Abstract
Microscopía intravital (IVM) es una poderosa técnica de imagen óptica que ha hecho posible la visualización, monitoreo y cuantificación de diversos eventos biológicos en tiempo real y en los animales vivos. Esta tecnología ha avanzado enormemente nuestra comprensión de los procesos fisiológicos y fenómenos patógenos mediada en órganos específicos.
En este estudio, IVM se aplica al hígado de ratón y protocolos están diseñados para imagen in vivo el sistema circulatorio del hígado y medir los glóbulos rojos (RBC) de velocidad en vasos hepáticos individuales. Para visualizar los diferentes subtipos de los vasos que caracterizan el órgano hepático y llevar a cabo mediciones de la velocidad del flujo sanguíneo, C57BL / 6 ratones se inyectaron por vía intravenosa con un reactivo de plasma fluorescente que etiqueta la vasculatura hepática asociada. IVM permite in vivo, en tiempo real, la medición de la velocidad de RBC en un recipiente específico de interés. El establecimiento de esta metodología permitirá ainvestigar la hemodinámica hepática bajo condiciones fisiológicas y patológicas. En última instancia, esta metodología basada en la proyección de imagen será importante para el estudio de la influencia de L. infección donovani en la hemodinámica hepática.
Este método se puede aplicar a otros modelos infecciosas y órganos de ratón y podría extenderse aún más para pre-clínica de pruebas del efecto de un fármaco sobre la inflamación mediante la cuantificación de su efecto sobre el flujo sanguíneo.
Introduction
Hemodinámica órgano-específicas son importantes características fisiológicas de cualquier órgano de mamífero. Anomalías en el flujo sanguíneo puede ser la consecuencia de la inflamación y un signo de disfunción de órganos 1. Por lo tanto, el flujo de sangre organización, estructura y función aparecen como parámetros críticos para el análisis en condiciones fisiológicas y patológicas. Las técnicas que se han utilizado comúnmente para el análisis de flujo de sangre en un órgano específico contienen varias limitaciones, incluyendo el límite de resolución de la técnica en sí (por ejemplo, formación de imágenes Doppler del flujo sanguíneo), la capacidad para la medición del flujo sanguíneo absoluta solamente (volumen de sangre por unidad que sirve un órgano) (por ejemplo, la tomografía de coherencia óptica) y la medición de los cambios en la velocidad promedio en una población grande y heterogéneo de los vasos sanguíneos 2,3. El sistema circulatorio del hígado vincula diferentes subtipos de los vasos que son heterogéneos en su tamaño, estructura y función. Enesta tecnología de imagen estudio, microscopía intravital (IVM) se aplica para evaluar la hemodinámica del hígado in vivo, en tiempo real, en alta resolución y en paralelo para descubrir las características de los vasos sanguíneos individuales que componen el órgano hepático. El reciente desarrollo de esta poderosa técnica de imagen óptica permite al investigador para recolectar datos dinámicos sobre los animales que viven en una alta resolución espacial y temporal. Al permitir la visualización directa y el monitoreo en tiempo real de los procesos biológicos específicos y rápidos en vivo, IVM ofrece una oportunidad única para el investigador a los vasos sanguíneos imagen individual, y medir y cuantificar la velocidad de los glóbulos rojos individuales (RBC) dentro de un seleccionado específicamente buque hepática.
En este estudio, hemos implementado la técnica de IVM en el hígado del ratón para investigar la influencia de la infección del ratón por el parásito Leishmania hepatotropos en la hemodinámica hepática. L. donovanies el agente responsable de la leishmaniasis visceral, una enfermedad grave caracterizada por respuestas inflamatorias agudas-sobre-crónica y una patología que está presente en múltiples órganos, incluyendo el bazo y el hígado. En un modelo experimental de ratón de leishmaniasis visceral, la infección del hígado es auto-resolver mientras que la infección esplénica es progresiva 4. Estos resultados de la infección por Leishmania con respecto a los órganos individuales son todavía no completamente entendidos. Investigación de la hemodinámica de hígado y bazo en condiciones patológicas arrojará nueva luz sobre las interacciones huésped-parásito y patogénesis de la enfermedad.
Nuestro sistema modelo experimental se basa en la exposición y la obtención de imágenes del hígado de un ratón anestesiado que recibió la inyección intravenosa de tintes fluorescentes específicas para el etiquetado de la intravasculature hepática. El hígado es un órgano favorable para microscopía intra-vital. Después de realizar un pequeño incision en el abdomen, el hígado se exterioriza y se coloca en una gasa húmeda, luego en un cubreobjetos con el objetivo de reducir los artefactos de movimiento debido a latidos del corazón y la respiración suavemente. El hígado se coloca entonces dentro de la vista de una lente de microscopio. En comparación con el nodo linfático y bazo que requiere el uso de dos fotones para los estudios de microscopía de IVM, la ventaja de que el hígado se encuentra en su arquitectura 3D homogénea / anatomía que permite el uso de un microscopio confocal convencional, con una profundidad máxima de penetración de aproximadamente 50 micras, para obtener imágenes de microscopía intravital 5-8.
Este estudio describe dos métodos de imagen independientes para la medición cuantitativa de RBC velocidad y la velocidad de flujo sanguíneo en los vasos sanguíneos individuales. En el primer método, el flujo de sangre del hígado se adquiere usando un modo de bi-dimensional xy con el tiempo. Los datos XYT resultantes se analizan usando el plugin MtrackJ en el software ImageJ libre, que permite el seguimiento de individUAL glóbulos rojos en el tiempo. En el segundo método, se selecciona un solo vaso sanguíneo y su correspondiente flujo de sangre se analiza usando el análisis de la línea modo de adquisición rápida del microscopio de escaneo láser confocal. El vaso de interés se escanea a alta frecuencia a lo largo de su eje central a través de una línea axial. La velocidad del flujo sanguíneo se cuantifica a continuación, en base a la diferencia de contraste entre los eritrocitos y el plasma oscuros sin etiqueta marcada con fluorescencia. Las intensidades de fluorescencia de los glóbulos rojos y el plasma adquiridos a lo largo de la línea de exploración se representan gráficamente contra el tiempo para obtener rayas, los ángulos de las cuales son proporcionales a las velocidades de un RBC individual.
El objetivo de este artículo es proporcionar un método simple y reproducible para la imagen y la medición de la velocidad del flujo sanguíneo dentro de los vasos sanguíneos individuales del hígado y de poner a disposición las herramientas básicas para el buen desarrollo de la cirugía ratón, IVM y análisis cuantitativos de la velocidad glóbulos rojos individuales. Tsu enfoque permitirá a los investigadores a obtener nuevos conocimientos sobre la velocidad de la sangre en condiciones patológicas.
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Protocol
Declaración de Ética: se realizaron todos los estudios en animales, de acuerdo con las directrices y protocolos que fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Aix-Marsella, Francia. Mujer C57Bl / 6 ratones a 8-10 semanas de edad se obtuvieron comercialmente y manejarse de acuerdo con las reglas del Decreto N ° 8 87-848, 19 de octubre de 1987, París. Todos los experimentos utilizando L. parásitos donovani LD1S se llevaron a cabo de acuerdo con normas de bioseguridad de la legislación francesa y la Unión Europea.
1. Ratón La infección con L. donovani Promastigote parásitos
- Preparar el medio de cultivo para el mantenimiento in vitro de L. parásitos promastigotes donovani, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- Utilice medio M199. Suplemento medio M199 con 10% de suero de ternera fetal (inactivado con calor a 56 ° C durante 30 min), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO 3, glu 1 mMtamine, RPMI 16040 mezcla de vitaminas, ácido fólico 10 mM, adenosina 100 mM, hemina 7,6 mM, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina.
- Cultura LD1S parásitos en 10 ml de medio completo M199 a 26 ° C en un matraz de 25 cm 2 ventilado.
- El uso de sucesivas etapas de centrifugación diferencial, preparar una población de parásitos promastigotes que se enriquecen en formas metacíclicos.
- Cosechar un cultivo de parásitos mediados de la fase de registro. Cuente con un hemocytomer. Resuspender 5 x 10 5 parásitos / ml en 10 ml de medio completo M199. Mantener el cultivo del parásito en condiciones anaeróbicas hasta que alcanzan la fase estacionaria tardía (en aproximadamente 5-6 días).
- Girar la cultura LD1S a 1200 xg durante 10 min a 26 ° C para sedimentar los parásitos no metacíclicos, recuperar el sobrenadante y girar de nuevo a 2500 xg a 26 ° C durante 10 min.
Nota: Este sedimento final es altamente enriquecido en los parásitos promastigotes metacíclicos. - Resuspender el precipitado en 100 l de PBS. Retirar una pequeña alícuota para la fijación con 25% de glutaraldehído centésimas v: v y contar parásitos utilizando un hemocitómetro.
- Diluir la población de parásitos enriquecido con metacyclic a 1 x 10 7/100 l en PBS. Inyectar la suspensión parásito en la vena de la cola de un ratón anestesiado (ver a continuación) utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G. Para los animales de control, inyecte 100 l de PBS en la vena de la cola.
2. Procedimientos Quirúrgicos
- Desinfectar el espacio de trabajo con un spray desinfectante biocida y todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% durante 30 min.
- Preparar una solución anestésica, de acuerdo con el peso del animal, que contiene 125 mg / kg de ketamina y 12,5 mg / kg de xilazina diluido en PBS.
- Pesar el ratón y por vía intraperitoneal inyectar la dosis apropiada de anestesia utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G.
- Mantenga el ratón cálido y compruebe que el ratón es completamente anestheTized pellizcando la almohadilla de la pata antes de proceder. Vuelva a inyectar una dosis media de la solución anestésica en el ratón cada 60 min.
- Afeitarse el abdomen del ratón y limpiarlo con Vetedine. Hacer una pequeña incisión en la piel y la musculatura debajo de la caja torácica en el lado izquierdo del abdomen.
- Coloque un pedazo de gasa húmeda sobre el abdomen justo por debajo de la zona abierta. Exponer el hígado y colocarlo en la gasa. Coloque otro pedazo de gasa húmeda sobre el hígado.
- Colocar un 24 x 60 mm 2 a 150 micras de espesor cubreobjetos, cianoacrilato-unido a un armazón de metal, sobre el hígado para la visualización bajo un microscopio.
- Proteja los ojos del ratón con una gasa húmeda.
- Después de la sesión de imágenes, la eutanasia del animal anestesiado por dislocación cervical.
3. Microscopia intravital de imágenes de la arquitectura hepática
- Llevar a cabo los experimentos de microscopía intravital en un microscopio confocal invertido equipado con alcámara, un objetivo de inmersión 63X glicerol aceite apocromático (NA 1.4), argón (488 nm) y HeNe (543 nm, 633 nm) láseres y un diodo azul (405 nm) hermostatic controlada.
- Coloca el ratón sobre la platina del microscopio con el cubreobjetos cubriendo la cara de hígado sobre el objetivo. Ajuste la temperatura de la cámara a 29 ° C. Ajuste el enfoque utilizando la autofluorescencia hígado para permitir la visualización de los sinusoides.
- Para visualizar la vasculatura, preparar una solución de 500 mg BSA-Alexa 647 diluido en 100 l de PBS, para cada ratón. Inyectar esta solución por vía intravenosa en la vena de la cola del ratón anestesiado utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G.
- Para visualizar los núcleos de las células hepáticas, preparar una solución de Hoechst 33342 en PBS. Inyectar esta solución a 8 mg / kg de ratón por vía intraperitoneal usando una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G.
- Utilice el modo secuencial normal, el objetivo de inmersión 63X y el escáner en 400 Hz a la imagen de la hepáticanúcleos de las células y la vasculatura hepática. Encienda el 405 nm diodo azul para Hoechst excitación y el láser de 633 nm para BSA-Alexa 647 de excitación. Encienda el láser de argón 488 nm y definir una banda adquisición grande para visualizar el autofluorescencia hígado.
4. Microscopia intravital de imágenes del hígado para la medición de flujo sanguíneo velocidad
- Abra el software LAS del microscopio (LAS-AF visor Versión 3.1.0 build 8587). Seleccione el modo de escáner de resonancia al abrir el software de microscopio.
- Haga clic en la pestaña de configuración para configurar el hardware. Haga clic en láser y seleccione el láser HeNe 633. Haga clic en configuración y seleccione una resolución de 12 bits.
- Haga clic en el menú de adquisición. En la ventana de configuración de la vía de haz, seleccione el objetivo 63X y establecer la potencia del láser 633 a 100%. Active la ganancia de la señal y fuera de los parámetros establecidos por la selección de Alexa-633 en el menú desplegable PM1-3.
- En la pestaña de adquirir, seleccione la adquisición 'XYT'de modo. Ancho formato establecido en 1024 x 1024. Seleccione la velocidad a 8.000 Hz. Seleccione el agujero de 3 unidades de Airy. Seleccione un factor de zoom de 3. No seleccione el modo bidireccional.
5. Análisis Cuantitativo de RBC Velocity Utilizando los XYT Imágenes (Método 1)
- Haga clic en el icono de 'Live' para visualizar el flujo sanguíneo en un modo directo. Seleccione el área de interés y seleccione un vaso sanguíneo específico para el análisis. Ajuste el vaso de interés a la posición horizontal mediante el ajuste de la rotación de campo de coordenadas de escaneo de "X", "Y" y en el panel de control USB.
- Detenga el modo 'Live' una vez que el vaso de interés se fija. Cambie el conjunto de ancho formato a 1024 x 256 en el modo de adquisición de la ventana, la línea media = 1, marco Media = 1 ajuste, seleccione "pilas" 150. Haga clic en 'inicio' para adquirir imágenes.
- Para el análisis cuantitativo de la velocidad de RBC usando las imágenes "XYT" abren el software ImageJ. Seleccione la opción 'Archivo'pestaña en ImageJ, haga clic en "Abrir" y luego elegir el archivo de su interés.
- Vaya al menú "plugin" en ImageJ, seleccione Opciones LOCI y Bio-formatos de importación. En esta ventana, seleccione la pila de visualización parámetros como 'HyperStack'. En la opción de orden de apilamiento, seleccione la opción: "xyzct". Nota: Se abrirá una ventana con toda la serie de adquisiciones.
- Haga clic en "Plugins" en el menú y seleccione la opción ImageJ MTrackJ. Haga clic en el icono 'Añadir' en la pequeña ventana y haga clic en el RBC para realizar un seguimiento. Haga clic en la misma RBC en cada trama siguiente y haga clic en el icono de "medida" para medir la velocidad.
Nota: El archivo generado se pueden guardar en formato .exl. - El seguimiento de un mínimo de cinco glóbulos rojos por buque y analizar un mínimo de tres vasos individuales del mismo tamaño.
6. Análisis Cuantitativo de RBC velocidad utilizando la línea xt Imágenes (Método 2)
- Haga clic en 'Live' para visualizar el f sangrebaja en el modo directo. Seleccionar un vaso sanguíneo específico para el análisis. Ajuste el vaso de interés a la posición horizontal. Detenga el modo 'Live' una vez que el vaso de interés se fija.
- Seleccione el modo de escaneo "xt" y establecer el lumen central del buque seleccionado a lo largo de la línea de exploración. Conjunto ancho formato en 1024 x 512, velocidad = 8,000Hz, línea media = 32, tiempo = 512. Haga clic en "Inicio" y adquirir las imágenes de líneas xt.
- Generar rayas para el análisis cuantitativo de la velocidad de RBC abriendo el archivo .lif y la apertura de la imagen de la línea xt de interés. En el software LAS-AF, seleccione "experimentos", abra el .lif y seleccione la imagen. Nota: se abrirá automáticamente una quimógrafo.
- Medir el tiempo (t, obtenido en el eje Y) requerida para una racha de partículas (que muestra la reflexión oscuro) para recorrer una cierta distancia (d, obtenido en el eje X) en este quimógrafo. Seleccione la herramienta "dibujar la línea" y trazar una línea horizontal a la racha. Tenga en cuenta la distancia enmicras y el tiempo en segundos que se generan en la pestaña resultado en la parte inferior de la imagen.
- Calcula la velocidad como V = distancia / tiempo usando los valores obtenidos a partir de la quimógrafo.
- Cuantificar un mínimo de cinco partículas rayas imagen por xt y un mínimo de tres vasos individuales del mismo tamaño.
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Representative Results
La organización arquitectónica específica de los sinusoides del hígado puede ser visualizado basa en la propiedad autofluorescente de este órgano (Figura 1, panel B y C, verde), la inyección intraperitoneal de Hoechst para el etiquetado de los núcleos de los hepatocitos (Figura 1B, azul) y la inyección intravenosa de BSA fluorescente para la tinción del sistema circulatorio hepática (Figura 1C, rojo). El hígado se compone de varios subtipos diferentes de los vasos con diferentes funciones y estructuras y tamaños que van desde 40 hasta 700 micras 2 de diámetro (D) (D de vasos pequeños es entre 40-80 micras 2 y D de los grandes vasos es superior a 300 micras 2 ). Formación de imágenes de microscopía intravital del hígado permite la visualización en alta resolución de la heterogeneidad y complejidad de la vasculatura del hígado (Figura 1C).
Para controlar la velocidad del flujo sanguíneo en Vess individuoels, dos metodologías diferentes se utilizan para el análisis de adquisición de imágenes y datos de los vasos sanguíneos del hígado in vivo. En el primer método, imágenes en tiempo real del flujo sanguíneo en un vaso de interés se realiza usando el modo de escaneo xyt (Película 1). Análisis cuantitativo de la velocidad de un RBC individuo en un solo recipiente se realiza utilizando el plugin MTrackJ en el software ImageJ (Figura 2A y 2B). Un mínimo de cinco partículas por buque se realiza un seguimiento en diferentes vasos que van desde 40 hasta 80 micras de diámetro 2. Los resultados obtenidos con este método dan valores consistentes y reproducibles a través de diferentes ratones y evaluar la velocidad de RBC en los pequeños vasos del hígado en valores entre 25-35 micras / sec (Figura 2C).
El segundo método consiste en escanear repetidamente a lo largo de una línea paralela a la pared del vaso, con la línea colocado en el centro de la luz del vaso.La Figura 3 muestra un análisis del marco xy (paneles de la izquierda) con la exploración de línea xt correspondiente (paneles de la derecha). La velocidad de un RBC individuo está dada por la relación V = distancia / tiempo y se calcula utilizando las proyecciones ortogonales sobre los ejes X e Y de la racha obtenido en la imagen xt. En las figuras 3D y 3E, cada punto de datos representa la velocidad de un individuo de RBC diferentes vasos pequeños o grandes seleccionados de diferentes ratones. Como se ve por las barras de error, los datos muestran una variación relativamente baja entre las velocidades de RBC e indican que la velocidad de flujo de sangre es mucho más rápido en los grandes vasos que en los vasos pequeños. Además, se observó una variación significativa en los valores de velocidad obtenidas a partir de diferentes tipos de grandes vasos, mientras que la velocidad del flujo sanguíneo es relativamente similar a través de diferentes tipos de vasos pequeños. Mediciones de flujo de sangre con este nuevo método generan datos que es comparable a los datos obtenidos a partir de la describir anteriormenteMétodo D utilizando MTrackJ (comparar Figura 2C a la figura 3D). La imagen en la Figura 3C representa un ejemplo típico de un experimento subóptima en el que la exploración de cuadros xy genera una imagen xt un-interpretable. En este caso particular, el problema resulta de tanto i) la internalización rápida de BSA en las células endoteliales que revisten el vaso de interés y ii) la presencia de una unión entre dos vasos que perturban el flujo de sangre en el área seleccionada de la adquisición. La tasa de internalización del reactivo de plasma en el endotelio que recubre el vaso sanguíneo es un parámetro crítico a considerar al medir la velocidad del flujo de sangre, como la internalización altera la calidad de la imagen xt que muestra las rayas. La tasa de internalización depende críticamente de la dosis del colorante que se inyecta por vía intravenosa. En la Figura 4 se muestra que 500 g de BSA-Alexa 647 y / o 500 kDa de dextrano-FITC son las dosis óptimas que Should ser utilizado para la cuantificación de la velocidad del flujo de sangre. Estas dosis generan una señal muy brillante que permite la identificación de la RBC como partículas oscuras contra un fondo brillante y permiten la visualización de flujo sanguíneo durante un mínimo de 1 hr sin internalización del tinte inyectado (Figura 4, panel inferior). En contraste, 50 g de BSA-Alexa 647 y / o 500 kDa de dextrano-FITC (no mostrado), permitiendo al mismo tiempo la visualización de la red vascular del hígado, es una dosis subóptima para medir la velocidad del flujo sanguíneo debido a la internalización muy rápido de el colorante, que comienza en 5 min después de la inyección (Figura 4, panel inferior).
Cuando la aplicación de esta metodología para el hígado de los animales infectados, se observó un aumento significativo en la velocidad del flujo de sangre tan pronto como 1 hora después de la infección. La alteración de la velocidad de RBC se mantiene hasta 24 horas después de la infección. En última instancia, alcanza valores normalesa las 72 horas después de la inyección de parásitos (Figura 5). Por lo tanto, este experimento valida el uso de esta metodología para obtener nuevos conocimientos sobre la influencia de las condiciones patológicas sobre la hemodinámica hepática.
Figura 1: Microscopia intravital del hígado del ratón (A) la cirugía de hígado del ratón.. Una pequeña área de un lóbulo hepático está expuesta después de la cirugía, dos piezas de gasa húmeda se colocan alrededor de ella y una corredera se pone en el abdomen para cubrir el hígado antes de la ratón de ser colocado en la etapa de un microscopio confocal. (B, C) Imagen de un área representativa del hígado de un ratón no infectada que demuestra los sinusoides hepáticos y los diferentes tamaños de los buques que componen el órgano hepático. Autofluorescencia hígado se muestra en verde. El ratón se inyecta con Hoechst 33342 (azul) para etiquetar el hnúcleos epatocyte (B) y inyectados con BSA-Alexa 647 (rojo) para visualizar la vasculatura hepática (C). Las barras de escala, 50 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Análisis cuantitativo de RBC velocidad de una exploración Marco xy usando el software ImageJ (A) Imagen xy Representante de circulación de la sangre en un vaso pequeño de hígado adquirida por imágenes de microscopía intravital del hígado del ratón usando el modo de escaneo xy rápido. Las áreas oscuras corresponden a los glóbulos rojos. Barra de escala, 10 micras. (B) Cuantificación de la velocidad de una sola RBC usando el plugin MTrackJ de ImageJ. Lines (rojo, amarillo, blanco) representan la trayectoria en el tiempo de un RBC individual. Velocidad (C) RBC en sm individuotodos (D es de aproximadamente 50 m 2) vasos hepáticos. El gráfico traza el valor de la velocidad de cinco glóbulos rojos independientes rastreados en los vasos del hígado individuales que se selecciona de entre cinco ratones diferente (1 a 5). D representa el diámetro del vaso en m 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: flujo sanguíneo hepático Mediciones por intravital microscopía de imagen de un vaso sanguíneo utilizando el Modo xt Line Scanning imágenes xy representativos (paneles izquierdos) de los vasos hepáticos etiquetados con BSA-Alexa 647 y sus correspondientes imágenes xt (paneles derechos) obtenido de una. line-scan de la luz central de un buque determinado. (A, B) Pequeño (A) y granderecipiente de hígado (B). Los datos representativos de un experimento de sub-óptimo que muestra la intersección de dos vasos sanguíneos y BSA internalización en el endotelio (C). (D, E) Los gráficos trazar el valor de la velocidad de tres hematíes independientes por buque (pequeñas en D y E) en grandes seleccionados de cinco ratones diferentes. D representa el diámetro del vaso en m 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. El efecto de la dosis de la Plasma colorante fluorescente en su internalización en el endotelio de la guarnición los sinusoides esta imagen Pistas de la internalización de BSA y Dextrano 500 kDa en el endotelio que reviste los sinusoides, como una función del tiempo y la dosis de inyección.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efecto de L. infección donovani en Hemodinámica hepática. Este gráfico muestra los valores de la velocidad de la sangre obtenida de varios vasos sanguíneos individuales de ratones no infectados (NI) y ratones que fueron infectados con L. donovani y analizado 1 hora, 24 horas y 72 horas después de la infección (pi). Cada punto representa el valor medio de cinco mediciones de la velocidad RBC obtenido en un único recipiente de sangre de aproximadamente 50 micras 2. En cada condición (NI, 1 pi h, 24 h pi y 72 h pi) un mínimo de tres ratones fueron analizados para la velocidad del flujo sanguíneo. Las estrellas indican una diferencia significativa en la velocidad del flujo sanguíneo obtenido 1 hr y 24 hr pi comparación con los ratones de NI (P <0.01, de un modo Anova).
Película 1. Tiempo de lapso de intravital de imágenes de microscopía del ratón hígado. Película 1 corresponde a la Figura 3. El ratón recibió una inyección de BSA-Alexa 647 para visualizar la vasculatura. Se muestra el flujo de sangre en tres pequeños vasos (D de 50 m 2). Las zonas negras corresponden a RBC.
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Discussion
El reciente desarrollo de la microscopía intravital del hígado del ratón abre nuevas posibilidades para la investigación de la respuesta fisiológica a la infección in vivo y en tiempo real 5,9,10. El flujo sanguíneo de órganos es un parámetro fisiológico crítico que a menudo se altera en muchas enfermedades. Sin embargo, el estado de la hemodinámica hepática en condiciones fisiológicas e infecciosas sigue siendo un área poco explorada. En este estudio, los métodos basados en IVM, que fueron adaptados previamente para el estudio del bazo y la vasculatura tumoral, se llevaron a cabo para cuantificar la velocidad de flujo sanguíneo hepático dentro de un único recipiente y medir la velocidad RBC individuo in vivo 11,12. Las metodologías utilizadas aquí se basan en el contraste entre un fluoróforo plasma inyectado por vía intravenosa en el ratón, tal como BSA fluorescente, y los eritrocitos, que siguen siendo oscuras. En vivo mediciones de flujo de sangre tienen el potencial de mejorar nuestra comprensión de la enfermedad profesionalprocesos.
Aquí, se utilizaron dos metodologías y se compararon para medir el flujo sanguíneo en los vasos del hígado. La primera metodología es largo y exigente en términos de análisis de datos, ya que requiere que los usuarios rastrear manualmente el movimiento de RBC en un recipiente individual usando el plugin MTrackJ en el software ImageJ. La segunda metodología es simple y rápido, ya que consiste en el análisis de una imagen xt de un vaso sanguíneo generada a partir de una adquisición de exploración de línea con el modo de escáner resonante. Las dos metodologías dan datos comparables para los buques similares. En esta etapa es casi imposible comparar nuestros datos con los demás, ya que, a nuestro entender, la velocidad del flujo de sangre nunca se ha cuantificado en dichos buques pequeños y en los capilares sinusoidales ratón con una anchura de aproximadamente 10 micras. Métodos basados en IVM permiten alta resolución en xy de 500 nm permiten el análisis de una sinusoide con una anchura de 10-50 micras 13. En contraste, las técnicas basadas en Doppler sólo tienen un resol máximoution de 70 micras, lo que limita la medición del flujo de sangre a las arterias hepáticas y las venas portal 3.
Una de las principales medidas que es fundamental para la implementación exitosa de estas metodologías es una cirugía exitosa y el mantenimiento del ratón anestesiado en buen estado fisiológico durante toda la sesión de imágenes. Para ello, hay que controlar cuidadosamente la temperatura de la cámara del microscopio e inyectar anestésico cada hora. Otro paso crítico es la internalización del reactivo fluorescente plasma en el revestimiento del endotelio que puede ocurrir de forma natural después de su inyección. Tal internalización producirá imágenes xt no interpretables e imágenes xy contrastados-un. Este fenómeno depende de la dosis del colorante inyectado y se puede prevenir mediante la inyección de una dosis alta del reactivo de plasma (Figura 4).
Es importante destacar que con éxito imágenes de microscopía intravital del flujo sanguíneo hepático requiere ªe consideración de varios aspectos críticos. Estos incluyen la complejidad del sistema de la vasculatura del hígado, la presencia de diferentes subtipos de los vasos sanguíneos que contienen vasos pequeños y grandes con diferentes estructuras y funciones, diferentes circulaciones de sangre con flujo rápido y lento y rápidas velocidades de RBC. La principal limitación de la metodología que se basa en el análisis de una imagen de xt es la velocidad de adquisición de la embarcación y la falta de resolución Z, como la imagen se adquiere en 3D (xyt). Más específicamente, las tasas de exploración de línea de sistemas estándar alcanzan un límite de sensibilidad con respecto a la adquisición de los vasos sanguíneos grandes (diámetro por encima de 180 m 2) que se caracterizan por velocidades muy altas de RBC, que es el caso con las arterias. En el gran vaso, la trayectoria RBC puede estar fuera del plano de captación de imagen y los componentes que son perpendiculares al plano escaneada se excluyeron del análisis.
La metodología presentada here representa una herramienta ideal para la in vivo y cuantificación en tiempo real de varios parámetros de flujo de sangre en diversas condiciones patológicas. La investigación de la hemodinámica hepática arrojará nueva luz sobre los procesos de enfermedad y patogénesis del parásito en un órgano específico. Nuestros esfuerzos para obtener información sobre el sistema microvasculatura hepática aplicada a un modelo experimental murino de infección por Leishmania se abre la posibilidad de que la correlación de varios parámetros de flujo sanguíneo con la multiplicación del parásito y el desarrollo de la enfermedad en este órgano, en tiempo real. El mayor desarrollo de reactivos, instrumentos y la metodología para la caracterización mejorada del sistema vascular del hígado por IVM durante la infección es de gran importancia para el estudio de la influencia de la colonización del parásito en este parámetro fisiológico y, recíprocamente, la influencia de la sangre fluya en patogénesis Leishmania. Esta estrategia se puede extender potencialmente a otros infecciosasistemas en los que los agentes patógenos se dirigen al hígado.
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Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el INSERM, la Universidad de Aix-Marseille y un premio de Desarrollo Profesional de HFSPO obtenida por CL Forestier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
