Abstract
Intramikroskopi (IVM) er en kraftig optisk avbildningsteknikk som har gjort det mulig visualisering, overvåking og kvantifisering av ulike biologiske hendelser i sanntid og i levende dyr. Denne teknologien har sterkt utvidet vår forståelse av fysiologiske prosesser og patogen-mediert fenomener i bestemte organer.
I denne studien blir IVM påføres på muselever og protokoller er utviklet for å avbilde in vivo sirkulasjonssystemet i leveren og måle røde blodceller (RBC) hastighet i enkelte hepatiske skip. For å visualisere de ulike fartøys subtyper som preger lever organ og utføre blodstrøm fartsmålinger, er C57Bl / 6 mus injisert intravenøst med et fluorescerende plasma reagens som merker leveren assosierte blodkar. IVM muliggjør in vivo, sann tid, måling av RBC hastighet i et bestemt fartøy av interesse. Etablering av denne metoden vil gjøre det mulig åundersøke lever hemodynamikk under fysiologiske og patologiske tilstander. Til slutt vil dette bildebasert metode være viktig for å studere innflytelsen av L. donovani infeksjon av lever hemodynamics.
Denne metoden kan anvendes på andre infeksjonsmodeller og mus organer og kan bli ytterligere utvidet til pre-klinisk testing av et medikament effekt på inflammasjon ved å kvantifisere dets virkning på blodstrømmen.
Introduction
Organspesifikk hemodynamics er viktige fysiologiske funksjoner av alle pattedyr organ. Avvik i blodstrømmen kan bli konsekvensen av betennelse og et tegn på organdysfunksjon 1. Således synes blodstrøm utforming, struktur og funksjon som kritiske parametre for analyse under fysiologiske og patologiske tilstander. De teknikker som har vært vanlig anvendt for å analysere blodstrøm i et bestemt organ inneholde flere begrensninger, inkludert oppløsning begrensning av teknikken i seg selv den (f.eks Doppler-billeddannelse av blodstrøm), kapasiteten for måling av absolutt blodstrøm bare (volum av blod per Enheten betjener et organ) (f.eks Optical Coherence tomografi) og måling av gjennomsnitts endringer i hastighet i en stor og heterogen befolkning av blodkar 2,3. Leveren sirkulasjonssystemet knytter ulike fartøys subtyper som er heterogene i sin størrelse, struktur og funksjon. Idenne studien, intravital mikroskopi (IVM) avbildningsteknologi anvendes for å vurdere lever hemodynamikk in vivo, i sann tid og med høy oppløsning, og i parallell for å avdekke egenskapene til de individuelle blodkar som utgjør den hepatiske organ. Den siste utviklingen av dette kraftige optiske avbildningsteknikk tillater forskeren å samle dynamisk data på levende dyr på en høy romlig og tidsmessig oppløsning. Ved å tillate den direkte visualisering og sanntids overvåkning av spesifikke og raske biologiske prosesser in vivo, gir IVM en unik mulighet til forskeren til bilde individuelle blodkar, og måle og kvantifisere hastigheten av enkelt røde blodceller (RBC) i løpet av et spesielt utvalgt lever fartøyet.
I denne studien har vi implementert IVM teknikk i muselever for å undersøke påvirkning av musen infeksjon av hepatotrope Leishmania parasitt på lever hemodynamics. L. donovanier agent ansvarlig for visceral leishmaniasis, en alvorlig sykdom karakterisert ved akutte-on-kroniske inflammatoriske responser og en patologi som er tilstede i flere organer, inkludert milten og leveren. I en eksperimentell musemodell for visceral leishmaniasis, er leveren infeksjon selv løse mens milt infeksjon er progressiv 4. Disse resultatene av Leishmania infeksjon med hensyn til de enkelte organer er fortsatt ikke helt forstått. Gransking av lever og milt hemodynamics henhold patologiske tilstander vil kaste nytt lys over verts-parasitt interaksjoner og sykdom patogenesen.
Våre eksperimentelle modellsystem er basert på å eksponere og avbilding av lever fra en bedøvet mus som fikk intravenøs injeksjon av spesifikke fluorescerende fargestoffer for merking av den hepatiske intravasculature. Leveren er et gunstig organ for intra-vital mikroskopi. Etter å ha utført en liten incision i magen, er leveren forsiktig externalized og plassert på våt gasbind, deretter på et dekkglass med mål om å redusere eventuelle bevegelsesartefakter grunn av hjerterytme og åndedrett. Leveren er deretter plassert inne i riss av et mikroskop linse. I forhold til milt og lymfeknute som krever bruk av to fotonmikroskopi for IVM studier, fordelen av leveren ligger i dens homogene 3D-arkitektur / anatomi som tillater bruk av en konvensjonell konfokalt mikroskop, med en maksimal inntrengningsdybde ca 50 mikrometer, for intramikroskopi bildebehandling 5-8.
Denne studien beskriver to uavhengige avbildnings metoder for kvantitativ måling av RBC hastigheten og blodstrøm hastighet i individuelle blodkar. I den første metoden blir leverblodstrøm ervervet ved å bruke en xy todimensjonal modus over tid. De resulterende XYT data er analysert ved hjelp av MtrackJ plugin i fri ImageJ programvare, som gir mulighet for sporing av individUAL RBC over tid. I den andre metoden blir en enkelt blodkar utvalgt, og den tilsvarende blodstrøm blir analysert ved hjelp av linjeskanne hurtig oppfangningsmodus av det konfokale laserskanningsmikroskop. Fartøyet av interesse er skannet ved høy frekvens langs den sentrale aksen gjennom en aksial linje. Den blodstrømningshastigheten blir så kvantifisert basert på forskjellen i kontrast mellom umerkede mørke erytrocytter og fluorescensmerket plasma. Fluorescensstyrkene RBC og plasma ervervet etter linjen scan er plottet mot tiden for å oppnå striper, vinklene som er proporsjonale med hastighetene til et individ RBC.
Målet med denne artikkelen er å tilveiebringe en enkel og reproduserbar fremgangsmåte for avbildning og måling av blodstrømningshastigheten i den enkelte blodkar i leveren, og for å gjøre tilgjengelig den grunnleggende verktøy for en vellykket utførelse av mus kirurgi, IVM og kvantitative analyser av hastigheten individuelle RBC. Thans tilnærming vil tillate forskere å få ny innsikt i blodet hastighet etter patologiske tilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Alle dyrestudier ble utført i samsvar med retningslinjer og protokoller som ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i Aix-Marseille Université, Frankrike. Kvinne C57Bl / 6 mus i 8-10 uker gammel ble kommersielt innhentet og behandlet i henhold til reglene i Décret N ° 8 87-848, 19 oktober 1987, Paris. Alle eksperimenter med L. donovani LD1S parasitter ble utført i samsvar med biologisk forskrifter fra fransk og europeisk union lovgivning.
1. Mouse Infeksjon med L. donovani Promastigote Parasitter
- Klargjør kulturmediet for in vitro vedlikehold av L. donovani promastigote parasitter, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- Bruk M199 medium. Supplement M199 medium med 10% føtalt kalveserum (varmeinaktivert ved 56 ° C i 30 min), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO3, 1 mM GluTamine, RPMI 16040 vitaminblanding, 10 mM Folinsyre, 100 mM adenosin, 7,6 mM hemin, 50 U / ml penicillin og 50 mg / ml streptomycin.
- Culture LD1S parasitter i 10 ml komplett M199 medium ved 26 ° C i en 25 cm2 kolbe ventilert.
- Ved hjelp av suksessive differensialsentrifugeringstrinn, utarbeide en befolkning på promastigote parasitter som er beriket i metacyclic former.
- Høste en mid-log fase parasitt kultur. Regne med en hemocytomer. Resuspender 5 x 10 5 parasitter / ml i 10 ml komplett medium M199. Grow parasitten kultur i anaerobe forhold til de når slutten av stasjonær fase (i ca 5-6 dager).
- Spinn LD1S kulturen ved 1200 xg i 10 min ved 26 ° C for å pelletere ikke-metacyclic parasitter, gjenvinne supernatanten og spinne det igjen ved 2500 xg ved 26 ° C i 10 min.
Merk: Denne endelige pellet høyanriket i metacyclic promastigote parasitter. - Resuspender pelleten i ett00 mL PBS. Fjerne en liten delmengde for fiksering med 25% glutaraldehyd 1/100 v: v og telle parasitter ved hjelp av en hemocytometer.
- Fortynne beriket-metacyclic parasitt befolkningen til 1 x 10 7/100 ul i PBS. Injiser parasitten suspensjonen inn i halevenen til en bedøvet mus (se nedenfor) ved anvendelse av en 1 ml sprøyte med en 30 G nål. For kontrolldyrene, injisere 100 ul PBS i halevenen.
2. kirurgiske prosedyrer
- Desinfiser arbeidsplass med et biocid desinfiserende spray og alle de kirurgiske instrumenter med 70% etanol i 30 min.
- Tilbered en bedøvelse løsning, i henhold til vekten av dyret, inneholdende 125 mg / kg ketamin og 12,5 mg / kg xylazin fortynnet i PBS.
- Vei musen og intraperitonealt injisere riktig dose av anestesi med en 1 ml sprøyte med en 30 G nål.
- Hold musen varm og sjekk at musen er helt anesthedøpt ved å klemme foten puten før du fortsetter. Re-injisere en halv dose av narkosen løsningen i hver mus 60 min.
- Barbere musa mage og rengjør den med Vetedine. Lag et lite snitt i huden og muskulaturen under brystkassen på venstre side av magen.
- Legg et stykke fuktig gasbind på magen like under den åpne området. Expose leveren og plassere den på gasbind. Lå et stykke fuktig kompress over leveren.
- Plasser en 24 x 60 mm 2-150 um tykt dekkglass, cyanoakrylat-bundet til en metallramme, på leveren for visualisering under et mikroskop.
- Beskytt øynene av musen med en våt gasbind.
- Etter bildebehandling økten, avlive den bedøvet dyret ved halshugging.
3. intraMikrosKopi Imaging av leveren Architecture
- Utføre intramikroskopi eksperimenter på en invertert konfokal mikroskop utstyrt med vedhermostatic kontrollert kammer, en apokromatisk 63X olje glyserol nedsenking objektiv (NA 1.4), Argon (488 nm) og HeNe (543 nm, 633 nm) lasere og en blå diode (405 nm).
- Plasser musen på scenen av mikroskop med dekkglass dekker leveren forsiden ned på målet. Sett temperaturen i kammeret til 29 ° C. Juster fokus med leveren autofluorescence å tillate visualisering av sinusoids.
- For å visualisere vaskulaturen, fremstille en løsning av 500 ug BSA-Alexa 647 fortynnet i 100 ul PBS, for hver mus. Injisere oppløsningen intravenøst i halevenen til en bedøvet mus ved anvendelse av en 1 ml sprøyte med en 30 G nål.
- Å visual leveren cellekjerner, utarbeide en løsning av Hoechst 33342 i PBS. Injiser denne løsningen ved 8 mg / kg av mus intraperitonealt med en 1 ml sprøyte med en 30 G nål.
- Bruk normal sekvensiell modus, 63X nedsenking objektiv og skanneren ved 400 Hz til bilde levercellekjerner og leveren blodkar. Slå på 405 nm blå diode for Hoechst eksitasjon og 633 nm laser for BSA-Alexa 647 eksitasjon. Slå på Argon 488 nm laser og definere et stort oppkjøp band til å visualisere leveren autofluorescence.
4. intraMikrosKopi Imaging av leveren for Blood Flow Speed Measurement
- Åpne LAS programvare av mikroskopet (LAS-AF viewer Versjon 3.1.0 build 8587). Velg resonans skannermodus når du åpner mikroskop programvare.
- Klikk på fanen konfigurasjon for å sette maskinvaren. Klikk på laser og velg HeNe 633 laser. Klikk på innstillinger og velge 12 bits oppløsning.
- Klikk på kjøpet menyen. I strålen innstillinger pathway vinduet, velg målet 63X og sette opp 633 laser makt til 100%. Aktiver signalforsterkning og av innstilte parametere ved å velge Alexa-633 fra PM1-3 nedtrekksmenyen.
- I kategorien erverve velge 'XYT' oppkjøp,modus. Satt format bredde på 1,024 x 1,024. Velg hastighet på 8000 Hz. Velg pinhole av 3 Airy enheter. Velg en zoomfaktor på 3. Ikke velg toveismodus.
5. Kvantitativ analyse av RBC Velocity Bruke XYT Images (metode 1)
- Klikk på "live" ikonet for å visualisere blodstrømmen på en live-modus. Velg område av interesse og velge en bestemt blodåre for analyse. Sett fartøy av interesse for horisontal posisjon ved å justere "X", "Y" og skanne feltet rotasjon koordinater på USB kontrollpanelet.
- Stopp "live" modus når fartøyet av interesse er satt. Endre formatet sett bredden til 1024 x 256 i oppkjøpet modus innstillingsvinduet, linje gjennomsnitt = 1, ramme gjennomsnitt = 1, velg "stabler" 150. Klikk på "start" for å hente bilder.
- For kvantitativ analyse av RBC hastighet ved hjelp av "XYT" bilder åpne ImageJ programvare. Velg "File"fanen i ImageJ, klikk på "Open" og velg filen av interesse.
- Gå til "plugin" -menyen i ImageJ velger loci og Bio-formater importere alternativer. I dette vinduet velger stabelen visning parametere som 'hyperstack'. I bunken for alternativet, velg alternativet: "xyzct". Merk: Dette åpner et vindu med all rekke oppkjøp.
- Klikk på "Plugins" på ImageJ menyen og velg MTrackJ alternativet. Klikk på "Legg til" -ikonet på det lille vinduet og klikk på RBC å spore. Klikk på den samme RBC i hvert følgende ramme og klikk 'mål' ikonet for å måle hastigheten.
Merk: Filen genereres kan lagres i .exl format. - Spor minimum fem RBC per fartøy og analysere et minimum av tre individuelle skip av samme størrelse.
6. Kvantitativ analyse av RBC Velocity Bruke xt linje Images (metode 2)
- Klikk på "live" for å visualisere blodet flav i live mode. Velg blodåre for analyse. Sett fartøy av interesse til horisontal posisjon. Stopp "live" modus når fartøyet av interesse er satt.
- Velg "xt 'skannemodus og sette den sentrale lumen av valgt skip langs linjen scan. Set format bredde på 1024 x 512, fart = 8,000Hz, linje gjennomsnitt = 32, tid = 512. Klikk på "Start" og tilegne seg xt linjebilder.
- Generere streker for kvantitativ analyse av RBC hastighet ved å åpne .lif fil og åpne xt linje bildet av interesse. I LAS-AF-programvaren, velger du "eksperimenter", åpner .lif og velg bildet. Merk: Det vil automatisk åpne en kymograph.
- Mål tiden (t, oppnådd på Y-aksen) som kreves for en partikkel strek (viser mørkt refleksjon) for å reise en viss avstand (d, oppnådd på x-aksen) på denne kymograph. Velg verktøyet "tegne line" og trekke en linje horisontalt til strek. Legg merke til avstanden ium og den tid i sekunder som genereres på fliken resultatet ved bunnen av bildet.
- Beregn hastigheten som V = avstand / tid ved hjelp av verdier hentet fra kymograph.
- Kvantifisere minimum fem partikler striper per xt bilde og et minimum av tre individuelle skip av samme størrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den spesifikke arkitektoniske organiseringen av sinuskurver i leveren kan visualiseres basert på autofluorescent egenskap av dette organ (figur 1, felt B og C, grønt), intraperitoneal injeksjon av Hoechst for merking av hepatocytter kjerner (figur 1B, blå) og intravenøs injeksjon av fluorescerende BSA for farging av den hepatiske sirkulasjonssystemet (figur 1C, red). Leveren er sammensatt av flere ulike fartøysundertyper med forskjellige funksjoner og strukturer og størrelser 40 til 700 mikrometer i diameter 2 (D) (D av små fartøyer er mellom 40-80 mikrometer 2 og D av store skip er over 300 um 2 ). Intravital mikros avbildning av leveren muliggjør visualisering med høy oppløsning av heterogenitet og kompleksiteten av leveren vaskulaturen (figur 1C).
Å overvåke blodstrømmen hastighet i enkelte Vessels, er to forskjellige metoder som brukes for bildeopptak og dataanalyse av leveren blodkar in vivo. I den første metoden, er sanntid avbildning av blodstrømmen i et fartøy av interesse utføres ved hjelp av XYT skannemodus (Movie 1). Kvantitativ analyse av hastigheten til et individ RBC i en enkel kar utføres med den MTrackJ plugin i ImageJ programvare (Figur 2A og 2B). Et minimum på fem partikler per fartøy spores i ulike fartøy som varierer 40-80 mikrometer 2 av diameter. Resultatene oppnådd med denne metoden resultatene gir konsistente og reproduserbare verdier på tvers av forskjellige mus og evaluere RBC hastigheten i små lever skip ved verdier mellom 25-35 mikrometer / sek (Figur 2C).
Den andre metoden består av gjentatte skanning langs en linje parallelt med beholderveggen, med linjen plassert i sentrum av beholderen lumen.Figur 3 viser en xy ramme scan (venstre panel) med tilsvarende xt linje scan (høyre panel). Hastigheten av et individ RBC er gitt av forholdet V = avstand / tid og beregnes ved hjelp av de ortogonale projeksjoner på X- og Y-aksen til den strek oppnådd i xt bildet. I figurene 3D og 3E, representerer hvert datapunkt hastigheten til et individ RBC fra forskjellige små eller store fartøyer valgt fra forskjellige mus. Som det fremgår av feilstolpene, viser dataene en forholdsvis lav variasjon mellom RBC-hastighetene og indikerer at blodstrøm-hastigheten er betydelig raskere i store skip enn i små fartøyer. I tillegg ble det en betydelig variasjon i hastighets verdier hentet fra ulike typer store fartøy observert mens blodstrømmen hastighet er relativt lik på tvers av ulike typer av små fartøy. Blodstrømsmåling med denne nyere metoden generere data som er sammenlignbare med data innhentet fra tidligere beskrived metode med MTrackJ (sammenlign figur 2C Figur 3D). Bildet i figur 3C representerer et typisk eksempel på en suboptimal eksperiment hvor xy-rammen skanningen genererer et un-tolk xt bilde. I dette spesielle tilfellet, resulterer problemet fra begge i) den raske internalisering av BSA i endotelcellene lining fartøy av interesse og ii) tilstedeværelsen av en overgang mellom to fartøy som perturbs blodstrømmen i det valgte området av oppkjøpet. Hastigheten for internalisering av plasmaet reagens til endotelet foring av blodkar er en kritisk parameter for å vurdere ved måling av blodstrømmen hastighet, som internalisering vil forringe kvaliteten av det xt bilde som viser striper. Internalise hastighet kritisk avhengig av dosen av fargestoffet som blir injisert intravenøst. I Figur 4 viser vi at 500 mikrogram av BSA-Alexa 647 og / eller 500 kDa dekstran-FITC er de optimale doser som ShouLD brukes for kvantifisering av blodstrøm hastighet. Disse dosene generere en meget lys signal som gjør det mulig for identifikasjon av RBC som mørke partikler mot en lys bakgrunn, og muliggjøre visualisering av blodstrømmen i minst en time uten internalisering av det injiserte fargestoff (figur 4, nedre panel). I motsetning til dette, 50 ug BSA-Alexa 647 og / eller 500 kDa Dextran-FITC (ikke vist), samtidig som for visualisering av leverens vaskulære nettverket, er en suboptimal dose for måling av blodstrømningshastigheten på grunn av den meget raske internalisering av fargestoff, som starter ved 5 min etter injeksjon (figur 4, nedre panel).
Ved påføring av denne metodikken til leveren av infiserte dyr, vi har observert en signifikant økning i blodstrømningshastigheten så raskt som 1 time etter infeksjon. Endring av RBC hastigheten opprettholdes inntil 24 timer etter infeksjon. Den når til slutt normale verdierved 72 timer etter injeksjon parasitt (figur 5). Således bekrefter dette eksperiment ved bruk av denne metoden for å få ny innsikt i påvirkning av patologiske tilstander i leveren hemodynamikk.
Figur 1: intraMikrosKopi av musen Liver (A) leverkirurgi på musen.. Et lite område med en leverlapp er utsatt etter operasjonen, er to fuktige gasbind stykker plassert rundt det, og et lysbilde er satt på magen til å dekke leveren før musen blir plassert på scenen av en konfokal mikroskop. (B, C) bilde av et representativt område i leveren av et ikke-infiserte mus som viser leveren sinusoids og de forskjellige størrelser av de kar som utgjør den hepatiske organ. Liver autofluorescence vises i grønt. Musen er injisert med Hoechst 33342 (blå) til å merke den hepatocyte kjerner (B) og injisert med BSA-Alexa 647 (rød) for å visualisere leveren vaskulaturen (C). Skala barer, 50 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Kvantitativ analyse av RBC Velocity fra en xy Frame Scan bruker ImageJ programvare (A) Representant xy bilde av blodsirkulasjonen i en liten lever fartøyet erverves av intramikros avbildning av musen leveren ved hjelp av rask xy skannemodus. Mørke områder tilsvarer RBC. Scale bar, 10 mikrometer. (B) Kvantifisering av hastigheten til en enkelt RBC bruker MTrackJ plugin fra ImageJ. Linjer (rødt, gult, hvitt) representerer banen over tid fra et RBC. (C) RBC hastighet i enkelte smalle (D er ca 50 mikrometer 2) lever fartøy. Diagrammet plotter verdien av hastigheten av fem uavhengige RBCs sporet i enkelte lever fartøy som ble valgt ut fra fem forskjellige mus (1 til 5). D representerer diameteren på fartøyet i mikrometer to. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Liver blodstrømsmåling av intraMikros Imaging av en blodåre som bruker xt Linje Skannemodus Representative xy bilder (venstre paneler) av leverårene merket med BSA-Alexa 647 og deres tilsvarende xt bilder (høyre panel) hentet fra en. line-scan av de sentrale lumen av et enkelt skip. (A, B) Liten (A) og storLeveren beholder (B). (C) Representative data fra en sub-optimal eksperiment viser skjæringspunktet mellom to blodkar og BSA internalisering i endotelet. (D, E) Grafene plotte verdien av hastigheten av tre uavhengige RBC per fartøy (små og store i D i E) valgt fra fem forskjellige mus. D representerer diameteren på fartøyet i mikrometer to. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 4: Virkningen av dosen av det fluoriserende fargestoff Plasma på sin Internalisering i endotelet Belegg på sinus Dette bildet sporer internalisering av BSA og Dextran 500 kDa i endotelet som kler sinusformer, som en funksjon av tid og injeksjon dose.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Effekt av L. donovani infeksjon på lever hemodynamikken. Denne grafen plotter verdiene av blodet hastighet som oppnås fra flere individuelle blodkar fra ikke-infiserte mus (NI), og mus som ble infisert med L. donovani og analysert 1 time, 24 timer og 72 timer etter infeksjon (pi). Hvert punkt representerer gjennomsnittsverdien for fem RBC hastighetsmålingene oppnådd i et enkelt blodkar på omtrent 50 mikrometer 2. I hver tilstand (NI, 1 t pi, 24 timer og 72 timer pi pi) et minimum av tre mus ble analysert for blodstrøm hastighet. Stjernene indikerer en signifikant forskjell i blodstrømmen hastigheten oppnådd av 1 time og 24 timer pi forhold til Ni mus (P <0.01, en vei Anova).
Movie 1. Time-lapse intraMikrosKopi Imaging av musen Liver. Movie 1 tilsvarer figur 3. Musen fikk en injeksjon av BSA-Alexa 647 til å visualisere blodkar. Blodstrømmen i tre små kar (d av 50 mikrometer 2) er vist. Sorte områder tilsvarer RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den siste utviklingen av intravital mikroskopi av musen leveren åpner nye muligheter for etterforskningen av fysiologisk reaksjon på infeksjon in vivo og i sanntid 5,9,10. Organ blodstrøm er et kritisk fysiologisk parameter som ofte blir endret på mange sykdommer. Men status for lever hemodynamics under fysiologiske og infeksjonstilstander forblir et dårlig utforsket område. I denne studien IVM-baserte metoder, som tidligere ble tilpasset for undersøkelse av milt og tumorvaskulaturen, ble gjennomført for å kvantifisere leverblodstrøm hastighet innenfor en enkelt beholder og måle individuelle RBC hastighet in vivo 11,12. De metoder som brukes her er avhengige av kontrasten mellom en plasma fluorophore injisert intravenøst i musen, slik som fluorescerende BSA, og erytrocytter, som fortsatt mørkt. In vivo blodstrømsmåling har potensial til å forbedre vår forståelse av sykdom proprosesser.
Her ble to metoder anvendt og sammenlignet for å måle blodstrømmen i lever fartøy. Den første metoden er tidkrevende og kresen på sikt av dataanalyse som det krever at brukere å spore RBC bevegelse manuelt i en enkelte fartøy med MTrackJ plugin i ImageJ programvare. Den andre metoden er enkel og rask, da det består av analyse av et xt bilde av et blodkar som genereres fra en linje skanningsakkvisisjonsmodus med resonansskannermodus. De to metoder gi sammenlignbare data for tilsvarende fartøy. På dette stadiet er det nesten umulig å sammenligne våre data med andre, som, så vidt vi vet, blodstrøm hastighet har aldri blitt kvantifisert i slike små fartøy og i musesinusformet kapillærer med en bredde på ca 10 mikrometer. IVM-baserte metoder gir høy oppløsning i xy av 500 nm som muliggjør analyse av et sinussignal med en bredde på 10-50 mikrometer 13. I motsetning til dette, bare Doppler-baserte teknikker har en maksimal resolution på 70 mikrometer, og dermed begrense måling av blodstrømmen til leveren arterier og portal vener tre.
En av de viktigste trinnene som er avgjørende for en vellykket gjennomføring av disse metoder er en vellykket operasjon og vedlikehold av en bedøvet mus i god fysiologisk tilstand under hele avbildnings sesjonen. For å gjøre dette, må man nøye kontrollere temperaturen av mikroskopet kammeret og injisere bedøvelse hver time. Et annet kritisk punkt er internalisering av det fluorescerende plasma reagens til endotelet fôr som kan oppstå naturlig etter sin injeksjon. Slike intern vil produsere uninterpretable xt bilder og un-kontras xy bilder. Dette fenomenet er avhengig av dosen av den injiserte fargestoff, og kan forebygges ved å injisere en høy dose av plasma reagens (figur 4).
Viktigere, vellykket intramikros avbildning av leveren blodstrømmen krever the betraktning av flere kritiske aspekter. Disse inkluderer kompleksiteten av leveren blodkar-systemet, tilstedeværelse av forskjellige undertyper av blodkar som inneholder små og store fartøyer med forskjellige strukturer og funksjoner, forskjellige blod circulations med hurtig og langsom forandring og raske RBC hastigheter. Den viktigste begrensning av metoden som er basert på analyse av et bilde xt er hastigheten på kjøpet av fartøyet og mangel på Z oppløsning, mens bildet er ervervet i 3D (XYT). Mer spesifikt, linjeskanne priser av standardsystemer nå en grense på sensitivitet med hensyn til anskaffelse av store blodkar (diameter over 180 mikrometer 2) som er preget av svært høye RBC hastigheter, noe som er tilfellet med arterier. I det store fartøyet, kan RBC banen være ute av den avbildede planet og alle komponenter som er vinkelrett på det skannede flyet vil bli ekskludert fra analysen.
Metodikken presenteres here representerer et ideelt verktøy for in vivo og sanntids kvantifisering av flere blodstrømningsparametre under ulike patologiske tilstander. Etterforskningen av lever hemodynamics vil kaste nytt lys over sykdomsprosesser og parasitt patogenesen i et bestemt organ. Vår innsats for å få innsikt i leveren microvasculature systemet brukes til en eksperimentell musemodell for Leishmania infeksjon åpner opp muligheten for korrelasjonen av flere blodstrøms parametere med parasitten multiplikasjon og sykdomsutvikling i dette organet, i sanntid. Den videre utvikling av reagenser, verktøy og metodikk for forbedret karakterisering av leveren vaskulatur system ved IVM under infeksjon er av stor betydning for å studere innflytelsen av parasitt kolonisering på denne fysiologiske parameter og, gjensidig, påvirkning av blodstrømmen i Leishmania patogenesen. Denne strategien kan potensielt utvidet til andre smittsommesystemer der patogener målrette leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av INSERM, Universitetet i Aix-Marseille og en Karriereutvikling award fra HFSPO innhentet av CL Forestier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
