Abstract
Intravitale microscopie (IVM) is een krachtige optische beeldvormende techniek die de visualisatie, bewaking en kwantificering van verscheidene biologische processen in real time en in levende dieren mogelijk gemaakt. Deze technologie is sterk geavanceerde ons begrip van fysiologische processen-pathogeen gemedieerde verschijnselen in specifieke organen.
In deze studie wordt IVM toegepast op de muizenlever en protocollen zijn ontworpen om de beeldpositie in vivo de bloedsomloop van de lever en meet rode bloedcel (RBC) snelheid in afzonderlijke vaten lever. Om de verschillende subtypes vaartuig dat de lever orgaan karakteriseren visualiseren en uitvoeren bloedstroom snelheidsmetingen worden C57BL / 6-muizen intraveneus geïnjecteerd met een fluorescent reagens dat de plasma-lever geassocieerde vasculatuur labels. IVM maakt in vivo, real-time meting van RBC snelheid in een bepaald vaartuig van belang. Vaststelling van deze methodologie zal het mogelijk te makenonderzoeken lever hemodynamiek onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Uiteindelijk zal dit imaging-gebaseerde methodologie belang zijn voor het bestuderen van de invloed van L. donovani infectie op de lever hemodynamiek.
Deze methode kan worden toegepast op andere infectieuse modellen en muis organen en kunnen verder worden uitgebreid pre-klinisch testen van een drug effect op de ontsteking door het kwantificeren van het effect op de bloedstroom.
Introduction
Organ-specifieke hemodynamica zijn belangrijke fysiologische kenmerken van elke zoogdieren orgaan. Afwijkingen in de bloedstroom kan het gevolg zijn van een ontsteking en een teken van orgaanstoornissen 1 zijn. Aldus bloedstroom organisatie structuur en functie lijken kritische parameters voor analyse onder fysiologische en pathologische omstandigheden. De technieken die gewoonlijk zijn gebruikt voor het analyseren van bloedstroming in een bepaald orgaan bevatten verscheidene beperkingen, waaronder de resolutiegrens van de techniek zelf (bijvoorbeeld Doppler beeldvorming van bloedstroming), het vermogen tot het meten van absolute bloedstroom slechts (hoeveelheid bloed per eenheid die een orgaan) (bv Optical Coherence Tomography) en het meten van de gemiddelde veranderingen in snelheid een grote en heterogene populatie van bloedvaten 2,3. Bloedsomloop van de lever koppelt verschillende vaartuig subtypes die heterogeen in omvang, structuur en functie zijn. InDeze studie, intravitale microscopie (IVM) beeldtechnologie toegepast op lever hemodynamica evalueren in vivo, in real time, met een hoge resolutie en parallel met de kenmerken van de individuele bloedvaten die de lever orgaan omvatten ontdekken. De recente ontwikkeling van deze krachtige optische beeldvormende techniek kan de onderzoeker dynamische gegevens te verzamelen op levende dieren bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Doordat de directe visualisatie en real time monitoring van specifieke en snelle biologische processen in vivo, IVM biedt een unieke gelegenheid om de onderzoeker op de foto om individuele bloedvaten, en meten en kwantificeren van de snelheid van enkele rode bloedcellen (RBC) binnen een specifiek geselecteerd lever schip.
In deze studie hebben we de IVM techniek in de muizenlever uitgevoerd om de invloed van muis infectie door het hepatotrope Leishmania parasiet lever hemodynamiek onderzoeken. L. donovanimandataris is verantwoordelijk voor viscerale leishmaniasis, ernstige ziekte gekenmerkt door acuut op chronische inflammatoire reacties en pathologie die in meerdere organen, zoals de milt en de lever. In een experimenteel muizenmodel van viscerale leishmaniasis, de lever infectie zonder behandeling terwijl de milt infectie progressief 4. Deze uitkomsten van Leishmania infectie met betrekking tot de individuele organen nog niet volledig begrepen. Onderzoek van de lever en de milt hemodynamiek onder pathologische omstandigheden zal een nieuw licht werpen op gastheer-parasiet interacties en ziekte pathogenese.
Ons experimentele model is gebaseerd op het blootstellen en beeldvorming van de lever van een verdoofde muis die intraveneuze injectie van specifieke fluorescente kleurstoffen ontvangen voor de etikettering van de lever intravasculature. De lever is gunstig orgaan voor intra-vitale microscopie. Na het uitvoeren van een kleine incision in de buik, wordt de lever voorzichtig buiten gebracht en geplaatst op nat gaasje en vervolgens op een dekglaasje met de doelstelling om eventuele bewegingsartefacten als gevolg van hartslag en ademhaling. De lever wordt vervolgens binnen het oog van een microscoop lens geplaatst. In vergelijking met de milt en lymfeklieren die het gebruik van twee foton microscopie voor IVM studies nodig, het voordeel van de lever ligt in de homogene 3D architectuur / anatomie die het mogelijk maakt het gebruik van een conventionele confocale microscoop met een maximale penetratiediepte van ongeveer 50 urn voor intravitale microscopie imaging 5-8.
In deze studie worden twee onafhankelijke beeldvormende methoden voor de kwantitatieve meting van RBC snelheid en bloed stroomsnelheid in afzonderlijke bloedvaten. In de eerste werkwijze wordt leverbloedstroom verkregen met behulp van een xy tweedimensionale functie in de tijd. De resulterende XYT gegevens geanalyseerd met de MtrackJ plugin in de vrije ImageJ software, die zorgt voor het volgen van indiUAL RBC in de tijd. In de tweede methode wordt een bloedvat geselecteerd en de bijbehorende bloedstroom wordt geanalyseerd met de lijnaftasting snelle acquisitie modus van de confocale laser scanning microscoop. Het schip van de rente wordt gescand bij hoge frequentie langs de centrale as door een axiale lijn. De bloedstromingssnelheid wordt vervolgens gekwantificeerd op basis van het verschil in contrast tussen ongelabelde donker erytrocyten en fluorescent gelabelde plasma. De fluorescentie-intensiteiten van RBC en plasma verkregen langs de lijn scan zijn tegen de tijd uitgezet om strepen te verkrijgen, de hoeken van die evenredig zijn met de snelheden van een individuele RBC.
Het doel van dit artikel is een eenvoudige en reproduceerbare werkwijze voor beeldvorming en meting bloedstroomsnelheid binnen afzonderlijke bloedvaten van de lever, waarna de beschikbare maken de fundamentele hulpmiddelen voor de succesvolle uitvoering van muis chirurgie, IVM en kwantitatieve analyse van de snelheid van individuele RBC. Tzijn aanpak kunnen de onderzoekers tot nieuwe inzichten in het bloed snelheid te winnen onder pathologische omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethics statement: Alle dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en protocollen die werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Aix-Marseille Université, Frankrijk. Vrouwelijke C57BL / 6 muizen op 8 - 10 weken oud werden commercieel verkregen en behandeld volgens de regels van Décret N ° 8 87-848, 19 oktober 1987, Parijs. Alle experimenten met L. donovani LD1S parasieten werden uitgevoerd in overeenstemming met bioveiligheid regelgeving van de Franse en Europese wetgeving.
1. Mouse Infectie met L. donovani promastigoot Parasieten
- Bereid het kweekmedium voor in vitro onderhouden van L. donovani promastigoot parasieten, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- Gebruik M199 medium. Aangevuld M199-medium met 10% foetaal kalfsserum (warmte-geïnactiveerd bij 56 ° C gedurende 30 min), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO 3, 1 mM gluTamine, RPMI 16040 vitaminemix, 10 mM foliumzuur, 100 mM adenosine, 7,6 mM hemine, 50 U / ml penicilline en 50 mg / ml streptomycine.
- Culture LD1S parasieten in 10 ml compleet M199 medium bij 26 ° C in een 25 cm2 kolf geventileerd.
- Met behulp van opeenvolgende differentiële centrifugatiestappen, bereiden een bevolking van promastigoot parasieten die zijn verrijkt in metacyclische vormen.
- Oogst een mid-log-fase parasiet cultuur. Reken op een hemocytomer. Resuspendeer 5 x 10 5 parasieten / ml in 10 ml compleet medium M199. Grow de parasiet cultuur in anaerobe omstandigheden tot zij de late stationaire fase (ongeveer 5-6 dagen) te bereiken.
- Draai de LD1S kweek bij 1200 xg gedurende 10 min bij 26 ° C die niet-metacyclische parasieten pellet werd de bovenstaande herstellen en weer draaien bij 2500 xg bij 26 ° C gedurende 10 min.
Opmerking: deze laatste pellet wordt hoogverrijkt in metacyclische promastigoot parasieten. - Resuspendeer de pellet in 100 pl PBS. Verwijderen van een kleine hoeveelheid voor fixatie met 25% glutaaraldehyde 1/100 v: v en tel parasieten met behulp van een hemocytometer.
- Verdun de verrijkte metacyclische parasietenpopulatie tot 1 x 10 7/100 pi in PBS. Injecteer de parasiet suspensie in de staartader van een verdoofde muis (zie hierna) met een 1 ml spuit met een 30 G naald. Bij controledieren, injecteer 100 ul PBS in de staartader.
2. Chirurgische ingrepen
- Ontsmet de werkruimte met een biocide desinfecterende spray en de chirurgische instrumenten 70% ethanol gedurende 30 minuten.
- Bereid een anestheticum, afhankelijk van het gewicht van het dier, bevattende 125 mg / kg ketamine en 12,5 mg / kg xylazine verdund in PBS.
- Weeg de muis en intraperitoneaal injecteren van de juiste dosis van het verdovingsmiddel met een 1 ml spuit met een 30 G naald.
- Houd de muis warm en controleer of de muis is volledig anesthedopen door knijpen de voet pad voordat u verder gaat. Opnieuw Injecteer halve dosis van het anestheticum in de muis elke 60 min.
- Scheer de buik van de muis en reinig deze met Vetedine. Voeg een kleine incisie in de huid en spieren onder de thorax aan de linkerzijde van de buik.
- Leg een stukje vochtig gaas op de buik net onder het open gebied. Expose de lever en plaats het op het gaas. Leg een ander stuk van vochtige gaas boven de lever.
- Plaats een 24 x 60 mm 2-150 urn dik dekglaasje, cyanoacrylaat gebonden aan een metalen frame, de lever voor visualisatie onder een microscoop.
- Bescherm de ogen van de muis met een nat gaasje.
- Na de opnamesessie, euthanaseren van de dieren verdoofd door cervicale dislocatie.
3. Intravitale Microscopie Imaging van de lever Architecture
- Voer de intravitale microscopie experimenten op een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met tenhermostatic gecontroleerde kamer, een apochromatische 63x olie glycerol immersie objectief (NA 1,4), Argon (488 nm) en HeNe (543 nm, 633 nm), lasers en een blauwe diode (405 nm).
- Plaats de muis op het podium van de microscoop met het dekglaasje die de lever gezicht naar beneden op de doelstelling. Stel de temperatuur van de kamer tot 29 ° C. Pas de scherpstelling met behulp van de lever autofluorescentie mogelijk te maken voor visualisatie van de sinusoïden.
- Om de vasculatuur te visualiseren, wordt een oplossing van 500 ug BSA-Alexa 647 verdund in 100 pl PBS voor elke muis. Injecteer oplossing intraveneus in de staartader van de verdoofde muis met behulp van een 1 ml spuit met een 30 G naald.
- Om de lever celkernen visualiseren, een oplossing van Hoechst 33342 in PBS. Injecteer deze oplossing bij 8 mg / kg muis intraperitoneaal met een 1 ml spuit met een 30 G naald.
- Gebruik de normale sequentiële modus, de 63x immersie objectief en de scanner bij 400 Hz het imago van de levercelkernen en de lever vaatstelsel. Zet de 405 nm blauwe diode voor Hoechst excitatie en 633 nm laser voor BSA-Alexa 647 excitatie. Zet de Argon 488 nm laser en definiëren een grote overname band naar de lever autofluorescentie visualiseren.
4. Intravitale Microscopie Imaging van de lever voor Blood Flow Speed Measurement
- Open de LAS software van de microscoop (LAS-AF viewer Versie 3.1.0 build 8587). Selecteer de resonantie scanner modus bij het openen van de microscoop software.
- Klik op het tabblad configuratie om de hardware te stellen. Klik op de laser en selecteer de HeNe 633 laser. Klik op Instellingen en selecteer 12 bits resolutie.
- Klik op de overname menu. In het venster balk pad instellingen, selecteert u het doel 63x en het opzetten van de 633 laservermogen tot 100%. Activeer de signaalversterking en uit ingestelde parameters door Alexa-633 te selecteren uit de PM1-3 drop-down menu.
- In het tabblad verwerven, selecteer de 'XYT' overnamemodus. Stel formaat breedte op 1.024 x 1.024. Selecteer snelheid bij 8.000 Hz. Selecteer de pinhole van 3 Airy eenheden. Selecteer een zoomfactor van 3. Heeft de bidirectionele modus niet selecteren.
5. Kwantitatieve Analyse van RBC Velocity Met de xyt Images (Methode 1)
- Klik op het pictogram 'Live' om de bloedstroom op een live-modus te visualiseren. Kies het gebied van belang en selecteer een bepaald bloedvat voor analyse. Zet het schip van belang zijn voor horizontale positie door aanpassing van de 'X', 'Y' en scan veld rotatie coördinaten op USB bedieningspaneel.
- Stop de 'Live' modus zodra het vat van belang is ingesteld. Wijzig de ingestelde breedte naar 1024 x 256 in de overname-modus instellen venster, lijn gemiddelde = 1, kader gemiddelde = 1, selecteer "stacks" 150. Klik op 'start' om beelden te verwerven.
- Voor de kwantitatieve analyse van RBC snelheid met behulp van de "xyt" afbeeldingen openen de ImageJ software. Selecteer de 'Bestand'tab in ImageJ, klik op "Open" en kies vervolgens het bestand van belang.
- Ga naar de "plugin" menu in ImageJ, selecteert LOCI en Bio-formaten te importeren opties. In dit venster selecteert u de stapel bekijken van parameters als 'HyperStack'. In de optie stapel volgorde, selecteert u de optie: "xyzct". Opmerking: Dit opent een venster met alle reeks overnames.
- Klik op 'Plugins' op het ImageJ menu en selecteer MTrackJ optie. Klik op het pictogram 'add' op het kleine venster en klik op de RBC op te sporen. Klik op dezelfde RBC in elk volgende frame en klik op het pictogram "maatregel" om de snelheid te meten.
Opmerking: Het bestand gegenereerd kan in .exl formaat worden opgeslagen. - Track minste vijf erytrocyten per schip en analyseren van ten minste drie afzonderlijke vaten van dezelfde grootte.
6. Kwantitatieve Analyse van RBC Velocity Met de xt Line Images (Methode 2)
- Klik op 'Live' om het bloed f visualiserenlaag in de live-modus. Selecteer een bepaald bloedvat voor analyse. Zet het schip van belang zijn voor de horizontale positie. Stop de 'Live' modus zodra het vat van belang is ingesteld.
- Selecteer de 'xt' scanning mode en zet de centrale lumen van de geselecteerde schip langs de lijn scan. Set formaat breedte bij 1.024 x 512, snelheid = 8,000Hz, lijn gemiddelde = 32, time = 512. Klik op 'start' en het verwerven van de xt lijn beelden.
- Genereer strepen voor de kwantitatieve analyse van RBC snelheid door het openen van de .lif bestand en de xt lijn beeld van belang openen. In LAS-AF software, selecteer "experimenten", opent de .lif en selecteer de afbeelding. Opmerking: Het zal automatisch een kymograaf openen.
- Meet de tijd (t, verkregen op de Y-as) vereist voor een deeltje strook (weergegeven reflectie donker) naar een bepaalde afstand (d, verkregen op de X-as) Beoordelingen dit kymograaf. Selecteer het gereedschap "draw line" en trek een lijn horizontaal naar de streep. Let op de afstandpm en de tijd in seconden gegenereerd in de tab resultaat bij de onderkant van het beeld.
- Bereken de snelheid als V = afstand / tijd met behulp van de verkregen uit de kymograaf waarden.
- Kwantificeren minste vijf deeltjes stroken xt per beeld en ten minste drie afzonderlijke vaten van dezelfde grootte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De specifieke architecturale ordening van de sinusoïden van de lever kan worden gevisualiseerd basis van de eigenschap autofluorescente van deze organen (figuur 1, paneel B en C, groen), intraperitoneale injectie van Hoechst voor de etikettering van hepatocyten nuclei (figuur 1B, blauw) en de intraveneuze injectie van fluorescent BSA voor kleuring van de lever bloedsomloop (figuur 1C, red). De lever is samengesteld uit verschillende subtypes vat met verschillende functies en structuren en maten variërend 40-700 micrometer in diameter 2 (D) (D van kleine vaartuigen tussen 40-80 urn 2 en D van grote schepen is dan 300 urn 2 ). Intravitale microscopie beeldvorming van de lever maakt de visualisatie met een hoge resolutie van de heterogeniteit en complexiteit van de lever vasculatuur (figuur 1C).
Voor het bewaken van de bloedstroom snelheid in individuele Vessels, zijn twee verschillende methodes gebruikt voor de afbeelding acquisitie en data-analyse van de lever bloedvaten in vivo. In de eerste werkwijze wordt real-time imaging van de bloedstroom in een vat plaats met behulp van de xyt scanmodus (Film 1). Kwantitatieve analyse van de snelheid van een individu RBC in één vat wordt uitgevoerd met behulp van de MTrackJ plugin in de ImageJ software (figuur 2A en 2B). Een minimum van vijf deeltjes per vaartuig bijgehouden in verschillende vaten gaande 40-80 urn 2 van diameter. De met deze werkwijze verkregen resultaten consistente en reproduceerbare waarden in verschillende muizen en RBC snelheid in kleine vaten lever evalueren bij waarden tussen 25-35 um / sec (figuur 2C).
De tweede methode bestaat uit het herhaaldelijk aftasten langs een lijn evenwijdig aan de vaatwand, de lijn in het midden van het lumen van het vat.Figuur 3 toont een xy kader scan (links panelen) met de bijbehorende xt lijn scan (rechts panelen). De snelheid van een individuele RBC wordt gegeven door de verhouding V = afstand / tijd wordt berekend volgens de orthogonale projecties op de X- en Y-as van de strook verkregen beeld xt. In de figuren 3D en 3E, elk gegevenspunt stelt de snelheid van een individuele RBC uit verschillende kleine of grote vaten gekozen uit verschillende muizen. Zoals blijkt uit de foutbalken tonen de gegevens een relatief lage variatie tussen RBC snelheden en geven aan dat de bloedstroom snelheid aanzienlijk sneller in grote vaten dan in kleine vaten. Daarnaast werd een aanzienlijke variatie in de snelheidswaarden verkregen uit verschillende typen grote vaten waargenomen dat bloed stroomsnelheid relatief vergelijkbaar tussen verschillende soorten kleine vaten. Metingen van de bloedstroming deze nieuwere methode genereert data die vergelijkbaar is met data verkregen uit de eerder beschrevend methode met MTrackJ (vergelijk figuur 2C figuur 3D). Het beeld in figuur 3C is een typisch voorbeeld van een suboptimale experiment waarin een beeld niet-interpreteerbare xt het xy framescan genereert. In dit geval is het een gevolg is van zowel i) de snelle internalisatie van BSA in de endotheelcellen die het van belang zijnde vat en ii) de aanwezigheid van een verbinding tussen twee vaten die de bloedstroom in het geselecteerde gebied van acquisitie verstoort. De snelheid van de internalisering van de plasma reagens in het endotheel langs het bloedvat is een kritische parameter om te overwegen bij het meten van de bloedstroom snelheid, zoals internalisatie de kwaliteit van xt beeld dat de strepen toont zal veranderen. Het percentage internalisatie kritisch afhankelijk van de dosering van de kleurstof dat intraveneus wordt ingebracht. In figuur 4 wordt aangetoond dat 500 ug BSA-Alexa 647 en / of 500 kDa dextran-FITC de optimale doses die Should worden gebruikt voor de kwantificering van de bloedstroom snelheid. Deze doses genereren een zeer heldere signaal dat zorgt voor de identificatie van de RBC donkere deeltjes tegen een lichte achtergrond en kan de visualisatie van de bloedstroom gedurende ten minste 1 uur, zonder internalisering van de geïnjecteerde kleurstof (figuur 4, onderste paneel). Daarentegen, 50 ug BSA-Alexa 647 en / of 500 kDa Dextran-FITC (niet getoond), terwijl voor de visualisatie van de lever vasculaire netwerk is een suboptimale dosis voor het meten bloedstroomsnelheid door het snelle internalisatie van de kleurstof, die begint op 5 min na injectie (figuur 4, onderste paneel).
Bij deze methode toegepast op de lever van geïnfecteerde dieren zagen we een aanzienlijke toename van de bloedstromingssnelheid zodra 1 uur na infectie. Wijziging van de RBC snelheid wordt gehandhaafd tot 24 uur na infectie. Het normale waarden bereikt uiteindelijkop 72 uur na parasiet injectie (Figuur 5). Aldus bevestigt dit experiment het gebruik van deze methode om nieuwe inzichten in de invloed van pathologische condities op lever hemodynamiek.
Figuur 1: Intravitale Microscopie van de Muis Lever (A) Lever chirurgie van de muis.. Een klein gedeelte van een leverkwab wordt blootgesteld na een operatie, worden twee stukken vochtig gaas omheen geplaatst en een schuif die op de buik om de lever voordat de muis in het stadium van een confocale microscoop geplaatst dekken. (B, C) Beeld van een representatief gedeelte van de lever van een niet-geïnfecteerde muis die de lever sinusoïden en de andere afmetingen van de vaten die de hepatische organen omvatten aantoont. Lever autofluorescentie wordt getoond in groen. De muis wordt ingespoten met Hoechst 33342 (blauw) om het etiket van de hepatocyte kernen (B) en geïnjecteerd met BSA-Alexa 647 (rood) naar de lever vasculatuur (C) te visualiseren. Schaal bars, 50 um Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Kwantitatieve Analyse van RBC Velocity uit een xy Frame Scan met behulp van de ImageJ Software (A) Vertegenwoordiger xy beeld van de bloedcirculatie in een klein lever schip overgenomen door intravitale microscopie beeldvorming van de muis lever met behulp van de snelle xy scan mode. Donkere gebieden overeen met RBC. Schaal bar, 10 micrometer. (B) Kwantificering van de snelheid van een enkele RBC met de MTrackJ plugin van ImageJ. Lines (rood, geel, wit) vertegenwoordigen de baan in de tijd van een individuele RBC. (C) RBC snelheid in afzonderlijke smAlle (D is ongeveer 50 micrometer 2) leverinsufficiëntie schepen. De grafiek geeft de waarde van de snelheid van vijf onafhankelijke RBC bijgehouden in afzonderlijke vaten lever die werden geselecteerd uit vijf verschillende muizen (1-5). D de diameter van het vat in 2 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Liver metingen van de bloedstroming door Intravitale Microscopie Imaging van een bloedvat met het xt Line scanmodus Representatieve xy afbeeldingen (linker panelen) lever vaartuigen gemerkt met BSA-Alexa 647 en de bijbehorende xt afbeeldingen (rechter panelen) verkregen van een. line-scan van de centrale lumen van een vaartuig. (A, B) Small (A) en grotelever vat (B). (C) Representatieve gegevens van een sub-optimale experiment toont het snijpunt van twee bloedvaten en BSA internalisatie in het endothelium. (D, E) De grafieken plot de waarde van de snelheid van drie onafhankelijke erytrocyten per vaartuig (in kleine en grote D E) gekozen uit vijf muizen. D de diameter van het vat in 2 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Het effect van de dosis van de fluorescerende kleurstof Plasma on De internalisering in de endotheel Langs de Sinusoiden Deze afbeelding volgt de internalisering van BSA en Dextran 500 kDa in het endothelium langs de sinusoïden, als een functie van tijd en injectiedosis.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Effect van L. donovani infectie op Lever Hemodynamica. Deze grafiek geeft de waarden van de bloedsnelheid verkregen uit meerdere afzonderlijke bloedvaten van niet-geïnfecteerde muizen (NI) en muizen die waren geïnfecteerd met L. donovani en geanalyseerd 1 uur, 24 uur en 72 uur na infectie (pi). Elke stip vertegenwoordigt de gemiddelde waarde van vijf RBC snelheidsmetingen verkregen in een bloedvat van ongeveer 50 urn 2. In elke omstandigheid (NI, 1 uur pi, 24 pi uur en 72 uur pi) ten minste drie muizen werden geanalyseerd op bloed stroomsnelheid. De sterren geven een significant verschil in het bloed stroomsnelheid verkregen 1 uur en 24 uur pi tegenover NI muizen (p <0,01, één manier Anova).
Film 1. Time-lapse Intravitale Microscopie Imaging van de muis lever. Movie 1 komt overeen met Figuur 3. De muis kreeg een injectie van BSA-Alexa 647 aan het vaatstelsel te visualiseren. De bloedstroom in drie kleine vaten (D van 50 um 2) getoond. Zwarte gebieden overeen met RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De recente ontwikkeling van intravitale microscopie van de muizenlever opent nieuwe mogelijkheden voor het onderzoeken van de fysiologische reactie op infectie in vivo en in real time 5,9,10. Organ bloedstroom kritische fysiologische parameter die vaak wordt veranderd bij vele ziekten. Echter, de status van de lever hemodynamiek onder fysiologische en besmettelijke aandoeningen blijft een slecht onderzocht gebied. In deze studie IVM-gebaseerde werkwijzen, die eerder zijn aangepast voor de studie van de milt en tumorvasculatuur, werden uitgevoerd om leverbloedstroom stroomsnelheid kwantificeren in een enkel vat en meet individuele RBC snelheid in vivo 11,12. De methoden die hier gebruikt afhankelijk van het contrast tussen een plasma fluorofoor intraveneus geïnjecteerd in muizen, zoals fluorescerende BSA en erytrocyten, die donker blijven. In vivo metingen van de bloedstroming hebben het potentieel om ons begrip van de ziekte pro verbeterenprocessen.
Hier werden twee methoden gebruikt en vergeleken met de bloedstroom in vaten lever te meten. De eerste methode is tijdrovend en lastig in termen van gegevensanalyse als het vereist gebruikers RBC beweging handmatig bijhouden in een vaartuig met de MTrackJ plugin in de ImageJ software. De tweede methode is eenvoudig en snel, omdat het bestaat uit de analyse van een xt beeld van een bloedvat gegenereerd uit een scan overname lijn met de resonante scanner mode. De twee methoden geven vergelijkbare gegevens voor dergelijke schepen. In dit stadium is het bijna onmogelijk om deze gegevens te vergelijken met anderen, zover wij weten, bloed stroomsnelheid niet kon gekwantificeerd in zulke kleine drukvaten muis sinusoïde capillairen met een breedte van ongeveer 10 urn. IVM-gebaseerde werkwijzen laten hoge resolutie xy van 500 nm zodat de analyse van een sinusoïde met een breedte van 10-50 pm 13. Daarentegen Doppler gebaseerde technieken slechts een maximale resolution van 70 urn, waardoor beperking van de meting van de bloedstroom naar de lever slagaders en aders 3 portal.
Een van de belangrijkste stappen die is van cruciaal belang voor de succesvolle implementatie van deze methoden is een succesvolle operatie en het onderhoud van de verdoofde muis in goede fysiologische toestand gedurende de hele beeldvorming sessie. Om dit te doen, moet men voorzichtig de controle van de temperatuur van de microscoop kamer en injecteren verdoving elk uur. Een andere belangrijke stap is de internalisering van de fluorescerende plasma reagens in de endotheel bekleding die natuurlijk na injectie kan plaatsvinden. Dergelijke internalisatie zal produceren te interpreteren xt beelden en niet-contrast xy beelden. Dit verschijnsel is afhankelijk van de dosis van de geïnjecteerde kleurstof en kan voorkomen worden door injectie van een hoge dosis van de plasma-reagens (Figuur 4).
Belangrijk is succesvol intravitale microscopie beeldvorming van de lever bloedtoevoer vereist the overweging van enkele kritische aspecten. Hiertoe behoren de complexiteit van de lever vaatstelsel systeem de aanwezigheid van verschillende subtypes van bloedvaten met kleine en grote vaten met verschillende structuren en functies, verschillende bloedcirculatie met snelle en langzame en snelle RBC flux snelheden. De grootste beperking van de methode die is gebaseerd op de analyse beeld xt van de snelheid van verwerving van het vaartuig en het gebrek aan Z-resolutie, terwijl de foto verkregen in 3D (XYT). Meer specifiek, de lijn aftastsnelheid van standaardsystemen bereikt hoogste gevoeligheid bij de verwerving van grote bloedvaten (diameter van meer dan 180 urn 2) die worden gekenmerkt door een zeer hoge RBC snelheden, hetgeen het geval is bij bloedvaten. In de grote vat, kan het RBC traject worden uit het afgebeelde vliegtuig en alle componenten die loodrecht op de gescande vliegtuig zijn zal uit de analyse worden uitgesloten.
De gepresenteerde methode here vormt een ideaal instrument voor de in vivo en real-time kwantificering van verscheidene bloedstroom parameters onder verschillende pathologische omstandigheden. Het onderzoek van de lever hemodynamica zal een nieuw licht op de ziekte processen en parasieten pathogenese schuur in een specifiek orgaan. Onze pogingen om inzicht te krijgen in de lever microvasculatuur wordt toegepast op een experimenteel muizenmodel van Leishmania infectie opent de mogelijkheid voor de correlatie van verschillende bloedstroom parameters parasiet vermenigvuldiging en ziekteontwikkeling in dit orgaan, in real time. De verdere ontwikkeling van reagentia, apparatuur en de methode voor de betere karakterisering van de lever vaatstelsel systeem IVM tijdens infectie van groot belang voor de studie van de invloed van parasitaire kolonisatie deze fysiologische parameter en, omgekeerd, de invloed van de bloedstroom op leishmania pathogenese. Deze strategie kan eventueel worden uitgebreid tot andere besmettelijkesystemen waarbij ziekteverwekkers richten op de lever.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de INSERM, de Universiteit van Aix-Marseille en een Career Development Award van HFSPO verkregen door CL Forestier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
