Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) är en kraftfull optisk bildteknik som har möjliggjort visualisering, övervakning och kvantifiering av olika biologiska händelser i realtid och i levande djur. Denna teknik har i hög grad avancerade vår förståelse av fysiologiska processer och patogen-medierad fenomen i specifika organ.
I denna studie är IVM appliceras på muslever och protokoll är utformade för att bilden in vivo cirkulationssystemet hos levern och mäta röda blodkroppar (RBC) hastighet i individuella lever fartyg. För att visualisera de olika fartygs subtyper som kännetecknar den hepatiska orgel och utföra blodflödet hastighetsmätningar är C57BL / 6-möss injicerades intravenöst med en fluorescerande plasma reagens som märker levern associerade kärlsystemet. IVM möjliggör in vivo realtid, mätning av RBC hastighet i ett visst fartyg av intresse. Etablering denna metod kommer att göra det möjligt attundersöka lever hemodynamik under fysiologiska och patologiska tillstånd. I slutändan kommer detta imaging baserad metod vara viktigt för att studera inverkan av L. donovani infektion på lever hemodynamiken.
Denna metod kan tillämpas på andra infektiösa modeller och musorgan och kan utvidgas ytterligare till pre-klinisk testning av ett läkemedels effekt på inflammatoriska sjukdomar genom att kvantifiera dess effekt på blodflödet.
Introduction
Organspecifika hemodynamiken är viktiga fysiologiska funktioner i alla däggdjursorgan. Avvikelser i blodflödet kan vara en följd av inflammation och ett tecken på organdysfunktion 1. Sålunda blodflöde organisation, struktur och funktion visas som kritiska parametrar för analys under fysiologiska och patologiska tillstånd. De tekniker som har vanligen användes för analys av blodflödet i ett specifikt organ innehåller flera begränsningar, inklusive upplösningsgränsen av tekniken i sig (t.ex. doppler avbildning av blodflödet), kapaciteten för mätning av absoluta blodflöde endast (volymen av blod per enhet som betjänar en orgel) (t.ex. optisk koherens tomografi) och mätning av genomsnittliga förändringar i hastighet i en stor och heterogen population av blodkärl 2,3. Levern cirkulationssystem kopplar olika fartygs subtyper som är heterogen i sin storlek, struktur och funktion. Idenna studie, intravital mikroskopi (IVM) bildteknik appliceras för att utvärdera lever hemodynamiken in vivo, i realtid, vid hög upplösning och parallellt för att avslöja egenskaperna hos de individuella blodkärlen som innefattar den hepatiska organet. Den senaste utvecklingen av denna kraftfulla optiska bildteknik gör det möjligt för forskare att samla in dynamiska data på levande djur vid en hög spatial och temporal upplösning. Genom att låta direkt visualisering och realtidsövervakning av specifika och snabba biologiska processer in vivo, ger IVM en unik möjlighet att forskaren fartyg bild individuell blod och mäta och kvantifiera hastigheten hos enskilda röda blodkroppar (RBC) i en speciellt utvalda hepatisk kärl.
I denna studie har vi genomfört IVM tekniken i muslever för att undersöka påverkan av infektions mus av hepatotropiskt Leishmania parasit på lever hemodynamik. L. donovaniär det medel som är ansvarigt för visceral leishmaniasis, en allvarlig sjukdom som kännetecknas av akut-på-kronisk inflammatoriska svar och en patologi som är närvarande i flera organ, inklusive mjälten och levern. I en experimentell musmodell av visceral leishmaniasis, är leverinfektion själv lösa medan mjälten infektionen är progressiv 4. Dessa resultat av Leishmania-infektion med avseende på de enskilda organen fortfarande inte helt klarlagd. Utredning av lever och mjälte hemodynamik i patologiska tillstånd kommer att kasta nytt ljus över värd-parasit interaktioner och sjukdom patogenes.
Vår experimentella modellsystem bygger på att exponera och avbildning levern hos en sövd mus som fick intravenös injektion av specifika fluorescerande färgämnen för märkning av lever intravasculature. Levern är ett gynnsamt organ för intra-vital mikroskopi. Efter att ha utfört en liten incision i buken, är levern försiktigt externalise och placeras på våt gasväv, sedan på en täck med målet att minska eventuella rörelseartefakter på grund av hjärtslag och andning. Levern placeras sedan inuti vy av en mikroskoplins. Jämfört med mjälten och lymfkörtel som kräver användning av två foton mikroskopi för IVM studier, fördelen av levern ligger i dess homogena 3D arkitektur / anatomi som möjliggör användning av en konventionell konfokalmikroskop, med ett maximalt inträngningsdjup av cirka 50 um, för intravital mikroskopi avbildning 5-8.
Denna studie beskriver två oberoende avbildningsmetoder för kvantitativ mätning av RBC hastighet och blodflöde hastighet i enskilda blodkärl. I den första metoden, är leverblodflödet förvärvats med hjälp av en xy tvådimensionell läge över tiden. De erhållna xyt data analyseras med användning av MtrackJ plugin i fri ImageJ mjukvara, som möjliggör spårning av individUAL RBC över tiden. I den andra metoden används en enda blodkärl väljs och dess motsvarande blodflöde analyseras med linjeavsöknings snabb följningsmoden för det konfokala lasersvepmikroskop. Kärlet av intresse skannas med hög frekvens längs dess centrala axel genom en axiell linje. Blodflödet hastigheten kvantifieras sedan baserat på skillnaden i kontrast mellan omärkta mörka erytrocyter och fluorescensmärkt plasma. De fluorescensintensiteter av RBC och plasma förvärvade längs linjeavsökningen plottas mot tiden för att få streck, vinklarna som står i proportion till de hastigheter för en enskild RBC.
Målet med denna artikel är att ge en enkel och reproducerbar metod för avbildning och mätning av blodflödeshastigheten inom enskilda blodkärl i levern och att tillhandahålla de grundläggande verktyg för en framgångsrik prestanda mus kirurgi, IVM och kvantitativa analyser av hastighet enskilda RBC. Thans inställning kommer att göra det möjligt för forskare att få nya insikter i blodhastigheten i patologiska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla djurstudier har utförts i enlighet med riktlinjer och protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén i Aix-Marseille Université, Frankrike. Kvinna C57BL / 6 möss vid 8 - 10 veckor gamla kommersiellt införskaffas och hanteras i enlighet med bestämmelserna i décret nr 8 87-848 19 oktober 1987, Paris. Alla experiment med användning av L. donovani LD1S parasiter genomfördes i enlighet med biosäkerhet föreskrifter från franska och EU: s lagstiftning.
1. Mus Infektion med L. donovani Promastigote Parasiter
- Förbered kommer odlingsmediet för in vitro-underhåll av L. donovani promastigote parasiter, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- Använd M199-medium. Supplement M199-medium med 10% fetalt kalvserum (värmeinaktiverat vid 56 ° C under 30 min), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCOs 3, 1 mM gluTamine, RPMI 16040 vitaminblandning, 10 mM folsyra, 100 mM adenosin, 7,6 mM hemin, 50 U / ml penicillin och 50 mg / ml streptomycin.
- Kultur LD1S parasiter i 10 ml av komplett M199-medium vid 26 ° C i en 25 cm 2 ventilerad kolv.
- Använda successiva differentialcentrifugeringssteg, förbereda en population av promastigote parasiter som anrikas i metacyclic former.
- Skörda en mid-log parasit fas kultur. Räkna med en hemocytomer. Resuspendera 5 x 10 5 parasiter / ml i 10 ml komplett M199-medium. Odla parasiten kultur i anaeroba förhållanden tills de når den sena stationära fasen (i cirka 5-6 dagar).
- Snurra LD1S odling vid 1200 xg under 10 minuter vid 26 ° C för att pelletera icke-metacyclic parasiter, återvinna supernatanten och snurra det igen vid 2500 xg vid 26 ° C under 10 minuter.
Obs! Detta slutliga pelleten höganrikat i metacyclic promastigote parasiter. - Resuspendera pelleten i 100 | il av PBS. Ta en liten portion för fixering med 25% glutaraldehyd 1/100 volym: volym och räkna parasiter med hjälp av en hemocytometer.
- Späd berikade-metacyclic parasit befolkningen 1 x 10 7/100 il i PBS. Injicera parasit suspensionen i svansvenen av en sövd mus (se nedan) med användning av en 1 ml spruta med en 30 G-nål. För kontrolldjur, injicera 100 pl PBS i svansvenen.
2. kirurgiska ingrepp
- Desinficera arbetsutrymme med en biocid desinfektionsmedel spray och alla kirurgiska instrument med 70% etanol i 30 min.
- Bered en anestetisk lösning, beroende på vikten av djuret, innehållande 125 mg / kg av ketamin och 12,5 mg / kg av xylazin utspätt i PBS.
- Väg musen och intraperitonealt injicera den lämpliga dosen av bedövningsmedel med användning av en 1 ml spruta med en 30 G nål.
- Håll musen varm och kontrollera att musen är helt anestheterade genom att klämma foten pad innan du fortsätter. Åter injicera en halv dos av bedövningslösningen i mus varje 60 minut.
- Raka musens buk och rengör den med Vetedine. Gör ett litet snitt i huden och muskulaturen i bröstkorgen på vänster sida av buken.
- Lägg en bit fuktig gasväv på buken strax under den öppnade området. Exponera levern och placera den på gasväv. Lägg en annan bit av fuktig gasväv över levern.
- Placera en 24 x 60 mm2 till 150 | im tjockt täckglas, cyanoakrylat-bunden till en metallram, på levern för visualisering under ett mikroskop.
- Skydda ögonen på musen med en våt gasväv.
- Efter avbildning session, avliva bedövades djuret genom cervikal dislokation.
3. Intravital Mikroskopi avbildning av levern Arkitektur
- Utför intravital mikroskopi experiment på ett inverterat konfokalmikroskop utrustad med åtminhermostatic kontrollerad kammare, en apokromatiska 63X olje glycerol nedsänkning mål (NA 1,4), Argon (488 nm) och HeNe (543 nm, 633 nm) lasrar och en blå diod (405 nm).
- Placera musen på scenen i mikroskop med täck täcker levern sidan nedåt på målet. Ställ in temperaturen i kammaren till 29 ° C. Justera fokus med levern autofluorescens för att möjliggöra visualisering av sinusvågor.
- Att visualisera kärlen, förbereda en lösning av 500 pg BSA-Alexa 647 utspätt i 100 pl PBS, för varje mus. Injicera denna lösning intravenöst i svansvenen hos anestetiserad mus med användning av en 1 ml spruta med en 30 G nål.
- För att visualisera leverceller kärnor, förbereda en lösning av Hoechst 33342 i PBS. Injicera denna lösning vid 8 mg / kg av mus intraperitonealt med användning av en 1 ml spruta med en 30 G nål.
- Använd normala sekventiella läge, 63x immersionsobjektiv och skannern vid 400 Hz till bild levercellkärnor och levern kärl. Slå på 405 nm blå diod för Hoechst excitation och 633 nm laser för BSA-Alexa 647 excitation. Slå på Argon 488 nm laser och definiera ett stort förvärv band att visualisera levern autofluorescens.
4. Intravital Mikroskopi avbildning av levern för blodflödet hastighetsmätning
- Öppna LAS programvara mikroskop (LAS-AF viewer Version 3.1.0 build 8587). Välj resonansskannerläge när du öppnar mikroskop programvara.
- Klicka på fliken konfiguration för att ställa in hårdvaran. Klicka på laser och välj HeNe 633 laser. Klicka på Inställningar och välj 12 bitars upplösning.
- Klicka på förvärvs menyn. I balken pathway inställningsfönstret, välj mål 63X och ställa in 633 lasereffekten till 100%. Aktivera signalförstärkning och utanför inställda parametrar genom att välja Alexa-633 från menyn PM1-3 rullgardins.
- På fliken förvärva, välj "xyt förvärvläge. Längden format på 1.024 x 1.024. Välj hastighet vid 8000 Hz. Välj hål av tre Airy enheter. Välj en zoomfaktor på 3. Välj inte den dubbelriktade läget.
5. Kvantitativ analys av RBC Velocity Använda xyt Bilder (Metod 1)
- Klicka på "Live" ikonen för att visualisera blodflödet på en live-läge. Välj det område av intresse och för att välja blodkärl för analys. Ställ kärlet av intresse för horisontellt läge genom att justera "X", "Y" och scanningsfältet rotationskoordinater på USB kontrollpanel.
- Stoppa "Live" -läge när fartyget av intresse är inställd. Ändra format inställda bredd till 1,024 x 256 i förvärvsläge inställningsfönstret, linje genomsnitt = 1, ram genomsnitt = 1, välj "staplar" 150. Klicka på "start" för att få bilder.
- För kvantitativ analys av RBC-hastighet med användning av de "xyt" bilder öppnar ImageJ programvara. Välj "File"flik i ImageJ, klicka på "Öppna" och välj sedan filen av intresse.
- Gå till "plugin" -menyn i ImageJ, välj LOCI och Bio-format import alternativ. I det här fönstret väljer du stapeln tittar parametrar som "Hypers". I stapeln för alternativet väljer du alternativet: "xyzct". Obs! Detta öppnar ett fönster med alla serie av förvärv.
- Klicka på "Plugins" på ImageJ menyn och välj MTrackJ alternativ. Klicka på "Lägg till" ikonen på det lilla fönstret och klicka på RBC att spåra. Klicka på samma RBC i varje påföljande ram och klicka på "åtgärd" ikonen för att mäta hastigheten.
Obs: Filen genereras kan sparas i .exl format. - Spåra minst fem RBC per fartyg och analysera minst tre enskilda fartyg av samma storlek.
6. Kvantitativ analys av RBC Velocity Använda xt radbilder (Metod 2)
- Klicka på "Live" att visualisera blod flåg i liveläge. Välj en specifik blodkärlet för analys. Ställ in kärlet av intresse för horisontellt läge. Stoppa "Live" -läge när fartyget av intresse är inställd.
- Välj "xt" scanning och ställa den centrala lumen valda fartyget längs linjen skanningen. Längden format på 1,024 x 512, hastighet = 8,000Hz, line genomsnitt = 32, tid = 512. Klicka på "start" och förvärva xt radbilder.
- Generera ränder för kvantitativ analys av RBC-hastighet genom att öppna .lif filen och öppna xt linjebilden av intresse. I LAS-AF mjukvara, välj "experiment", öppna .lif och välj bilden. Obs: Det öppnar automatiskt en kymograph.
- Mät den tid (t, som erhålls på Y-axeln) som krävs för en partikel i rad (visar mörka reflektion) att resa en viss sträcka (d, erhållas på X-axeln) på denna kymograph. Välj funktionen "dra linjen" och dra en linje horisontellt till rad. Notera avståndet iim och den tid i sekunder som genereras i fliken resultatet vid botten av bilden.
- Beräkna hastighet som V = avstånd / tid med de värden som erhålls från kymograph.
- Kvantifiera minst fem partiklar streck per xt bilden och minst tre enskilda fartyg av samma storlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den specifika arkitektoniska organisationen av sinusoider i levern kan visualiseras baserat på autofluorescent egendom detta organ (Figur 1, panel B och C, grön), intraperitoneal injektion av Hoechst för märkning av hepatocyte kärnor (Figur 1B, blå) och intravenös injektion av fluorescerande BSA under färgningen av levercirkulationssystemet (Figur 1C, röd). Levern består av flera olika fartygs subtyper med olika funktioner och strukturer och storlekar från 40 till 700 pm 2 i diameter (D) (D i små fartyg är mellan 40-80 pm 2 och D i stora fartyg är över 300 pm 2 ). Intravital mikroskopi avbildning av levern möjliggör visualisering med hög upplösning av heterogenitet och komplexitet i levern kärl (Figur 1C).
För att övervaka blodflödet hastighet i enskilda Vessels, är två olika metoder som används för bildinhämtning och dataanalys av lever blodkärl in vivo. I den första metoden, är i realtid avbildning av blodflödet i ett kärl av intresse utförs med hjälp av xyt avsökningsläget (film 1). Kvantitativ analys av hastigheten av en enskild RBC i ett enda kärl utförs med användning av MTrackJ plugin i ImageJ programvara (figur 2A och 2B). Minst fem partiklar per fartyg spåras i olika kärl som sträcker sig från 40 till 80 pm 2 diameter. De resultat som erhållits med denna metod ger konsekventa och reproducerbara värden mellan olika möss och utvärdera RBC hastighet i små lever fartyg på värden mellan 25-35 pm / sek (Figur 2C).
Den andra metoden består i upprepat skanna längs en linje parallell med kärlets vägg, med den linje placeras i mitten av kärllumen.Figur 3 visar en xy ram scan (vänster paneler) med motsvarande xt linjeavsökningen (höger sida). Hastigheten för en enskild RBC ges av förhållandet V = avstånd / tid och beräknas med hjälp av de rätvinkliga projektionerna på X- och Y-axeln av strimman erhållits i xt bilden. I figurerna 3D och 3E, representerar varje datapunkt hastigheten av en enskild RBC från olika små eller stora fartyg som valts ut från olika möss. Som framgår av felstaplar, visar uppgifterna en relativt låg variation mellan RBC hastigheter och visar att blodflödet hastighet är dramatiskt snabbare i stora fartyg än i små fartyg. Dessutom har en betydande variation i hastighetsvärden som erhållits från olika typer av stora kärl observeras medan blodflödet hastighet är relativt lika mellan olika typer av små fartyg. Blodflödesmätningar med detta nyare metod genererar data som är jämförbara med data som erhållits från tidigare beskrivad-metoden med användning MTrackJ (jämför Figur 2C till figur 3D). Bilden i figur 3C representerar ett typiskt exempel på en suboptimal experiment i vilket xy ram avsökning genererar en un-tolkningsbar xt bilden. I det aktuella fallet leder problemet från båda i) snabb internalisering av BSA i endotelcellerna som kantar kärlet av intresse och ii) närvaron av en korsning mellan två fartyg som stör blodflödet i det markerade området för förvärvet. Hastigheten för internalisering av plasma reagens i endotel som bekläder blodkärl är en kritisk parameter för att tänka på när mätning av blodflödeshastighet, som interna kommer att förändra kvaliteten på xt bild som visar de strimmor. Den internatakten beror kritiskt på dosen av färgämne som intravenöst injiceras. I Figur 4 visar vi att 500 pg BSA-Alexa 647 och / eller 500 kDa Dextran-FITC är de optimala doser som Should användas för kvantifiering av blodflödeshastighet. Dessa doser alstra en mycket ljus signal som tillåter identifiering av RBC som mörka partiklar mot en ljus bakgrund och möjliggöra visualisering av blodflöde under minst en timme utan internalisering av den injicerade färgämnet (figur 4, nedre panelen). I motsats härtill 50 ^ g BSA-Alexa 647 och / eller 500 kDa dextran-FITC (ej visad), samtidigt som för visualisering av leverns vaskulära nätverket, är en suboptimal dos för mätning av blodströmningshastighet på grund av den mycket snabba internalisering av färgämnet, som börjar vid 5 min efter injektion (Figur 4, nedre panelen).
Vid tillämpning av denna metod på levern hos infekterade djur, observerade vi en signifikant ökning av blodflödeshastigheten så snart en h efter infektion. Ändring av RBC-hastigheten bibehålles upp till 24 h efter infektion. Den når slutligen normalvärdenvid 72 h efter parasit injektion (figur 5). Sålunda validerar detta experiment användningen av denna metod för att få nya insikter i påverkan av patologiska tillstånd på lever hemodynamiken.
Figur 1: Intravital Mikroskopi av Mouse lever (A) leverkirurgi av musen.. En liten del av en leverlob exponeras efter operationen, är två fuktiga gasväv bitar placeras runt den och en bild läggs på magen för att täcka levern innan musen placeras på scenen av en konfokalmikroskop. (B, C) Bild av ett representativt område i levern hos en icke-infekterad mus som visar levern sinusoiderna och de olika storlekarna på de fartyg som utgör lever orgel. Lever autofluorescens visas i grönt. Musen injiceras med Hoechst 33.342 (blå) för att märka hepatocyte kärnor (B) och injiceras med BSA-Alexa 647 (röd) för att visualisera levern kärl (C). Skala barer, 50 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Kvantitativ analys av RBC hastighet från en xy Frame Skanna med ImageJ programvara (A) representant xy bild av blodcirkulationen i en liten lever fartyg förvärvats av intravital mikroskopi avbildning av muslever med hjälp av snabba xy scanning. Mörka områden motsvarar RBK. Skala bar, 10 | j, m. (B) Kvantifiering av hastigheten för en enda RBC med hjälp av MTrackJ plugin från ImageJ. Lines (röd, gul, vit) representerar bana över tiden av en enskild RBC. (C) RBC hastighet i enskilda smalla (D är ungefär 50 um 2) lever fartyg. Grafen plottar värdet på hastigheten för fem oberoende RBC spåras i leverkärl enskilda som valdes ut från fem olika möss (1 till 5). D representerar diametern av fartyget i im 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Lever blodflödesmätningar från Intravital mikroskopi avbildning av ett blodkärl med hjälp av xt linje Scanning Läge Representativa xy bilder (vänster paneler) lever fartyg märkta med BSA-Alexa 647 och deras motsvarande xt bilder (höger paneler) som erhållits från en. line-scan av de centrala lumen i ett enskilt fartyg. (A, B) Liten (A) och storleverkärl (B). (C) Representativa data från en suboptimal experiment visar skärningspunkten mellan två blodkärl och BSA interna i endotel. (D, E) Diagrammen rita värdet av hastigheten av tre oberoende RBC per fartyg (små i D och stora i E) valda från fem olika möss. D representerar diametern av fartyget i im 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Effekten av dosen av fluorescerande Plasma Dye på dess Interna i endotelet Lining sinusvågoma här bilden spårar internalisering av BSA och Dextran 500 kDa i endotel kantar sinusoiderna, som en funktion av tid och injektionsdos.Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Effekt av L. donovani infektion på lever Hemodynamik. Denna graf plottar värdena för de blodhastigheten erhållas från flera enskilda blodkärl från icke-infekterade möss (NI) och möss som var infekterade med L. donovani och analyserat 1 timme, 24 timmar och 72 timmar efter infektion (pi). Varje punkt representerar medelvärdet av fem RBC hastighetsmätningar framställda i ett enda blodkärl av approximativt 50 ^ m 2. I varje tillstånd (NI, 1 tim pi, 24 tim pi och 72 h pi) minst tre möss analyserades för blodströmningshastighet. Stjärnorna indikerar en signifikant skillnad i blodflödeshastighet erhålles en h och 24 h pi jämfört med NI-möss (P <0,01, ett sätt Anova).
Film 1. Time-lapse Intravital Mikroskopi Imaging i muslever. Film 1 motsvarar figur 3. Musen fick en injektion av BSA-Alexa 647 att visualisera kärlen. Blodflödet i tre små fartyg (d av 50 | j, m 2) visas. Svarta områden motsvarar RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den senaste tidens utveckling av intravital mikroskopi av muslever öppnar nya möjligheter för undersökning av fysiologiska svar på infektion in vivo och i realtid 5,9,10. Organ blodflöde är en kritisk fysiologisk parameter som ofta ändras i många sjukdomar. Men statusen av lever hemodynamik under fysiologiska och infektiösa tillstånd fortfarande ett dåligt utforskade området. I denna studie, IVM-baserade metoder, som tidigare anpassade för studiet av mjälten och tumörvaskulatur, genomfördes för att kvantifiera lever blodflödet hastighet inom ett enda kärl och mäta enskilda RBC hastighet in vivo 11,12. De metoder som används här är beroende av kontrasten mellan en plasma fluorofor intravenöst i musen, såsom fluorescerande BSA, och erytrocyter, som förblir mörk. In vivo mätningar blodflödes har potential att förbättra vår förståelse av sjukdomen processer.
Här, har två metoder användes och jämfördes för att mäta blodflöde i leverkärlen. Den första metoden är tidskrävande och kräsen i tid för dataanalys, eftersom det kräver att användarna manuellt spåra RBC rörelse i ett enskilt fartyg använder MTrackJ plugin i ImageJ programvara. Den andra metoden är enkel och snabb, eftersom den består av en analys av en xt bild av ett blodkärl som genereras från en linje scan förvärv med resonansskannerläge. De två metoderna ger jämförbara data för liknande fartyg. I detta skede är det nästan omöjligt att jämföra våra data med andra, som, så vitt vi vet, blodflödeshastigheten har aldrig kvantifierats i sådana små kärl och i mus sinusvåg kapillärer med en bredd av ungefär 10 | im. IVM-baserade metoder tillåter hög upplösning i xy 500 nm som möjliggör analys av en sinuskurva med en bredd av 10-50 um 13. Däremot endast dopplerbaserade tekniker har en maximal resolmepannor av 70 pm, vilket begränsar mätning av blodflödet till levern artärer och portal vener 3.
En av de viktigaste stegen som är avgörande för ett framgångsrikt genomförande av dessa metoder är en lyckad operation och underhåll av sövda musen i gott fysiologiska tillstånd under hela avbildning session. För att göra detta måste man noggrant kontrollera temperaturen i mikroskop kammaren och injicera bedövningsmedel varje timme. En annan avgörande steg är internalisering av fluorescerande plasma reagens i endotel foder som kan förekomma naturligt efter injektionen. Sådan internalisering kommer att producera tolkningsbara xt bilder och un-kontraste xy bilder. Detta fenomen beror på den dos av den injicerade färgämnet och kan förhindras genom att injicera en hög dos av plasma reagenset (figur 4).
Viktigt framgångsrik intravital mikroskopi avbildning av levern blodflödet kräver the hänsyn till flera viktiga aspekter. Dessa inkluderar komplexiteten i levern kärlsystemet, förekomsten av olika subtyper av blodkärl innehållande små och stora fartyg med olika strukturer och funktioner, olika blod upplagor med snabb och långsam flöde och snabba RBC hastigheter. Den största begränsningen av den metod som bygger på en analys av en xt bild är hastigheten av förvärvet av fartyget och bristen på Z resolution, som bilden förvärvas i 3D (xyt). Närmare bestämt linjeavsökningen andelen standardsystem når en gräns på känslighet när det gäller förvärv av stora blodkärl (diameter över 180 pm 2) som kännetecknas av mycket höga RBC hastigheter, vilket är fallet med artärer. I den stora kärl kan RBC banan vara ur avbildade planet och alla komponenter som är vinkelräta mot den skannade planet kommer att uteslutas från analysen.
Den metod som presenteras here representerar ett idealiskt verktyg för in vivo och realtids kvantifiering av flera blodflödes parametrar under olika sjukdomstillstånd. Undersökningen av lever hemodynamik kommer att kasta nytt ljus över sjukdomsprocesser och parasit patogenes i ett visst organ. Våra ansträngningar för att få en inblick i levern mikrovaskulaturen systemet tillämpas på en experimentell musmodell av Leishmania-infektion öppnar upp möjligheten för korrelationen mellan flera blodflödes parametrar med parasiten multiplikation och sjukdomsutveckling i detta organ, i realtid. Den fortsatta utvecklingen av reagens, verktyg och metoder för bättre karaktärisering av leverns kärlsystemet genom IVM under infektion är av stor betydelse för att studera inverkan av parasiten kolonisering på denna fysiologisk parameter och ömsesidigt, påverkan av blodflödet på leishmania patogenes. Denna strategi kan potentiellt utvidgas till andra infektiösasystem där patogener riktar levern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av INSERM, University of Aix-Marseille och en utmärkelse karriärutveckling från HFSPO erhålls genom CL Forestier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
