Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

В режиме реального времени электрофизиологии: Использование замкнутой протоколы к Probe нейронов динамики и Beyond

Published: June 24, 2015 doi: 10.3791/52320
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Antwerp

Abstract

Экспериментальная неврологии является свидетелем повышенный интерес к разработке и применению новых и зачастую сложных, протоколов замкнутого контура, где раздражитель зависит в режиме реального времени на ответ системы. Последние приложения в диапазоне от реализации систем виртуальной реальности для изучения двигательных реакций и у мышей, 1 и 2 в данио, чтобы управлять изъятий следующих корковой инсульт, используя оптогенетика 3. Ключевым преимуществом методов замкнутым контуром находится в способности зондирующего более высокие пространственные свойства, которые непосредственно не доступны или которые зависят от нескольких переменных, таких как возбудимости нейронов 4 и надежности, в то же время, максимизируя пропускную экспериментальный. В этом вклад и в контексте сотовой электрофизиологии, мы опишем, как применять различные протоколы замкнутого контура к изучению свойств реагирования пирамидальной корковых нейронов, рекorded внутриклеточно с техникой патч зажим в острых срезах мозга от соматосенсорной коры крыс несовершеннолетних. Поскольку ни в продаже или программное обеспечение с открытым исходным кодом не обеспечивает все функции, необходимые для эффективного выполнения экспериментов, описанных здесь, новое программное обеспечение инструментов называется LCG 5 был разработан, модульная структура которого максимально повторного компьютерного кода и облегчает реализацию новых экспериментальных парадигм. Стимулирование сигналов задаются с помощью компактного мета-описание и полные экспериментальные протоколы описаны в файлах конфигурации текстовых. Кроме того, LCG имеет интерфейс командной строки, который подходит для повторения испытаний и автоматизации экспериментальных протоколов.

Introduction

В последние годы сотовой электрофизиологическое эволюционировала от традиционного разомкнутой парадигмы, используемой в напряжение и ток зажим экспериментов современных протоколов с обратной связью. Самый известный метод замкнутого контура, возможно, динамический зажим 6,7, что позволило синтетический инъекции искусственного напряжения закрытого ионных каналов, чтобы определить мембраны нейронов напряжения 8, углубленное изучение последствий недетерминированным мерцание ионные каналы по динамике нервных реагирования 9, а также отдых в пробирке реалистичных в vivo- как синаптического фоновой активности 10.

Другие парадигмы обратной связью, которые были предложены, включают реактивный зажим 11, для изучения в пробирке генерации самоподдерживающейся упорной деятельности, а ответ зажим 4,12, исследовать клеточные механизмы основной возбудимость нейронов.

ontent "> Здесь мы описываем мощный каркас, который позволяет применять различные замкнутым контуром электрофизиологических протоколов в контексте цельноклеточных записей патч зажим, выполненных в острых кусочков мозга. Мы покажем, как записать соматической мембраны напряжение с помощью патч зажим записи в пирамидальных нейронов соматосенсорной коры крыс и несовершеннолетних применить три различных протоколов с обратной связью, используя лвг, командной строки на основе программного инструментария, разработанного в лаборатории теоретической нейробиологии и Neuroengineering.

Вкратце, описанные протоколы, сначала автоматической инъекции серии сигналов токов зажим стимул, имеющих отношение к характеристике большой набор активных и пассивных свойств мембраны. Они были предложены для захвата электрофизиологическое фенотип клетки по своим свойствам реагирования на трафаретной серии стимулирующих сигналов. Известный как E-код ячейки (например, см & #160; 13,14), например коллекция электрических ответов используется несколькими лабораториями объективно классифицировать нейронов на основе их электрических свойств. Это включает в себя анализ стационарного ввода-вывода передачи отношений (кривая Fi), по инновационной методике, которая включает в замкнутом контуре, в режиме реального времени контроль скорости стрельбы с помощью пропорционально-интегрально-дифференциального (ПИД) регулятора , второй отдых реалистической в естественных условиях -подобной фоне синаптической активности в препаратах в пробирке 10 и, третьей искусственного связи в режиме реального времени двух одновременно зарегистрированных пирамидальных нейронов с помощью виртуальной ГАМКергической интернейронов, который моделируется на компьютере.

Кроме того, LCG реализует метод, известный как активный электрод компенсации (AEC) 15, который позволяет реализовать динамические протоколы зажим с помощью одного электрода. Это позволяет компенсировать нежелательные эффекты (rtifacts) записывающего электрода, которые возникают, когда он используется для передачи внутриклеточных стимулов. Метод основан на непараметрического оценки эквивалентных электрических свойств схемы регистрации.

Методы и экспериментальные протоколы, описанные в этой статье, могут быть легко применены в обычных напряжения разомкнутой и текущих экспериментов зажим и может быть распространен и на другие препараты, такие как внеклеточный 4,16 или внутриклеточных записей в естественных условиях 17,18. Осторожны монтаж установки для целых клеток патч зажим электрофизиологии является очень важным шагом для стабильных, высоких записей качества. В дальнейшем мы предполагаем, что такие экспериментальные установки уже доступны для экспериментатора, и сосредоточить наше внимание на описании использование LCG. Читатель указал на 19-22 для получения дополнительных советов по оптимизации и отладки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол, описанный здесь, соответствует рекомендациям и рекомендациям Комитета по этике Департамента биомедицинских наук Университета Антверпена. Этот протокол требует подготовки не чувствующей материала из эксплантированной мозга несовершеннолетних крыс Wistar, полученных утвержденных гуманных методов эвтаназии.

1. Оборудование Подготовка

  1. Установка и настройка системы сбора и стимуляции.
    1. Использование персонального компьютера (ПК), оснащенный сбора данных (DAQ) карты, поддерживаемой Comedi записывать сигналы и передавать аналоговые управляющие напряжения в электрофизиологической усилителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Comedi является модуль Linux и библиотека, которая поддерживает множество DAQ карт от самых известных производителей: посещение http://www.comedi.org для получения дополнительной информации.
    2. В случае патч зажим усилителя управляется компьютером используется, использовать второй компьютер, кроме одного, посвященного усилителяконтроль.
      Примечание: В то время как последний может работать с обычной операционной системы, дополнительный ПК будет работать в режиме реального времени с помощью специальной операционной системы. В этих условиях, то удобно использовать один монитор, мышь и клавиатуру, прикрепленный к дополнительной ПК, при подключении с удаленного настольного приложения к выделенного ПК.
    3. Скачать образ диска в Live CD, содержащего в режиме реального времени операционная система Linux с предустановленной LCG из http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso и записать его на пустой компакт-диск или USB-палки " ,
    4. Просто вставьте компакт-диск в дисковод компьютера, содержащего DAQ карты и запустить его. Кроме того, установить лвг из хранилища онлайн источника на ПК под управлением операционной системы Linux (например, Ubuntu Debian или). Проконсультируйтесь онлайн руководство для подробной информации о процедуре установки. Руководство доступно в Интернете по адресу http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
    5. Загрузка с живой CD: Тхис автоматически загрузить полностью настроенный системы. Чтобы сделать это, поместите LCG Live CD в компьютерной CD-ROM дисковод и загрузите компьютер с компакт-диска; выбрать ядро ​​реального времени (опция по умолчанию), как только появляется меню загрузки и ждать система инициализации.
    6. Калибровка DAQ карты, набрав в командной строке:
      Судо comedi_calibrate
      или
      Судо comedi_soft_calibrate
      в зависимости от того, поддерживает ли плата данных приобретение аппаратного или программного обеспечения калибровки, соответственно (используйте команду Судо comedi_board_info для получения информации о плате).
    7. Установите соответствующий аналого-цифровые и цифро-аналоговые преобразования факторов: это требует, имеющих доступ к инструкции сотовой электрофизиологических усилителя, и, в частности ее спецификаций на его коэффициентов пересчета.
    8. Используйте текстовый редактор, чтобы указать соответствующие численные значения в файле /home/user/.lcg-env, для переменных среды AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Они представляют собой вход (AI) и вывода (АО) выгоды для токовых клещей (CC) и зажима напряжения (VC) режимах, и коэффициенты пересчета между командами напряжения, предусмотренных на компьютере и тока или напряжения, генерируемого усилителем соответственно.
    9. Кроме того, использование скрипта LCG условии (LCG найти преобразование-факторы), чтобы найти коэффициенты преобразования его или ее системе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения, вычисленные по LCG найти-конверсионных факторов догадки, которые в некоторых случаях требуются численно усеченный или закругленные, чтобы отразить точные значения коэффициентов пересчета.
    10. Чтобы использовать лвг найти-преобразования-факторы, начать с подключения '' модель сотового, что часто выбирают с усилителем к соответствующему headstage. Затем откройте терминал на машине Linux, где вы работаете на Live CD и введите следующую команду в командной строке:
      аккредитивг найти-преобразования-факторы -i $ HOME / .lcg-ENV -o $ HOME / .lcg-ENV
      ПРИМЕЧАНИЕ: В обоих случаях (т.е., ручной модификации /home/user/.lcg-env или использования LCG найти преобразование-факторов), закрывать и открывать терминал, чтобы изменения вступили в силу.
    11. Если несколько headstages используются, установить коэффициенты пересчета в тех же значений во всех каналах; если это не представляется возможным, обратитесь к онлайн руководство LCG, чтобы понять, как использовать несколько коэффициентов пересчета в LCG-стимула или как создавать файлы конфигурации, которые лучше подходят потребностям пользователя.

2. Подготовка острой мозга Ломтики из соматосенсорной коры

  1. Приготовление растворов для электрофизиологии.
    1. Подготовка Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF) путем смешивания (в мм) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 25 глюкозы, 2 CaCl 2 и MgCl 2 1. Подготовка 10х растворы для сниженияВремя приготовления в день эксперимента. Подготовка 2 л, один из которых будет использоваться для приготовления срезов, а другой для записи.
    2. Пропитайте ACSF с 95% O 2 и 5% CO 2 в течение по крайней мере за 30 мин до начала процедуры.
    3. Для текущих записей зажим, используйте внутриклеточный раствор (ICS), содержащий (в мм) 115 К-глюконат, 20 KCl, 10 HEPES, 4 АТФ-Mg, Na 2 0,3 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Готовят раствор в лед и фильтруют ее до начала записи, чтобы исключить риск засорения пипетку.
  2. Добыча мозга.
    1. Обезболить животное помещая животное в индукции камеры с 4% Isoflurane и быстро обезглавить его с помощью гильотины или ножницы большие.
    2. Разрежьте кожу вдоль средней линии и сдвиньте его до ушей.
    3. Использование тонкой ножницы сократить череп вдоль средней линии. Держите лезвие как можно ближе к гое поверхность таким образом, чтобы свести к минимуму повреждение основного мозга. Откройте череп с пинцетом, используйте лопаточку, чтобы разорвать зрительный нерв и ствол головного мозга и осторожно опустить мозг в ледяной ACSF.
    4. Отделите мозжечок и два полушария с помощью скальпеля (лезвия 24).
    5. Удалить избыток воды из одного из двух полусфер и приклеить его по наклонной платформе с использованием каплю суперклея. Быстро добавить несколько капель ACSF на мозг и перенести его на vibratome камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке сагиттальных, угол платформы важно, чтобы избежать повреждения дендритов пирамидальных клеток во время процедуры нарезки.
  3. Получение срезов.
    1. Расположите лезвие над мозгом и отбросить первые 2,5 - 3 мм. Регулировка скорости и частоты, чтобы ограничить повреждение поверхности среза и в то же время сводя к минимуму время, необходимое для процедуры квантования.
    2. Установите толщину до 300 μм и начать нарезку. После того, как лезвие пошло мимо мозга, использовать лезвие бритвы или изогнутую иглу, чтобы сократить выше гиппокампе и по краям области коры интереса.
    3. Поместите ломтики в инкубационной камере мульти-а хранится в 32 - 34 ° C.
    4. Уберите нож и повторите пункты 2.3.2 и 2.3.3 до 5 - 8 ломтиков не резать. Лучшие кусочки, как правило, те, где кровеносные сосуды расположены параллельно поверхности.
    5. Инкубируйте ломтики в течение 30 мин после последнего срез помещают в камеру.

3. Патч-зажим Записи из слоя 5 пирамидальных нейронов

  1. Поместите кусочек в записи камеры и поиск для здоровых клеток. Эти клетки, как правило, имеют более низкую контрастность, гладкий внешний вид и не распухли.
  2. Проверить срез под микроскопом с увеличением объектива 40х и поиск ячейки в слое 5, расположен примерно 600 до 1000 мкм от поверхности мозга. После того, как подходящая ячейка найдена, нагрузка треть микропипеткой с ICS и поместите его в headstage.
  3. На персональном компьютере под управлением живой компакт-диск или заранее настроить операционную систему Linux, запустите командную оболочку (например, Баш) и на его строке введите команду LCG нуля. Это гарантирует, что плата сбора данных не является движущей силой усилитель.
  4. Применение 30 - 50 мбар положительным давлением, нажав на поршень общего шприца, соединенных трубки к держателю пипетки и, с помощью микроскопа, разместить пипетки приблизительно 100 мкм выше среза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите пипетку в положении, которое позволяет прямой маршрут к клетке-мишени, предпочтительно с использованием режима захода на посадку в микроманипулятора.
  5. Действуя на контроль усилитель электрофизиологии, регулировать пипетку смещение и выход испытательного импульса (10 мВ) в режиме зажим напряжения.
  6. Снизить давление до 10 - 30 мбар (в зависимости от размера пипетки) путем удаленияПоршень шприца; осторожно подходить к клетке и проверить для формирования лунки, наблюдая изображение на мониторе видеокамеры. Монитор тестовый импульс для увеличения сопротивления на все времена, наблюдая за кривой тока отображается на экране осциллографа, подключенного к усилителю электрофизиологии (в качестве альтернативы вы можете использовать LCG-SEAL-тест команды, чтобы контролировать сопротивление пипетки).
  7. Сбросить давление и, если необходимо, нежный отрицательное давление пипетки, чтобы помочь образованию уплотнений при заметить увеличение сопротивления пипетки и формирование "лунки" на клетку.
  8. В то время как формы уплотнения, постепенно уменьшить держит потенциал -70 мВ.
  9. После gigaohm печать была получена, убедитесь, что холдинг ток от 0 - 30 Па. Применить короткие импульсы отрицательного давления (всасывания), чтобы разорвать мембрану и установить конфигурацию цельноклеточную. Кроме того, вы можете ввести сильные и короткие импульсы напряжения (
  10. Переключитесь на текущем режиме зажим и убедитесь, что мембранный потенциал покоя характерно здоровой клетки. Для корковых пирамидных нейронов использованием раствора калий-глюконат основе, эта величина, как правило, между -65 и -75 мВ.

4. Полуавтоматическая характеристика электрических свойств реагирования нейрона

  1. Создайте каталог для хранения данных пользователя. Для того, чтобы сделать это использовать скрипт, включенный в LCG Live CD, который создает папки на основе даты. Чтобы его использовать, наберите в командной строке
    CD ~ / эксперименты
    LCG создать эксперимент-папка -s PSP, in_vivo_like
    Это создаст папку, где будет сохранен данные для этой ячейки (и 'PSP' и 'in_vivo_like "вложенные папки), и он будет печатать свое название на терминалеОкно; можно также хранить дополнительную информацию, такую ​​как сопротивление пипетки и типа клеток, используя этот сценарий.
  2. Перейдите в каталог только что созданную папку, используя команду
    CD ~ / <имя папки>
    Имя папки отображается один командной LCG-Create-эксперимент-папку и будет иметь метку текущего дня (т.е. год-месяц-день), а в 20140331A01.
  3. Убедитесь, что усилитель установлен на работу в текущем режиме зажим, что кабели подключены, и команда внешнее напряжение усилителя, если он присутствует, включен.
  4. Введите команду LCG-ecodeat командную строку. Это вызывает ряд команд (а именно LCG-ап, LCG-VI, LCG-рампа, LCG-тау и LCG-стадии), используемый для описания основных свойств ответ клетки. LCG-ecode требует пользователю указать два параметра: амплитуды 1 мс длиной импульса тока, используемого для выявления одного всплеска в клетке, а максимальная амплитуда тока баранар вводят в клетку, чтобы найти свою реобазы.
    Используйте следующий синтаксис команды:
    LCG-ecode --pulse амплитуды X --ramp амплитуды Y
    с выбором ценностей X и Y (в Па), которые являются достаточными, чтобы сделать сотовый огонь в ответ на 1 мс длиной импульса и устойчивого инъекции тока, соответственно.
    Примечание: Эти протоколы требуют выполнения численную оценку 'ядра электрода ", чтобы использовать активный электрод компенсация (AEC) 15. Шумно инъекции ток используется для оценки ядро ​​и пользователю будет предложено подтвердить количество образцов, которые составляют ядро. См 15 для подробной информации о значении ядра электрода и как выбрать количество образцов ядра.

5. Введение проводимостью через искусственным синапсов и моделирование in vivo на -подобной фоновой активности

  1. Инъекция моделируемых возбуждающих постсинаптических потенциалов
    1. Перейдите в каталог, где вы сэкономите следующий эксперимент, введя следующую команду в командной строке оболочки:
      CD PSP / 01
    2. Скопируйте файл конфигурации LCG в текущем каталоге и открыть его с помощью текстового редактора (нано в этом примере), введя следующие команды в командной строке оболочки (это файл конфигурации пример включен в исходный код и Live CD) :
      ср ~ / местные / SRC / LCG / конфигурации / epsp.xml
      нано epsp.xml
      Примечание: Это просто текстовый файл с различными объектами связаны друг с другом. Для более подробной информации см раздел результатов представителя.
    3. При необходимости редактировать inputChannel, outputChannel, inputConversionFactor и outputConversionFactor в этом файле, чтобы соответствовать настройкам пользователя.
    4. Вычислить ядро ​​электрода, необходимого для выполнения активной компенсации электрода "метод, используемый для выполнения LCG одного электрода динамический зажим" путем выдачи комспрос
      LCG-ядро
      Это будет запрашивать числа точек в ядре. Опять же, выбрать номер так, что ядро ​​электрод охватывает конец хвоста экспоненциального распада.
    5. Выполните динамический эксперимент зажим с помощью команды
      LCG-экспериментировать -c epsp.xml
    6. Список файлов и визуализации результатов с помощью команды
      Ls -l
      LCG-сюжет-файл -f последний
  2. Инъекция моделируемых тормозных постсинаптических потенциалов
    1. Создайте папку и скопировать файл epsp.xml к нему, введя следующие команды в командной строке оболочки:
      MkDir ../02
      ср epsp.xml ../02/ipsp.xml
      CD ../02
    2. Редактировать файл конфигурации с помощью текстового редактора: изменить синаптическую разворота потенциал и расти, и время затухания константы модель синапса Exp2Synapse в следующем:
      Параметры>
      <E> -80 </ E>
      <TauRise> 0.8e-3 </ tauRise>
      <ТauDecay> 10e-3 </ tauDecay>
      <параметры>
      Закройте текстовый редактор.
    3. Вычислить ядро ​​электрода и проведения эксперимента, как и в 5.1, введя следующие команды в командной строке оболочки:
      LCG-ядро
      LCG-экспериментировать -c ipsp.xml
    4. Список файлов и визуализации результатов, введя следующие команды в командной строке оболочки:
      Ls -l
      LCG-сюжет-файл -f <filename.h5>
  3. Моделирование в естественных условиях -подобной фоновой активности:
    1. Перейдите в каталог, где вы хотите, чтобы сохранить следующий эксперимент, как ранее показано, введя следующие команды в командной строке оболочки:
      CD ../../in_vivo_like/01
    2. Скопируйте файл конфигурации из исходного каталога LCG, введя следующие команды в командной строке оболочки:
      ср ~ / местные / SRC / LCG / конфигурации / in_vivo_like.xml
      нано in_vivo_like.xml
    3. Настройте параметры конфигурации DAQ для настройки пользователя, как описано в 5.1.3 и выйдите из редактора.
    4. Вычислить ядро ​​электрода и проведения эксперимента, как и в 5.1, введя следующие команды в командной строке оболочки:
      LCG-ядро
      LCG-экспериментировать -c -n in_vivo_like.xml 10 -i 3
      В "-n 10 'и' -i 3 'переключатели указывают, что стимуляция следует повторить 10 раз с интервалом в три секунды.
    5. Представьте сырые следы с помощью следующей команды в командной строке оболочки:
      LCG-сюжет-файл -f все

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В предыдущих разделах мы описали, как использовать программное обеспечение панели инструментов лвг охарактеризовать электрофизиологические свойства L5 пирамидальных клеток и воссоздать в естественных условиях -подобных синаптической активности в препарате среза. Использование интерфейса командной строки и полуавтоматической протокола пользу воспроизводимость и эффективность эксперимента, который может иметь большое влияние на выход и качество получаемых данных. Кроме того, поскольку данные сохраняются на постоянной основе, это легко расширить анализ на определенной цели. Рисунок 1 показывает типичный результат эксперимента, в котором основные электрофизиологические свойства ячейки с использованием шесть различных протоколов были охарактеризованы.

Измерение потенциала действия формы и пороговое (рис 1А): краткое и очень сильный импульс тока деполяризации вводят для измерения среднего потенциала действия форму. Порог спайкавычисляется как первого пика третьей производной потенциала действия 24. Измерение вольт-амперной кривой (Фиг.1В): импульсы тока подпороговый вводят в клетку, что позволяет измерять пассивных свойств отклика, таких как входное сопротивление и характеристики субпороговым ионные токи.

Измерение минимальный ток достаточно для вызывая постоянное стрельбу (рис 1в). Вводят рампы тока позволяет характеристике клетки как типа I или типа II генератора 25. Измерение частоты тока (FI) кривой (рис 1D): вводят ток функция мгновенной частоты зажигания и обновляется каждый раз, когда сотовые шипы, с помощью протокола замкнутого цикла, описанного в 5. Используя эту технику, надежный оценка кривой Fi можно получить менее чем за 30 сек. Измерение мембранныхе постоянная времени (рис 1E): короткий импульс тока гиперполяризационные поставляется для измерения пассивных релаксационные свойства мембраны. Этот импульс, то впору двойное экспоненциальное вычислить время мембраны постоянной (44 мс в данном случае).

Коэффициент адаптации и реагирования на деполяризующей тока (рис 1F): две выше пороговые значения тока вводят для измерения коэффициента адаптации (соотношение между первым и последним интервалом между шипами). Приложение для автоматизированной серии протоколов, таких как те, которые описаны позволяет характеризующие каждый записанный ячейку с точки зрения его основных электрофизиологических свойств и составляет основной шаг для каких-либо усилий, направленных на сравнение различных типов нейронов и их роль, как в здоровье и болезни.

Хотя LCG содержит несколько сценариев, которые реализуют специализированные протоколы, большая часть мощности и гибкости инструментов проживаютс в способности описать эксперименты с помощью конфигурационных файлов. В п. 5 описано, как выполнять динамический зажим для введения моделируемого фоновой активности в нейроне. Здесь понятие файлов конфигурации и лиц вводится. Файл конфигурации просто текстовый файл, содержащий имена и взаимосвязи всех основных строительных блоков (так называемые лиц), которые необходимы для выполнения данного эксперимента; по этой причине, проектирование новых парадигм соединительными лиц является относительно простой задачей, как обмен информацией и повторного использования экспериментальных парадигм. В эксперименте, показанном на рисунке 2, используются пять лица:

H5Recorder: записывает подключенных образований в сжатом файле. Формат файла HDF5 был выбран, поскольку он поддерживается большинством языков программирования, таких как Python и MATLAB.

RealNeuron: обеспечивает уровень абстракции в техническом аспекте в режиме реального времени ресь и инъекции. Он содержит информацию о плате сбора данных и выполняет активную компенсацию электрода онлайн. При потенциала действия обнаруживается пересечения порога, в режиме реального Нейрон также выводит шип в виде события: это может быть использовано, например, для контроля скорости стрельбы в ходе эксперимента или для взаимодействия с искусственных синапсов.

Пуассона: генерирует шип поезда следуя экспоненциальному распределению с определенной скоростью. Семя этого процесса могут быть установлены таким образом, что испытания могут быть воспроизведены последовательно.

SynapticConnection: получает шипы от генератора и передает их в соответствующие синапса после заданной задержки.

Exp2Synapse: Модель двойного экспоненциального синапса. Он содержит обратный потенциал и нарастания и спада постоянные времени.

Как упоминалось ранее, каждый объект связан с одним или несколькими другими тО составить эксперимент. В примере моделирования возбуждающего постсинаптического тока, описанной в п. 5.1, как и RealNeuron Exp2Synapse подключены к H5Recorder, чтобы сохранить в файл мембраны напряжение и ток синаптической соответственно. Пуассона лицо подает шипы, генерируемые при частоте 2 Гц до SynapticConnection, который, в свою очередь доставляет события в Exp2Synapse после 1 мс. Наконец, Exp2Synapse объект подключен к RealNeuron. Используя небольшие вариации этого файла конфигурации, как показано на пп. 5.2 и 5.3, можно имитировать тормозящее токов и воссоздать в естественных условиях -подобных деятельность.

На рисунке 2 показано, как с помощью динамической конфигурации зажима, можно изучать синаптической интеграции в управляемом режиме, имитируя ток, индуцированный в нейрон искусственными синапсов 2А (сверху) показаны отдельные постсинаптические потенциалы. (Верх ) вместе с инъекцected токи. Красный (синий) следы обозначения возбуждающие (ингибирующие) события. Следует отметить, что подаваемого тока является функцией напряжения мембраны и изменение проводимости, связанный с активацией виртуального синапсе.

Предоставляя Пуассона шипованные поезда на более высоких частотах в синапсах, в естественных условиях -как фоновая активность может быть смоделировано (рис 2B и 2D). Даже во пики при больших токов вводятся (черный след в нижней части фиг.2В), активный электродный гарантии компенсации, форма шипов не затронуты (фиг.2С), даже если один электрод используется одновременно подача тока и записать напряжение мембраны. Повторяя несколько попыток с тем же проводимости сигналов позволяет расширить работу 23 до более реалистичного рамках, что делает возможным разделить вклады различных synaptiС токи к надежности и точности шип времени.

На фиг.3 показан простой пример гибридной сети, полученной посредством записи одновременно с двух несвязанных пирамидальных клеток и с использованием виртуального ГАМКергических интернейронов, чтобы имитировать форму disynaptic торможения, распространенный механизм, что в коре головного мозга включает в себя активацию клеток Маринотти. 26, 27 3А показана схема экспериментальной установки: пара вещественных, не связанных между собой пирамидальных клеток (черные и красные треугольники) искусственно соединены через моделируемой ГАМКергической интернейронов, моделируется как дырявое интегративно-порогового нейрона. Синапса, который соединяет пресинаптическое пирамидальную клетку к интернейронов дисплеев homosynaptic содействие короткий срок, реализуемых в соответствии с Tsodyks-МАРКРАМ модели 28, в то время как синапс, соединяющий интернейронов и постсинаптической клетки пирамидальной является биэкспоненциальным синапс с повышением и распада Tiмне констант 1 и 10 мс, соответственно.

Веса обоих соединений были скорректированы, чтобы иметь отклонение в постсинаптической мембране потенциала около 2 мВ. 3В и 3С показывают реакцию пресинаптической пирамидальной нейрона к поезду внутриклеточных импульсов доставленных на частоте 90 Гц и соответствующие ВПСП в моделируемой интернейронов:. параметры синаптических соединений были скорректированы, чтобы иметь искусственный нейрон испускает шип после взрыва пресинаптической 3 - 4 пиков при высокой частоте, как сообщалось экспериментально 26,29 Рис 3D показывает эффект ингибирования disynaptic на реальный постсинаптических пирамидальной клетки:. 10 испытаний накладываются, в которой нейрон возбуждается с замороженным естественных -подобных фоновой активности в аналогичной той, которая описана на рисунке 2 Обратите внимание на повышение надежности в ответ на три ингибирующих IPSPs,отражение в меньшей шип дрожания после активации ингибирующего клетки, как показано ниже красной тире следов напряжения.

Фигура 1
Рисунок 1. Электрофизиологические характеристика исправленную L5 пирамидальной нейронов выходного фигурой электронной кода протокола для типичного пирамидальной клетке. количественными выполняются автоматически и не дальнейшее редактирование не требуется. () Расчет порога потенциала действия (пунктирная линия -50,5 мВ). Красная линия в среднем потенциал действия форма. (В) Измерение пассивной реакции (верхней) до гиперполяризационные токов (внизу). (С) Ответ на большее деполяризующий тока для измерения тока реобазы (123 Па). (D) частоты обжига в зависимости от введенного тока, измеряют с использованием подход с замкнутым контуром. Каждый серый точка расположена в паре(Ток, подаваемый, обратный интервала межспайкового). Красная кривая является линейной нужным точкам данных и пунктирная линия указывает на реобазы измеряется в панели (С). (Е) Мера времени мембраны постоянной (43,8 мс). (F), определение основных активных свойств клетки показывает, что клетка является регулярное пики нейрона и что является минимальным адаптации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Отдых в vivo- как активность, используя динамический зажим. () Моделирование возбуждающих (красный, п. 5.1) и тормозных (синий, п. 5.2) синапсы, серые следы других реализаций того же эксперимента. (В ) (C) Формы шипов во время эксперимента в (B). (D) растровых участок шипы, генерируемых по 20 испытаний показывает, что нейрон может быть чрезвычайно надежным и точным в ответ на тот же вход, как показано в 23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3а


Рисунок 3. Моделирование disynaptic торможения с помощью имитации тормозного интернейронов () Схема установки записи:. Черные и красные пирамиды представляют собой пару реальных пирамидальных клеток, записанных одновременно. Черный и красный указывают пресинаптического и постсинаптического нейрона, соответственно. Синий круг представляет собой виртуальную ГАМКергических интернейронов, связался черной пирамидальной клетки, что в свою очередь препятствует красный пирамидальную клетку. (Б) Реакция реальном пресинаптической пирамидальной нейрона серии импульсов доставленных на частоте 90 Гц, указывает оранжевые штрихи над следа напряжения. Черные черточки ниже следа напряжения указывают на раз потенциалы действия были излучаемый пресинаптической клетки. (С) Ответ моделируемой интернейронов в поезде шипов, испускаемых пресинаптической клетки. (D)Наложение 10 следов напряжения, записанных от реального постсинаптической пирамидальной клетке в ответ на активацию моделируемой интернейронов. Постсинаптических клеток стимулировали замороженных в естественных условиях -подобной фоновой активности, чтобы получить надежные динамику напряжения. Красные черточки ниже следов напряжения указать время, в которое, во время последовательных испытаний, постсинаптические нейроны, испускаемые потенциал действия. Обратите внимание на повышенную точность после активации интернейронов, с указанием более низкой шип дрожания через испытаний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом тексте полный протокол для реализации в реальном времени, с обратной связью одну ячейку электрофизиологические эксперименты было описано, используя технику патч зажим и недавно разработанной программного обеспечения под названием инструментов LCG. Для оптимизации качества записи важно, что настройки записи должным образом заземлен, экранированные и вибрации: это обеспечивает стабильного и прочного доступ целого на ячейку, которая, наряду с возможностью автоматизации целые разделы протоколов стимуляции , позволяет максимизации пропускной способности эксперимента.

Два случая, в котором LCG могут быть применены были представлены, а именно характеристика клетки по своим свойствам электрофизиологических (рисунок 1), в том числе быстрого вычисления активной ввода-вывода отношений нейронов, и воссоздание в естественных условиях -как Активность в срезе мозга (рисунок 2). Sucч приложения показал, как построить различные протоколы и обратил внимание на некоторые из самых характерных особенностей LCG: его интерфейс командной строки делает их подходящими для сценариев, что позволяет автоматическое применение ряда протоколов. Кроме того, как это было сделано на фиг.1, значения, извлеченные из одного протокола могут быть использованы для параметров индивидуальные последующих протоколов.

Можно контролировать в реальном времени более высокие характеристики приказом ответ клетки под анализа (например, его мгновенная скорость стрельбы, как показано на рисунке 1D) и изменить соответствующим образом стимуляции, например с помощью ПИД-регулятора, чтобы вычислить ток требуется для поддержания постоянного или изменяющегося во времени скорострельность.

Реализация проводимости и динамической зажим протоколов с LCG проста и требует только писать текстовый конфигурационный файл, процедура может быть автоматизирован с помощью использования среали скрипты. LCG включает в себя более 30 предприятий, которые могут быть соединены, чтобы разработать новые экспериментальные протоколы. Мы описали, как использовать лвг с помощью интерфейса командной строки, однако графический эксперимент запуска был разработан, чтобы облегчить начиная эксперименты и изменения параметров, позволяя без опытных пользователей объединить LCG команды, чтобы создать свои собственные графические интерфейсы.

Два существующих наборов инструментов предлагают аналогичные функциональные LCG: RELACS и RTXI. Первое и платформа для выполнения электрофизиологических экспериментов и для анализа и аннотирования записанные данные. Основное различие между LCG и существующих решений является его пользовательский интерфейс на основе командной строки. Преимущества этого подхода несколько: во-первых, интерфейс командной строки позволяет автоматизировать стандартные и повторяющиеся задачи с помощью, возможно, сложных сценариев и, во-вторых, это позволяет внедрять экспериментальные испытания в более сложных рабочих процессов, реализуемыхскриптовый язык высокого уровня, таких как Matlab или Python.

В целом, модульная природа LCG позволяет расширить число доступных экспериментальных протоколов двумя способами: первый и самый простой вариант, написав специальные конфигурационные файлы, использующие существующие объекты для выполнения протоколов новые. Второй состоит в реализации - с использованием C ++ - новые элементарные объекты, которые могут быть использованы для дальнейшего расширения возможностей и особенностей LCG. Приведенные примеры в этом протоколе озабоченность изучение отдельных клеток в срезах мозга. Тем не менее, подобные протоколы могут быть также успешно использованы в препаратах в естественных условиях, чтобы записывать как внутриклеточные и внеклеточные сигналы, а в бывших естественных препаратов, таких как нейрональных культур, записывать, например, внеклеточных потенциалов через несколько матриц электродов, стимулируя с замкнутой цикл 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue slicer Leica VT-1000S
Pipette puller Sutter P-97
Pipettes WPI 1B150F-4 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament
Vibration isolation table TMC 20 Series
Microscope Leica DMLFS 40X Immersion Objective
Manipulators Scientifica PatchStar
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B Computer controlled
Data acquisition card National Instruments PCI-6229 Supported by Comedi Linux Drivers
Desktop computer Dell Optiplex 7010 Tower OS: real-time Linux
Oscilloscopes Tektronix TDS-1002
Perfusion Pump Gibson MINIPULS3 Used with R4 Pump head (F117606)
Temperature controller Multichannel Systems TC02 PH01 Perfusion Cannula
Manometer Testo 510 Optional
Incubator Memmert WB14
NaCl Sigma 71376 ACSF
KCl Sigma P9541 ACSF, ICS
NaH2PO4 Sigma S3139 ACSF
NaHCO3 Sigma S6014 ACSF
CaCl2 Sigma C1016 ACSF
MgCl2 Sigma M8266 ACSF
Glucose Sigma G7528 ACSF
K-Gluconate Sigma G4500 ICS
HEPES Sigma H3375 ICS
Mg-ATP Sigma A9187 ICS
Na2-GTP Sigma 51120 ICS
Na2-Phosphocreatine Sigma P7936 ICS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
  2. Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
  3. Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
  4. Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
  5. Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
  6. Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
  7. Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  8. Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
  9. White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
  10. Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  11. Fellous, J. -M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
  12. Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
  13. Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  14. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
  15. Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
  16. Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
  17. Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
  18. Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , (1995).
  20. Molleman, A. Patch Clamping. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).
  21. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  22. Gold, R. The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
  23. Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
  24. Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
  25. Koch, C., Segev, I. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).
  26. Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
  27. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
  28. Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
  29. Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).

Tags

Неврология выпуск 100 электрофизиологии сотовые нейробиологии динамические зажим активный электрод Компенсация интерфейс командной строки в режиме реального времени вычислений замкнутая сценарий электрофизиологии.
В режиме реального времени электрофизиологии: Использование замкнутой протоколы к Probe нейронов динамики и Beyond
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. … More

Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond. J. Vis. Exp. (100), e52320, doi:10.3791/52320 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter