Abstract
intravital المجهري (IVM) هو تقنية التصوير البصرية القوية التي جعلت من الممكن التصور، ورصد وتقدير من الأحداث البيولوجية المختلفة في الوقت الحقيقي والحيوانات الحية. هذه التكنولوجيا قد تقدمت بشكل كبير من فهمنا للعمليات الفسيولوجية والظواهر بوساطة العوامل المسببة للأمراض في أجهزة معينة.
في هذه الدراسة، يتم تطبيق IVM للكبد الفأر وصممت بروتوكولات الصورة في الجسم الحي الدورة الدموية للكبد وقياس خلايا الدم الحمراء (RBC) سرعة في الأوعية الكبدية الفردية. لتصور أنواع فرعية مختلفة السفينة التي تميز الجهاز الكبدي وإجراء قياسات سرعة تدفق الدم، ويتم حقن C57BL / 6 الفئران عن طريق الوريد مع كاشف البلازما الفلورسنت التي تصف الأوعية الدموية المرتبطة الكبد. IVM تمكن في الجسم الحي، في الوقت الحقيقي، وقياس سرعة RBC في وعاء محددة من الفائدة. ووضع هذه المنهجية تجعل من الممكن لالتحقيق في ديناميكا الدم في الكبد في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. في نهاية المطاف، وهذا المنهج القائم على التصوير سيكون مهما لدراسة تأثير L. عدوى اللشمانيا الحشوية على ديناميكا الدم الكبدية.
هذه الطريقة يمكن تطبيقها على نماذج المعدية الأخرى وأجهزة الماوس ويمكن أن تمتد أيضا إلى ما قبل السريرية اختبار تأثير المخدرات على الالتهاب عن طريق قياس تأثيرها على تدفق الدم.
Introduction
ديناميكا الدم الجهاز محددة هي السمات الفسيولوجية الهامة من أي جهاز الثدييات. شذوذ في تدفق الدم قد يكون نتيجة للالتهاب، وعلامة على ضعف الجهاز 1. وهكذا، وتدفق الدم التنظيم والبنية والوظيفة تظهر المعلمات الحرجة بالنسبة للتحليل في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. التقنيات التي استخدمت عادة لتحليل تدفق الدم في جهاز معين تحتوي على العديد من القيود، بما في ذلك الحد حل هذه التقنية نفسها (مثل التصوير دوبلر من تدفق الدم)، والقدرة على قياس المطلق تدفق الدم فقط (حجم الدم في وحدة خدمة جهازا) (على سبيل المثال التماسك البصري التصوير المقطعي) وقياس متوسط التغير في السرعة في عدد كبير من السكان وغير متجانسة من الأوعية الدموية 2،3. ويربط نظام الدورة الدموية والكبد فرعية سفينة المختلفة التي هي غير متجانسة في حجمها، البنية والوظيفة. فييتم تطبيق هذه الدراسة، intravital المجهري (IVM) تكنولوجيا التصوير لتقييم ديناميكا الدم الكبد في الجسم الحي، في الوقت الحقيقي، وبدقة عالية وبالتوازي للكشف عن خصائص الأوعية الدموية الفردية التي تشكل الجهاز الكبدي. التطورات الأخيرة في هذه التقنية التصوير الضوئي قوية تسمح للباحث لجمع البيانات الديناميكية على الحيوانات التي تعيش في القرار المكانية والزمانية عالية. من خلال السماح للرؤية مباشرة ومراقبة الوقت الحقيقي من العمليات البيولوجية محددة وسريعة في الجسم الحي، ويوفر IVM فرصة فريدة للباحث للسفن صورة الدم الفردية، وقياس وتحديد سرعة خلايا الدم الحمراء واحدة (RBC) ضمن مختارة خصيصا سفينة الكبدية.
في هذه الدراسة، قمنا بتنفيذ تقنية IVM في كبد الفأر لدراسة تأثير الإصابة الماوس عن طريق طفيل الليشمانيا كبدي التوجه على ديناميكا الدم في الكبد. L. اللشمانيا الحشويةهو العامل المسؤول عن داء الليشمانيات الحشوي، وهو مرض شديد يتميز الاستجابات الالتهابية الحادة على اساس المزمنة وأمراض موجودة في أجهزة متعددة، بما في ذلك الطحال والكبد. في نموذج الفأر تجريبية من داء الليشمانيات الحشوي، وإصابة الكبد في حين أن العدوى الطحال هو التدريجي 4-حل ذاتيا. هذه النتائج من العدوى الليشمانيا فيما يتعلق الأجهزة الفردية لا تزال غير مفهومة تماما. والتحقيق في الكبد والطحال ديناميكا الدم في ظل الظروف المرضية تسليط الضوء من جديد على التفاعلات المضيف الطفيلي والتسبب بالمرض.
ويستند نظامنا النموذج التجريبي على كشف وتصوير الكبد من الماوس تخدير التي تلقت حقن في الوريد من الأصباغ الفلورية محددة لوضع العلامات على intravasculature الكبدي. الكبد هو عضو مواتية للفحص المجهري داخل الحيوي. بعد إجراء incisio صغيرن في البطن، وتخريجها بلطف الكبد ويوضع على شاش مبللة، ثم على ساترة بهدف الحد من أي الحركة الفنية بسبب ضربات القلب والتنفس. ثم يتم وضع الكبد في ضوء عدسة المجهر. بالمقارنة مع العقدة الليمفاوية والطحال والتي تتطلب استخدام اثنين من الفوتون المجهري للدراسات IVM، والاستفادة من الكبد تكمن في هندسته المعمارية 3D متجانسة / التشريح التي تسمح لاستخدام المجهر متحد البؤر التقليدية، مع عمق الاختراق الحد الأقصى ل ما يقرب من 50 ميكرون، لحيوي داخلي المجهري التصوير 5-8.
توضح هذه الدراسة طريقتين التصوير مستقلة لقياس كمي لRBC السرعة وسرعة تدفق الدم في الأوعية الدموية الفردية. في الطريقة الأولى، يتم الحصول على تدفق الدم في الكبد باستخدام وضع ثنائية الأبعاد س ص على مر الزمن. ويتم تحليل البيانات XYT الناتجة باستخدام البرنامج المساعد MtrackJ في برنامج يماغيج مجانا، والذي يسمح لتتبع individالسياقية كرات الدم الحمراء مع مرور الوقت. في الطريقة الثانية، يتم تحديد وعاء دموي واحدة ويتم تحليل المقابلة تدفق الدم وذلك باستخدام خط المسح وضع الاستحواذ السريع للمتحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي. يتم فحص السفينة من الاهتمام في وتيرة عالية على طول المحور المركزي من خلال خط محوري. ثم يتم كميا سرعة تدفق الدم على أساس الفرق في التباين بين كريات الدم الحمراء الداكنة غير المسماة والبلازما fluorescently المسمى. يتم رسم شدة مضان من كرات الدم الحمراء والبلازما المكتسبة على طول خط المسح الضوئي مع الزمن للحصول على الشرائط، وزوايا وهي يتناسب مع سرعات لRBC الفردية.
والهدف من هذه المقالة هو توفير طريقة بسيطة وقابلة للتكرار للتصوير وقياس سرعة تدفق الدم داخل الأوعية الدموية الفردية الكبد وإتاحة الأدوات الأساسية لنجاح أداء جراحة الماوس، IVM والتحليلات الكمية للسرعة كرات الدم الحمراء الفردية. تيسوف نهجه تسمح للباحثين لاكتساب رؤى جديدة في سرعة الدم في ظل ظروف مرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: تم تنفيذ جميع الدراسات على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من إيكس مرسيليا جامعة، فرنسا. الإناث C57BL / 6 الفئران في 8-10 أسابيع من العمر تم الحصول عليها تجاريا والتعامل معها وفقا لقواعد Décret N ° 8 87-848، 19 أكتوبر 1987، باريس. كل التجارب باستخدام L. أجريت طفيليات اللشمانيا الحشوية LD1S وفقا للوائح السلامة الأحيائية من التشريع الفرنسي والاتحاد الأوروبي.
1. ماوس العدوى مع L. اللشمانيا الحشوية المشيقة الطفيليات
- تحضير مستنبت للصيانة في المختبر من L. اللشمانيا الحشوية الطفيليات المشيقة، LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- استخدام M199 المتوسطة. تكملة M199 المتوسطة مع 10٪ مصل العجل الجنين (المعطل للحرارة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة)، 25 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 6.9، 12 ملي NaHCO 3، 1 ملم غلوtamine، RPMI 16040 فيتامين المزيج، 10 ملم حمض الفوليك، و 100 ملي الأدينوزين، 7.6 ملي هيمن، 50 U / البنسلين مل و 50 ملغ / مل الستربتومايسين.
- ثقافة LD1S الطفيليات في 10 مل من المتوسط M199 في 26 ° C في قارورة التهوية 25 سم 2.
- باستخدام المتعاقبة الخطوات الطرد المركزي التفاضلية، وإعداد السكان من الطفيليات المشيقة أن يتم إثراء بأشكال metacyclic.
- حصاد ثقافة مرحلة الطفيلي سجل منتصف. الاعتماد على hemocytomer. و resuspend 5 × 10 5 الطفيليات / مل في 10 مل من المتوسط M199. تنمو ثقافة الطفيلي في الظروف اللاهوائية حتى يصلوا إلى مرحلة ثابتة في وقت متأخر (في حوالي 5-6 أيام).
- تدور ثقافة LD1S في 1200 x ج لمدة 10 دقيقة في 26 ° C لتكوير الطفيليات غير metacyclic، واستعادة طاف وتدور مرة أخرى في 2500 x ج في 26 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: عالي التخصيب هذه بيليه النهائي في الطفيليات المشيقة metacyclic. - resuspend الكرية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إزالة قسامة صغيرة لتثبيت مع 25٪ غلوتارالدهيد 1/100 الخامس: الخامس والاعتماد الطفيليات باستخدام عدادة الكريات.
- تقليص السكان الطفيلي التخصيب metacyclic إلى 1 × 10 7/100 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني. حقن تعليق الطفيلي في الوريد ذيل الماوس تخدير (انظر أدناه) باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30 G. للحيوانات السيطرة، وضخ 100 ميكرولتر PBS في الوريد الذيل.
2. العمليات الجراحية
- تطهير مساحة العمل مع رذاذ مطهر مبيد الأحياء وجميع الأدوات الجراحية مع الايثانول 70٪ لمدة 30 دقيقة.
- يعد حل مخدر، وفقا لوزن الحيوان، والتي تحتوي على 125 ملغم / كغم من الكيتامين و 12.5 ملغم / كغم من زيلازين مخففة في برنامج تلفزيوني.
- وزن الماوس والبريتونى حقن الجرعة المناسبة من مخدر باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30 G.
- الحفاظ على الماوس دافئة وتأكد من أن الفأر هو anesthe تماماtized عن طريق معسر لوحة القدم قبل المتابعة. إعادة ضخ جرعة نصف الحل مخدر في الماوس كل 60 دقيقة.
- حلق البطن الماوس، وتنظيفه مع Vetedine. إجراء شق صغير في الجلد والعضلات تحت القفص الصدري على الجانب الأيسر من البطن.
- وضع قطعة من الشاش الرطب على البطن أسفل منطقة فتحها. فضح الكبد ووضعه على الشاش. وضع آخر قطعة من الشاش الرطب فوق الكبد.
- وضع 24 × 60 مم 2-150 ميكرون ساترة سميكة، إلى إطار معدني، على الكبد لتصور تحت المجهر المستعبدين cyanoacrylate.
- حماية العينين من الفأرة مع الشاش الرطب.
- بعد جلسة التصوير، والموت ببطء الحيوان تخدير قبل خلع عنق الرحم.
3. حيوي داخلي المجهري التصوير من العمارة الكبد
- تنفيذ التجارب intravital المجهري على مجهر متحد البؤر مقلوب مجهزة فيتسيطر hermostatic غرفة، وهو 63X الهدف الجلسرين النفط الغمر لامزيغة (NA 1.4)، الأرجون (488 نانومتر) والحنة (543 نانومتر، 633 نانومتر) وأشعة الليزر والصمام الثنائي الأزرق (405 نانومتر).
- ضع الماوس على مرحلة من مراحل المجهر مع ساترة تغطية الوجه الكبد أسفل على الهدف. ضبط درجة حرارة الغرفة إلى 29 درجة مئوية. ضبط التركيز باستخدام تألق ذاتي الكبد للسماح التصور من الجيوب.
- لتصور الأوعية الدموية، وإعداد محلول من 500 ميكروغرام BSA-اليكسا 647 مخففة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، لكل الماوس. حقن هذا الحل عن طريق الوريد إلى الوريد ذيل الماوس تخدير باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30 G.
- لتصور الخلية نواة الكبد، وإعداد محلول هويشت 33342 في برنامج تلفزيوني. حقن هذا الحل في 8 ملغ / كغ من الماوس البريتونى باستخدام حقنة 1 مل مع 30 G الإبرة.
- استخدام وضع متسلسل طبيعي، والهدف الغمر 63X والماسح الضوئي في 400 هرتز لصورة الكبدينوى الخلايا والأوعية الدموية في الكبد. بدوره على 405 الصمام الثنائي الأزرق نانومتر لهويشت الإثارة والليزر 633 نانومتر لBSA-اليكسا 647 الإثارة. بدوره على نانومتر ليزر الأرجون 488 وتعريف الفرقة الاستحواذ الكبيرة لتصور تألق ذاتي الكبد.
4. حيوي داخلي المجهري التصوير من الكبد لقياس سرعة تدفق الدم
- فتح البرنامج LAS المجهر (LAS-AF المشاهد النسخة 3.1.0 بناء 8587). تحديد وضع الماسح الضوئي صدى عند فتح البرنامج المجهر.
- انقر فوق علامة التبويب تكوين لضبط الأجهزة. انقر على الليزر وتحديد الليزر الحنة 633. انقر على الإعدادات واختيار 12 بت القرار.
- انقر على قائمة الاستحواذ. في إطار الإعدادات مسار شعاع، حدد 63X موضوعي وانشاء قوة 633 الليزر إلى 100٪. تفعيل كسب إشارة وخارج مجموعة المعلمات عن طريق اختيار اليكسا-633 من القائمة المنسدلة PM1-3.
- في علامة التبويب اكتساب، حدد اقتناء "XYT"واسطة. تعيين عرض شكل في 1024 س 1024. تحديد السرعة 8000 هرتز. حدد الثقب من 3 وحدات متجدد الهواء. تحديد عامل التكبير 3. لا تحديد وضع ثنائي الاتجاه.
5. التحليل الكمي من RBC السرعة باستخدام XYT صور (الطريقة 1)
- انقر على أيقونة "لايف" لتصور تدفق الدم على طريقة العيش. اختيار مجال الاهتمام واختر أحد الأوعية الدموية محددة للتحليل. ضبط السفينة التي تهم وضع أفقي عن طريق ضبط 'X'، 'Y' ومسح دوران الحقل تنسق على لوحة التحكم USB.
- وقف الوضع "لايف" مرة واحدة تم تعيين السفينة من الفائدة. تغيير عرض مجموعة التنسيق إلى 1024 × 256 في وضع اكتساب وضع الإطار، خط متوسط = 1، والإطار المتوسط = 1، حدد "المداخن" 150. اضغط على "ابدأ" للحصول على الصور.
- للتحليل الكمي من RBC السرعة باستخدام صور "XYT" فتح البرنامج يماغيج. حدد "ملف"التبويب في يماغيج، انقر فوق "فتح" ثم اختيار الملف من الفائدة.
- انتقل إلى القائمة "المساعد" في يماغيج، حدد LOCI وبيو تنسيقات استيراد الخيارات. في هذا الإطار، حدد كومة عرض المعلمات باسم 'hyperstack. في الخيار أجل المكدس، حدد الخيار: "xyzct". ملاحظة: هذا يفتح نافذة مع جميع سلسلة من عمليات الاستحواذ.
- انقر على 'الإضافات' في القائمة يماغيج واختر الخيار MTrackJ. انقر على أيقونة "إضافة" على نافذة صغيرة وانقر على RBC لتتبع. انقر على نفس RBC في كل إطار التالية وانقر على أيقونة "قياس" لقياس السرعة.
ملاحظة: الملفات التي تم إنشاؤها يمكن حفظها في شكل .exl. - تتبع ما لا يقل عن خمس كرات الدم الحمراء لكل سفينة وتحليل ما لا يقل عن ثلاث سفن الفردية من نفس الحجم.
6. التحليل الكمي من RBC السرعة عن طريق الخط XT صور (أسلوب 2)
- انقر على 'مباشر' لتصور و الدمانخفاض في طريقة العيش. حدد أحد الأوعية الدموية محددة للتحليل. ضبط السفينة التي تهم الوضع الأفقي. وقف الوضع "لايف" مرة واحدة تم تعيين السفينة من الفائدة.
- حدد "XT" وضع المسح وتعيين التجويف المركزي للسفينة مختارة على طول خط المسح الضوئي. مجموعة العرض شكل في 1024 X 512، السرعة = 8،000Hz، خط المتوسط = 32، الوقت = 512. اضغط على "ابدأ" والحصول على صور خط XT.
- توليد الشرائط للتحليل الكمي من RBC السرعة عن طريق فتح ملف .lif وفتح صورة خط XT من الفائدة. في مجال البرمجيات LAS-AF، حدد "التجارب"، افتح .lif واختيار الصورة. ملاحظة: وسوف تفتح تلقائيا مخطاط التموج.
- قياس الوقت (ر، وحصل على المحور Y) المطلوبة لخط الجسيمات (يظهر انعكاس الظلام) للسفر مسافة معينة (د، وحصل على محور X) على هذا مخطاط التموج. حدد أداة "لرسم خط" ورسم خط أفقي على خط. لاحظ المسافة فيميكرون والوقت بالثواني ولدت في علامة التبويب نتيجة في الجزء السفلي من الصورة.
- حساب سرعة كما V = المسافة / الزمن باستخدام القيم التي تم الحصول عليها من مخطاط التموج.
- تحديد ما لا يقل عن خمسة جزيئات الشرائط في صورة XT وما لا يقل عن ثلاث سفن الفردية من نفس الحجم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تنظيم المعمارية محددة من الجيوب في الكبد يمكن تصور يستند إلى خاصية autofluorescent هذا الجهاز (الشكل 1، لوحة B و C والأخضر)، وحقن داخل الصفاق من هويشت لوضع العلامات على الكبدية النوى (1B الشكل، اللون الأزرق) والحقن في الوريد من BSA الفلورسنت لتلطيخ الدورة الدموية الكبدية (الشكل 1C، أحمر). ويتكون الكبد من عدة أنواع فرعية سفينة مختلفة مع وظائف وهياكل مختلفة وأحجام تتراوح 40-700 ميكرون في القطر 2 (D) (D السفن الصغيرة ما بين 40-80 ميكرون 2 و D من السفن الكبيرة فوق 300 ميكرون 2 ). التصوير intravital المجهري للكبد يسمح لتصور بدقة عالية من التجانس وتعقيد الأوعية الدموية الكبد (الشكل 1C).
لمراقبة سرعة تدفق الدم في vess الفرديةإلس، وتستخدم اثنين منهجيات مختلفة لاقتناء الصور وتحليل البيانات من الأوعية الدموية في الكبد في الجسم الحي. في الطريقة الأولى، يتم تنفيذ الوقت الحقيقي التصوير من تدفق الدم في وعاء من فوائد باستخدام طريقة المسح الضوئي XYT (فيلم 1). التحليل الكمي للسرعة لRBC الفردية في سفينة واحدة تتم باستخدام البرنامج المساعد MTrackJ في برنامج يماغيج (الشكل 2A و 2B). وتتبع ما لا يقل عن خمسة جزيئات لكل سفينة في الأوعية مختلفة تتراوح 40-80 ميكرون 2 من القطر. النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة تعطي القيم متسقة وقابلة للتكرار في جميع أنحاء الفئران مختلفة وتقييم سرعة RBC في الأوعية الكبد صغيرة في القيم بين 25-35 ميكرون / ثانية (الشكل 2C).
يتكون الطريقة الثانية لمسح مرارا وتكرارا على طول خط مواز لجدار الوعاء الدموي، مع خط وضعها في وسط التجويف السفينة.ويبين الشكل 3 تفحص إطار س ص (لوحات اليسار) مع المقابلة خط XT المسح الضوئي (لوحات اليمين). يتم إعطاء سرعة لRBC فردي من قبل نسبة V = المسافة / الزمن وتحتسب باستخدام توقعات المتعامدة على X ومحور Y من خط تم الحصول عليها في صورة XT. في أرقام 3D و3E، كل نقطة تمثل البيانات سرعة من RBC الأفراد من مختلف السفن الصغيرة أو الكبيرة مختارة من الفئران مختلفة. كما يرى من أشرطة الخطأ، وتشير البيانات إلى تباين منخفضة نسبيا بين السرعات RBC وتشير إلى أن سرعة تدفق الدم بشكل كبير أسرع في السفن الكبيرة من في السفن الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ وجود تفاوت كبير في قيم سرعة الحصول عليها من أنواع مختلفة من السفن الكبيرة في حين أن سرعة تدفق الدم مشابه نسبيا في أنواع مختلفة من السفن الصغيرة. قياس تدفق الدم مع هذا الأسلوب الأحدث تولد بيانات قابلة للمقارنة لبيانات تم الحصول عليها من وصف سابقاطريقة د باستخدام MTrackJ (قارن الشكل 2C إلى الشكل 3D). الصورة في الشكل 3C تمثل مثالا نموذجيا للتجربة دون المستوى الأمثل في أي إطار المسح س ص يولد صورة XT برنامج الأمم المتحدة للالتأويل. في هذه الحالة بالذات، فإن المشكلة النتائج من كلا ط) تدخيل سريع من BSA في الخلايا البطانية المبطنة للسفينة من الفائدة والثاني) وجود تقاطع بين سفينتين أن يشوش على تدفق الدم في المنطقة المحددة الشراء. معدل استيعاب الكاشف البلازما في البطانة بطانة الأوعية الدموية معلمة حرجة في الاعتبار عند قياس سرعة تدفق الدم، واستيعاب سوف يغير من جودة الصورة XT التي تظهر الشرائط. معدل استيعاب يعتمد بشكل كبير على جرعة من الصبغة التي يتم حقنها عن طريق الوريد. في الشكل (4) وتبين لنا أن 500 ميكروغرام من BSA-اليكسا 647 و / أو 500 كيلو دالتون من ديكستران-FITC هي الجرعات المثالية التي شواستخدامها دينار لتقدير سرعة تدفق الدم. هذه الجرعات تولد إشارة ساطعة جدا التي تسمح لتحديد RBC كما جسيمات داكنة على خلفية مشرقة وتمكن التصور من تدفق الدم لمدة لا تقل عن 1 ساعة دون استيعاب للصباغة حقن (الشكل 4، اللوحة السفلية). في المقابل، 50 ميكروغرام من BSA-اليكسا 647 و / أو 500 كيلو دالتون ديكستران-FITC (لا يظهر)، في حين يسمح لتصور شبكة الأوعية الدموية في الكبد، هو جرعة دون المستوى الأمثل لقياس سرعة تدفق الدم بسبب استيعاب سريع جدا الصبغة، التي تبدأ في 5 دقائق بعد الحقن (الشكل 4، اللوحة السفلية).
عند تطبيق هذه المنهجية إلى الكبد من الحيوانات المصابة، لاحظنا زيادة كبيرة في تدفق سرعة الدم في أقرب وقت 1 ساعة بعد العدوى. يتم الحفاظ على تغيير سرعة RBC تصل إلى 24 ساعة بعد العدوى. يصل في نهاية المطاف القيم الطبيعيةفي 72 ساعة حقن آخر للطفيليات (الشكل 5). وهكذا، هذه التجربة بالتحقق من صحة استخدام هذه المنهجية لاكتساب رؤى جديدة لتأثير الظروف المرضية على ديناميكا الدم في الكبد.
الشكل 1: حيوي داخلي المجهري للكبد الفأر (A) جراحة الكبد من الفأرة. تتعرض منطقة صغيرة من الفص الكبد بعد الجراحة، يتم وضع قطعتين من الشاش رطبة من حوله، ويتم وضع شريحة على البطن لتغطية الكبد قبل الماوس وضعه على مسرح المجهر متحد البؤر. (B، C) صورة من منطقة تمثيلية من كبد فأر غير المصاب الذي يوضح الجيوب الكبد وأحجام مختلفة من السفن التي تتكون من الجهاز الكبدي. ويرد تألق ذاتي الكبد باللون الأخضر. يتم حقن الفأر مع هويشت 33342 (الأزرق) لتسمية حنوى epatocyte (B) وحقن BSA-اليكسا 647 (الحمراء) لتصور الأوعية الدموية الكبد (C). أشرطة النطاق، 50 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحليل الكمي للRBC السرعة من مسح الإطار س ص باستخدام برنامج يماغيج (A) صورة س ص التمثيلية للدوران الدم في وعاء الكبد الصغيرة التي اكتسبها التصوير intravital المجهري للكبد الفأر باستخدام وضع المسح س ص سريع. المناطق المظلمة تتوافق مع كرات الدم الحمراء. شريط النطاق، 10 ميكرومتر. (B) الكمي لسرعة وRBC واحد باستخدام البرنامج المساعد MTrackJ من يماغيج. خطوط (أحمر، أصفر، أبيض) تمثل مسار مرور الوقت من RBC الفردية. (C) RBC السرعة في SM الفرديةجميع (D ما يقرب من 50 ميكرون 2) السفن الكبدية. الرسم البياني المؤامرات قيمة سرعة خمس كرات الدم الحمراء مستقلة تتبع السفن في الكبد الفردية التي تم اختيارهم من خمسة الفئران مختلفة (1-5). D يمثل قطر السفينة في ميكرون 2. اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: القياسات الكبد تدفق الدم عن طريق حيوي داخلي المجهري التصوير في أحد الاوعية الدموية باستخدام الوضع XT الخط الضوئي الصور س ص ممثل (لوحات اليسار) السفن الكبد المسمى مع BSA-اليكسا 647 وصورهم XT المقابلة (لوحات اليمين) التي تم الحصول عليها من. خط المسح من التجويف المركزي للسفينة على حدة. (A، B) صغير (A) وعلى العمومسفينة الكبد (B). (C) بيانات تمثيلية من تجربة دون المستوى الأمثل يظهر تقاطع اثنين من الأوعية الدموية وBSA الداخلي في البطانة. (D، E) والرسوم البيانية مؤامرة قيمة سرعة ثلاث كرات الدم الحمراء مستقلة لكل سفينة (الصغيرة والكبيرة في D في E) مختارة من خمسة الفئران مختلفة. D يمثل قطر السفينة في ميكرون 2. اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: تأثير جرعة من البلازما صبغة الفلورسنت على التطبع لها في البطانة بطانة الجيوب مسارات هذه الصورة تدخيل BSA وديكستران 500 كيلو دالتون في البطانة بطانة الجيوب، بوصفها وظيفة من الوقت وجرعة الحقن.الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تأثير L. عدوى اللشمانيا الحشوية على ديناميكا الدم الكبد. هذا الرسم البياني المؤامرات قيم سرعة الدم التي تم الحصول عليها من عدة الأوعية الدموية الفردية من الفئران غير المصابة (NI) والفئران التي كانت مصابة L. اللشمانيا الحشوية ثم تحليل 1 ساعة، 24 ساعة و 72 ساعة بعد العدوى (باي). كل نقطة تمثل القيمة المتوسطة من خمسة قياسات سرعة RBC التي تم الحصول عليها في أحد الأوعية الدموية واحدة من حوالي 50 ميكرون 2. في كل حالة (NI، 1 ساعة بي، بي 24 ساعة و 72 ساعة بي) وقد تم تحليل ما لا يقل عن ثلاثة الفئران لسرعة تدفق الدم. النجوم تشير إلى وجود اختلاف كبير في سرعة تدفق الدم التي تم الحصول عليها 1 ساعة و 24 ساعة بي بالمقارنة مع الفئران NI (P <0.01، اتجاه واحد أنوفا).
الفيلم 1. الوقت الفاصل بين حيوي داخلي المجهري التصوير من كبد الفأر. الفيلم 1 يتوافق مع الشكل 3. وتلقى الماوس حقنة من BSA-اليكسا 647 لتصور الأوعية الدموية. يظهر تدفق الدم في ثلاث سفن صغيرة (D من 50 ميكرون 2). المناطق السوداء تتوافق مع RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التطورات الأخيرة في intravital المجهري للكبد الفأر تفتح آفاقا جديدة للتحقيق في الاستجابة الفسيولوجية للإصابة في الجسم الحي في الوقت الحقيقي 5،9،10. تدفق الدم الجهاز هو المعلمة الفسيولوجية الحرجة التي غالبا ما تتغير في كثير من الأمراض. ومع ذلك، فإن وضع ديناميكا الدم في الكبد في ظل الظروف الفسيولوجية والمعدية لا تزال منطقة سيئة استكشافها. في هذه الدراسة، على أساس أساليب IVM، والتي تم تكييفها سابقا للدراسة في الطحال وورم الأوعية الدموية، نفذت لقياس سرعة تدفق الدم في الكبد في وعاء واحد وقياس سرعة RBC الفردية في الجسم الحي 11،12. المنهجيات المستخدمة هنا تعتمد على النقيض من بين fluorophore البلازما حقن عن طريق الوريد في الماوس، مثل BSA الفلورسنت، وكريات الدم الحمراء، التي تبقى داكنة. المجراة قياسات تدفق الدم لديها القدرة على تحسين فهمنا لمرض المواليةسيرورات.
هنا، تم استخدام اثنين من المنهجيات ومقارنة لقياس تدفق الدم في الأوعية الكبد. المنهجية الأولى هي مضيعة للوقت والحساسية من حيث تحليل البيانات كما يتطلب من المستخدمين يدويا تتبع حركة RBC في سفينة الفردية باستخدام البرنامج المساعد MTrackJ في برنامج يماغيج. المنهجية الثانية هي بسيطة وسريعة، لأنها تتكون من تحليل صورة XT من أحد الأوعية الدموية الناتجة عن عملية استحواذ مسح الخط مع وضع الماسح الضوئي الرنانة. المنهجيات اثنين تعطي بيانات قابلة للمقارنة لسفن مماثلة. في هذه المرحلة فإنه يكاد يكون من المستحيل مقارنة البيانات لدينا مع الآخرين، كما، على حد علمنا، لم يكن كميا سرعة تدفق الدم في هذه الأوعية الصغيرة والشعيرات الدموية في الماوس جيبي مع عرض ما يقرب من 10 ميكرون. على أساس أساليب IVM-تسمح عالية الدقة في س ص 500 نانومتر تمكين التحليل من جيبي مع عرض 10-50 ميكرون 13. في المقابل، التقنيات المعتمدة دوبلر لها سوى RESOL القصوىution من 70 ميكرون مما يحد من قياس تدفق الدم إلى الشرايين والأوردة الكبد بوابة 3.
واحدة من الخطوات الرئيسية التي أمر بالغ الأهمية لنجاح تنفيذ هذه المنهجيات هو عملية جراحية ناجحة والحفاظ على الماوس تخدير في حالة فسيولوجية جيدة خلال جلسة التصوير بالكامل. للقيام بذلك، لا بد من السيطرة بعناية على درجة حرارة الغرفة المجهر وحقن مخدر كل ساعة. خطوة حاسمة أخرى هي استيعاب الكاشف البلازما الفلورسنت في بطانة البطانة التي يمكن أن تحدث بشكل طبيعي بعد الحقن لها. وهذا الاستيعاب تنتج صورا XT uninterpretable والصور س ص الامم المتحدة يتناقض. هذه الظاهرة يعتمد على جرعة من صبغة حقن ويمكن منعها عن طريق حقن جرعة عالية من كاشف البلازما (الشكل 4).
الأهم من ذلك، ناجحة التصوير intravital المجهري من تدفق الدم في الكبد يتطلب عشرالبريد النظر في العديد من الجوانب الحاسمة. وتشمل هذه تعقيد نظام الأوعية الدموية في الكبد، فإن وجود أنواع فرعية مختلفة من الأوعية الدموية التي تحتوي على السفن الصغيرة والكبيرة مع هياكل ووظائف مختلفة والتعاميم الدم مختلفة مع تدفق سريع وبطيء والسرعات RBC السريع. القيد الرئيسي للمنهجية تقوم على تحليل صورة XT هي سرعة اكتساب السفينة وعدم وجود Z القرار، كما حصلت على صورة في 3D (XYT). وبشكل أكثر تحديدا، فإن معدلات مسح خط أنظمة قياسية تصل إلى الحد من حساسية فيما يتعلق باقتناء الأوعية الدموية الكبيرة (القطر فوق 180 ميكرون 2) التي تتميز بها سرعات RBC عالية جدا، كما هو الحال مع الشرايين. في وعاء كبير، ويمكن للمسار RBC يكون من الطائرة المصورة وسيتم استبعاد أي مكونات التي هي عمودي على الطائرة الممسوحة ضوئيا من التحليل.
والمنهجية المقدمة حيحرث يمثل أداة مثالية لفي الجسم الحي والكمي في الوقت الحقيقي من العديد من المعلمات تدفق الدم تحت مختلف الظروف المرضية. والتحقيق في ديناميكا الدم الكبد تلقي ضوءا جديدا على عمليات الأمراض والطفيليات المرضية في جهاز معين. جهودنا للحصول على نظرة ثاقبة لنظام الأوعية الدموية الدقيقة الكبد تطبيقه على نموذج الفأر تجريبية من العدوى الليشمانيا يفتح إمكانية للارتباط العديد من المعلمات تدفق الدم مع تكاثر الطفيليات وتطور المرض في هذا الجهاز، في الوقت الحقيقي. الكواشف، وأدوات تطوير مزيد من والمنهجية لتوصيف تحسين نظام الأوعية الدموية في الكبد عن طريق IVM خلال العدوى هي ذات أهمية كبيرة لدراسة تأثير الطفيلي الاستعمار على هذه المعلمة الفسيولوجية، وعلى أساس المعاملة بالمثل، وتأثير تدفق الدم في الليشمانيا المرضية. هذه الاستراتيجية يمكن أن يحتمل تمتد إلى غيرها من الأمراض المعديةالنظم التي تستهدف مسببات الأمراض الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل INSERM، جامعة إيكس مرسيليا وجائزة التطوير المهني من HFSPO التي حصلت عليها CL فوريستير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
