फ्रेम औसत = 1 की स्थापना अधिग्रहण मोड में 1024 X 256 के लिए प्रारूप तैयार चौड़ाई बदलें छवियों को प्राप्त करने के लिए 'आरंभ' पर 150 के लिए क्लिक करें "ढेर"।
- का उपयोग कर आरबीसी वेग के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए "xyt" छवियों ImageJ सॉफ्टवेयर खुला। फ़ाइल का चयन करें 'ImageJ में टैब, तो ब्याज की फ़ाइल चुनें "ओपन" पर क्लिक करें।
- ImageJ में "प्लगइन" मेनू पर जाएँ, लोकी और जैव स्वरूपों विकल्पों आयात का चयन करें। इस विंडो में, 'hyperstack' के रूप में मानकों को देखने स्टैक का चयन करें। "Xyzct": स्टैक आदेश विकल्प में, विकल्प का चयन करें। नोट: इस अधिग्रहण के सभी श्रृंखला के साथ एक विंडो खोलता है।
- ImageJ मेनू पर 'प्लगइन्स' पर क्लिक करें और MTrackJ विकल्प चुनें। छोटी सी खिड़की पर 'ऐड' आइकन पर क्लिक करें और ट्रैक करने के लिए आरबीसी पर क्लिक करें। प्रत्येक निम्नलिखित फ्रेम में ही आरबीसी पर क्लिक करें और गति को मापने के लिए 'उपाय' आइकन पर क्लिक करें।
नोट: .exl प्रारूप में बचाया जा सकता है उत्पन्न फ़ाइल। - पोत के अनुसार पांच लाल रक्त कोशिकाओं की एक न्यूनतम ट्रैक और एक ही आकार के तीन अलग-अलग जहाजों की एक न्यूनतम का विश्लेषण।
XT रेखा छवियाँ का उपयोग आरबीसी वेग 6. मात्रात्मक विश्लेषण (विधि 2)
- रक्त च कल्पना करने के लिए 'लाइव' पर क्लिक करेंलाइव मोड में कम। विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट रक्त वाहिनियों का चयन करें। क्षैतिज स्थिति के लिए ब्याज की पोत सेट करें। ब्याज की पोत के लिए निर्धारित है एक बार 'लाइव' मोड को बंद करें।
- 'एक्सटी' स्कैनिंग मोड का चयन करें और स्कैन लाइन के किनारे चयनित पोत के केंद्रीय लुमेन निर्धारित किया है। निर्धारित प्रारूप चौड़ाई 1024 X 512, गति = 8,000Hz, रेखा औसत = 32, 'आरंभ' और XT लाइन छवियों के अधिग्रहण पर समय = 512 पर क्लिक करें।
- .lif फ़ाइल खोलने और ब्याज की XT लाइन छवि खोलने के द्वारा आरबीसी वेग के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए धारियाँ उत्पन्न करता है। लास वायुसेना सॉफ्टवेयर में, "प्रयोगों" का चयन .lif खोलने के लिए और छवि का चयन करें। नोट: यह स्वचालित रूप से एक kymograph खुल जाएगा।
- इस kymograph पर (एक्स अक्ष पर प्राप्त डी,) एक निश्चित दूरी की यात्रा करने के लिए (अंधेरे प्रतिबिंब दिखा) एक कण लकीर के लिए आवश्यक (टी, वाई अक्ष पर प्राप्त) समय को मापने। उपकरण "रेखा खींचना" और लकीर क्षैतिज एक पंक्ति आकर्षित चयन करें। में दूरी नोटमाइक्रोन और छवि के नीचे परिणाम टैब में उत्पन्न सेकंड में समय है।
- Kymograph से प्राप्त मूल्यों का उपयोग वी = दूरी / समय के रूप में वेग की गणना।
- XT छवि प्रति पांच कणों धारियाँ की एक न्यूनतम और एक ही आकार के तीन अलग-अलग जहाजों की एक न्यूनतम यों।
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Representative Results
जिगर में sinusoids के विशिष्ट वास्तु संगठन कल्पना की इस अंग (चित्रा 1, पैनल बी और सी, हरा), hepatocyte नाभिक की लेबलिंग के लिए हेक्स्ट की intraperitoneal इंजेक्शन के autofluorescent संपत्ति के आधार पर किया जा सकता है (चित्रा 1 बी, नीला) और यकृत संचार प्रणाली (चित्रा 1C, लाल) के धुंधला के लिए फ्लोरोसेंट बीएसए की नसों में इंजेक्शन। व्यास में 40-700 माइक्रोन 2 (डी) से 300 माइक्रोन 2 से ऊपर है माइक्रोन 2 और बड़े जहाजों का विकास 40-80 के बीच जिगर लेकर विभिन्न कार्यों और संरचनाओं और आकारों के साथ कई अलग अलग पोत उपप्रकार से बना है (छोटे जहाजों का विकास है )। जिगर के intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग जिगर वाहिका (चित्रा 1C) की विविधता और जटिलता के उच्च संकल्प पर दृश्य के लिए अनुमति देता है।
व्यक्तिगत vess में रक्त प्रवाह की गति की निगरानी करने के लिएएल्स, दो अलग अलग तरीके विवो में जिगर रक्त वाहिकाओं की छवि के अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। पहली विधि में, ब्याज की एक बर्तन में रक्त के प्रवाह की वास्तविक समय इमेजिंग xyt स्कैनिंग मोड (1 मूवी) का उपयोग किया जाता है। एक ही बर्तन में एक व्यक्ति आरबीसी के वेग के मात्रात्मक विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर (2A चित्रा और 2 बी) में MTrackJ प्लगइन का उपयोग किया जाता है। पोत के अनुसार पांच कणों की एक न्यूनतम 40-80 माइक्रोन 2 से व्यास के लेकर अलग बर्तन में लगाया है। इस विधि के साथ प्राप्त परिणामों के विभिन्न चूहों भर में लगातार और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मूल्यों देने के लिए और 25-35 माइक्रोन / सेक (चित्रा -2) के बीच मूल्यों पर छोटे जिगर वाहिकाओं में आरबीसी वेग का मूल्यांकन।
दूसरी विधि को बार-बार पोत लुमेन के केंद्र में रखा लाइन के साथ, पोत दीवार के समानांतर एक रेखा के साथ स्कैनिंग के होते हैं।चित्रा 3 इसी XT लाइन स्कैन (सही पैनल) के साथ एक XY फ्रेम स्कैन (बाएं पैनल) से पता चलता है। एक व्यक्ति आरबीसी के वेग अनुपात वी = दूरी / समय द्वारा दिया जाता है और XT छवि में प्राप्त की लकीर की एक्स और वाई अक्ष पर orthogonal के अनुमानों उपयोग कर की गणना की जाती है। आंकड़े 3 डी और 3E में, प्रत्येक डेटा बिंदु अलग चूहों से चयनित विभिन्न छोटे या बड़े जहाजों से एक व्यक्ति को आरबीसी के वेग का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि सलाखों से देखा के रूप में, डेटा आरबीसी वेग के बीच एक अपेक्षाकृत कम भिन्नता दिखाने के लिए और रक्त प्रवाह की गति छोटे जहाजों की तुलना में बड़े जहाजों में नाटकीय रूप से तेजी से होता है कि संकेत मिलता है। रक्त प्रवाह की गति छोटे जहाजों के विभिन्न प्रकारों में अपेक्षाकृत समान है, जबकि इसके अलावा, बड़े जहाजों के विभिन्न प्रकार से प्राप्त वेग मूल्यों में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन मनाया गया। इस नई विधि के साथ रक्त प्रवाह माप पहले से वर्णन से प्राप्त आंकड़ों के बराबर है कि डेटा उत्पन्नMTrackJ (3 डी चित्र चित्रा -2 की तुलना) का उपयोग डी विधि। चित्रा -3 सी में छवि XY फ्रेम स्कैन एक संयुक्त राष्ट्र व्याख्या XT छवि उत्पन्न करता है, जिसमें एक उपअनुकूलित प्रयोग का एक विशिष्ट उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है। इस विशेष मामले में, समस्या हित के पोत अस्तर endothelial कोशिकाओं में बीएसए की तेजी internalization) दोनों मैं से परिणाम और द्वितीय) के अधिग्रहण के चयनित क्षेत्र में रक्त के प्रवाह perturbs कि दो जहाजों के बीच एक जंक्शन की उपस्थिति। रक्त वाहिका अस्तर अन्तःचूचुक में प्लाज्मा अभिकर्मक के internalization की दर रक्त प्रवाह की गति को मापने जब internalization के धारियाँ से पता चलता है कि XT छवि की गुणवत्ता को बदल देगा, के रूप में विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। internalization दर गंभीर रूप से नसों के द्वारा इंजेक्शन है कि डाई की खुराक पर निर्भर करता है। चित्रा 4 में हम 500 बीएसए-एलेक्सा 647 और / या Dextran-FITC के 500 केडीए की माइक्रोग्राम shou कि इष्टतम खुराक बताते हैं किएलडी रक्त प्रवाह की गति की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। इन खुराक एक उज्ज्वल पृष्ठभूमि के खिलाफ अंधेरे कणों के रूप में आरबीसी की पहचान के लिए अनुमति देता है कि एक बहुत ही उज्ज्वल संकेत उत्पन्न और इंजेक्शन डाई (चित्रा 4, नीचे पैनल) के internalization बिना 1 घंटे की एक न्यूनतम के लिए रक्त के प्रवाह के दृश्य के लिए सक्षम है। इसके विपरीत, 50 बीएसए-एलेक्सा 647 और / या 500 केडीए Dextran-FITC () नहीं दिखाया की माइक्रोग्राम, जिगर की संवहनी नेटवर्क के दृश्य के लिए अनुमति देता है, की वजह से बहुत तेजी से internalization के लिए रक्त का प्रवाह वेग को मापने के लिए एक उपअनुकूलित खुराक है 5 मिनट के बाद इंजेक्शन में शुरू होता है, जो डाई, (चित्रा 4, नीचे पैनल)।
संक्रमित पशुओं के जिगर के लिए इस पद्धति लागू करने, हम जल्द से 1 घंटे के बाद संक्रमण के रूप में रक्त प्रवाह वेग में एक महत्वपूर्ण वृद्धि मनाया। आरबीसी वेग के बदलाव 24 घंटे के बाद संक्रमण अप करने के लिए बनाए रखा है। यह अंततः सामान्य मूल्यों तक पहुँचता है72 घंटा के बाद परजीवी इंजेक्शन पर (चित्रा 5)। इस प्रकार, इस प्रयोग जिगर hemodynamics पर रोग की स्थिति के प्रभाव में नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए इस पद्धति का उपयोग पुष्टि की।
चित्रा 1: माउस जिगर के intravital माइक्रोस्कोपी माउस के (ए) जिगर सर्जरी।। एक जिगर पालि के एक छोटे से क्षेत्र की सर्जरी के बाद, दो नम धुंध टुकड़े इसके चारों ओर रखा जाता है और एक स्लाइड एक confocal खुर्दबीन के मंच पर रखा जा रहा है माउस के लिए पहले जिगर को कवर करने के पेट पर लगाया जाता है सामने आ रहा है। जिगर sinusoids और यकृत अंग शामिल है कि जहाजों के विभिन्न आकारों को दर्शाता है कि एक गैर संक्रमित माउस के जिगर के एक प्रतिनिधि के क्षेत्र (बी, सी) छवि। लिवर autofluorescence हरे रंग में दिखाया गया है। माउस Hoechst 33342 (नीला) एच लेबल करने के लिए इंजेक्शन के साथ किया जाता हैepatocyte नाभिक (बी) और बीएसए-एलेक्सा 647 (लाल) के साथ इंजेक्शन जिगर वाहिका (सी) कल्पना करने के लिए। स्केल सलाखों, 50 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। तेजी से XY स्कैनिंग मोड का उपयोग माउस जिगर के intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा अधिग्रहीत एक छोटे से जिगर के बर्तन में रक्त परिसंचरण की ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक XY फ़्रेम स्कैन से आरबीसी वेग के मात्रात्मक विश्लेषण (ए) प्रतिनिधि XY छवि। अंधेरे क्षेत्रों लाल रक्त कोशिकाओं के अनुरूप हैं। स्केल बार, 10 माइक्रोन। ImageJ से MTrackJ प्लगइन का उपयोग कर एक ही आरबीसी के वेग (बी) मात्रा। लाइन्स (लाल, पीला, सफेद) एक व्यक्ति आरबीसी के समय के साथ प्रक्षेपवक्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। व्यक्तिगत एस.एम. में (सी) आरबीसी वेगसभी यकृत वाहिकाओं (डी लगभग 50 माइक्रोन 2) है। ग्राफ पाँच अलग अलग चूहों (5) 1 से चयन किया गया है कि व्यक्ति जिगर वाहिकाओं में ट्रैक पांच स्वतंत्र लाल रक्त कोशिकाओं के वेग के मूल्य भूखंडों। डी माइक्रोन 2 में पोत के व्यास का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: XT रेखा स्कैनिंग मोड का उपयोग करते हुए एक रक्त वाहिका के intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा जिगर रक्त प्रवाह माप बीएसए-एलेक्सा 647 और उनके इसी XT छवियों (सही पैनल) के साथ लेबल जिगर वाहिकाओं के प्रतिनिधि XY छवियों (बाएं पैनल) एक से प्राप्त की। एक व्यक्ति पोत के केंद्रीय लुमेन की लाइन-स्कैन। (ए, बी) छोटे (ए) और बड़ेजिगर पोत (बी)। (सी) अन्तःचूचुक में दो रक्त वाहिकाओं के चौराहे और बीएसए internalization के दिखा एक उप इष्टतम प्रयोग से प्रतिनिधि डेटा। (डी, ई) रेखांकन पांच अलग चूहों से चयनित (ई में विकास में छोटे और बड़े) पोत प्रति तीन स्वतंत्र लाल रक्त कोशिकाओं के वेग के मूल्य साजिश है। डी माइक्रोन 2 में पोत के व्यास का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। Sinusoids अस्तर अन्तःस्तर में अपने internalization पर फ्लोरोसेंट प्लाज्मा डाई की खुराक का प्रभाव इस छवि समय और इंजेक्शन खुराक के एक समारोह के रूप में, sinusoids अस्तर अन्तःचूचुक में बीएसए और Dextran 500 केडीए के internalization पटरियों।इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: एल का प्रभाव लिवर hemodynamics पर डोनोवनी संक्रमण। एल से संक्रमित थे कि यह ग्राफ भूखंडों गैर संक्रमित चूहों (एनआई) से कई अलग-अलग रक्त वाहिकाओं से प्राप्त रक्त वेग के मूल्यों और चूहों डोनोवनी और 1 घंटा, 24 घंटा और 72 घंटा के बाद संक्रमण (पीआई) का विश्लेषण किया। प्रत्येक डॉट लगभग 50 माइक्रोन 2 की एक भी रक्त वाहिका में प्राप्त पाँच आरबीसी वेग माप का मतलब मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। हर हालत में (एनआई, 1 घंटा पीआई, 24 घंटा पीआई और 72 घंटा पीआई) तीन चूहों की एक न्यूनतम रक्त प्रवाह की गति के लिए विश्लेषण किया गया। सितारों प्राप्त रक्त प्रवाह की गति में एक महत्वपूर्ण अंतर से संकेत मिलता है 1 घंटा और एनआई चूहों की तुलना में 24 घंटा पीआई (पी <0.01, एक तरह से एनोवा)।
मूवी माउस जिगर। मूवी 1 1. समय चूक intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग 3 चित्रा से मेल खाती है। माउस वैसक्यूलेचर कल्पना करने के लिए बीएसए-एलेक्सा 647 का एक इंजेक्शन प्राप्त किया। तीन छोटे जहाजों (50 माइक्रोन 2 डी) में रक्त के प्रवाह में दिखाया गया है। काले क्षेत्रों आरबीसी के अनुरूप हैं।
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Discussion
माउस जिगर के intravital माइक्रोस्कोपी के हाल ही के विकास vivo में और वास्तविक समय 5,9,10 में संक्रमण की शारीरिक प्रतिक्रिया की जांच के लिए नई संभावनाओं को खोलता है। अंग रक्त के प्रवाह को अक्सर कई रोगों में बदल दिया है कि एक महत्वपूर्ण शारीरिक पैरामीटर है। हालांकि, शारीरिक और संक्रामक शर्तों के तहत जिगर hemodynamics की स्थिति एक खराब पता लगाया क्षेत्र बना हुआ है। इस अध्ययन में, पहले से तिल्ली और ट्यूमर वाहिका संरचना के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया गया है, जो IVM आधारित विधियों, एक एकल पोत के भीतर जिगर रक्त प्रवाह की गति यों और vivo 11,12 में अलग-अलग आरबीसी वेग को मापने के लिए लागू किया गया। यहां इस्तेमाल के तरीके जैसे फ्लोरोसेंट बीएसए के रूप में, माउस में नसों के द्वारा इंजेक्शन के एक प्लाज्मा फ्लोरोफोरे के बीच इसके विपरीत पर भरोसा करते हैं, और एरिथ्रोसाइट्स, काले रहते हैं जो। में vivo रक्त प्रवाह माप रोग समर्थक की हमारी समझ में सुधार करने की क्षमता हैउपकर।
यहां, दो तरीके से इस्तेमाल किया और जिगर वाहिकाओं में रक्त के प्रवाह को मापने के लिए की तुलना में थे। यह मैन्युअल ImageJ सॉफ्टवेयर में MTrackJ प्लगइन का उपयोग कर एक व्यक्ति के बर्तन में आरबीसी आंदोलन को ट्रैक करने के लिए उपयोगकर्ताओं की आवश्यकता के रूप में पहली कार्यप्रणाली समय लगता है और डेटा विश्लेषण के कार्यकाल में दुराराध्य है। यह गुंजयमान स्कैनर मोड के साथ एक पंक्ति स्कैन अधिग्रहण से उत्पन्न एक रक्त वाहिका के एक XT छवि के विश्लेषण के होते हैं के रूप में दूसरी पद्धति, सरल और तेज है। दो तरीके में भी इसी तरह के जहाजों के लिए तुलनीय आंकड़े दे। हमारी जानकारी के लिए, रक्त प्रवाह की गति लगभग 10 माइक्रोन की चौड़ाई के साथ इस तरह के छोटे जहाजों में और माउस sinusoid केशिकाओं में मात्रा निर्धारित नहीं किया गया है के रूप में इस स्तर पर यह दूसरों के साथ हमारे डेटा की तुलना करने के लिए लगभग असंभव है। IVM आधारित विधियों 10-50 माइक्रोन 13 की चौड़ाई के साथ एक sinusoid के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए 500 एनएम के xy में उच्च संकल्प अनुमति देते हैं। इसके विपरीत, डॉपलर आधारित तकनीक केवल एक अधिक से अधिक Resol है70 माइक्रोन की ution, इस प्रकार जिगर धमनियों और नसों पोर्टल 3 में रक्त के प्रवाह की माप सीमित।
इन तरीकों के सफल क्रियान्वयन के लिए महत्वपूर्ण है कि मुख्य कदमों में से एक पूरे इमेजिंग सत्र के दौरान एक सफल सर्जरी और अच्छी शारीरिक हालत में anesthetized माउस के रखरखाव है। ऐसा करने के लिए, एक सावधानी माइक्रोस्कोप चैम्बर के तापमान को नियंत्रित करने और संवेदनाहारी हर घंटे इंजेक्षन चाहिए। एक और महत्वपूर्ण कदम अपने इंजेक्शन के बाद स्वाभाविक रूप से हो सकता है कि अन्तःचूचुक अस्तर में फ्लोरोसेंट प्लाज्मा अभिकर्मक के internalization है। इस तरह के internalization के uninterpretable XT छवियों और संयुक्त राष्ट्र के विपरीत XY छवियों का उत्पादन होगा। इस घटना से इंजेक्शन डाई की खुराक पर निर्भर करता है और प्लाज्मा अभिकर्मक के एक उच्च खुराक (चित्रा 4) इंजेक्शन लगाने से रोका जा सकता है।
महत्वपूर्ण बात है, जिगर रक्त के प्रवाह के सफल intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग वीं की आवश्यकता हैकई महत्वपूर्ण पहलुओं की ई विचार। ये जिगर वाहिका प्रणाली की जटिलता, विभिन्न संरचनाओं और काम करता है, तेज और धीमी प्रवाह और तेजी से आरबीसी वेग के साथ अलग अलग रक्त परिसंचरण के साथ छोटे और बड़े जहाजों युक्त रक्त वाहिकाओं के विभिन्न उपप्रकार की उपस्थिति में शामिल हैं। छवि 3 डी (xyt) में अधिग्रहण कर लिया है के रूप में एक XT छवि के विश्लेषण पर आधारित है कि कार्यप्रणाली की मुख्य सीमा, पोत के अधिग्रहण और जेड संकल्प की कमी की गति है। अधिक विशेष रूप से, मानक सिस्टम की लाइन स्कैन दरों धमनियों के साथ मामला है, जो बहुत ही उच्च आरबीसी वेग, की विशेषता है कि (180 माइक्रोन 2 से ऊपर व्यास) बड़े रक्त वाहिकाओं के अधिग्रहण के संबंध में संवेदनशीलता का एक सीमा तक पहुँचने। बड़े पोत में, आरबीसी प्रक्षेपवक्र imaged हवाई जहाज से बाहर किया जा सकता है और स्कैन विमान को सीधा कर रहे हैं कि किसी भी घटक विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा।
कार्यप्रणाली प्रस्तुत जपहले इन विवो और विभिन्न रोग की स्थिति के तहत कई रक्त के प्रवाह को मापदंडों के वास्तविक समय मात्रा का ठहराव के लिए एक आदर्श उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। जिगर hemodynamics की जांच एक विशेष अंग में रोग प्रक्रियाओं और परजीवी रोगजनन पर नया प्रकाश डाला जाएगा। लीशमैनिया संक्रमण का एक प्रयोगात्मक माउस मॉडल को लागू जिगर microvasculature प्रणाली में अंतर्दृष्टि हासिल करने के हमारे प्रयासों को वास्तविक समय में इस अंग में परजीवी गुणा और रोग के विकास के साथ कई रक्त के प्रवाह को मापदंडों के संबंध के लिए संभावना को खोलता है। संक्रमण के दौरान IVM से जिगर की वाहिका प्रणाली में सुधार के लक्षण वर्णन के लिए अभिकर्मकों, उपकरणों के आगे विकास और कार्यप्रणाली रक्त के प्रभाव पर प्रवाह, आपस में, यह शारीरिक पैरामीटर पर परजीवी उपनिवेशवाद के प्रभाव के अध्ययन के लिए बहुत महत्व का है और लीशमैनिया रोगजनन। इस रणनीति के संभावित अन्य संक्रामक करने के लिए बढ़ाया जा सकता हैरोगज़नक़ों जिगर को लक्षित जहां सिस्टम।
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Acknowledgments
इस शोध INSERM, ऐक्स मारसैल विश्वविद्यालय और सीएल Forestier द्वारा प्राप्त HFSPO से एक कैरियर विकास पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
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