Abstract
Eksperimentell nevrovitenskap er vitne til en økt interesse for utvikling og anvendelse av ny og ofte komplekse, lukket sløyfe protokoller, hvor stimulus brukes avhenger i sanntid på responsen til systemet. Nye søknader spenner fra gjennomføringen av virtuelle virkelighet systemer for å studere motoriske responser både hos mus 1 og i sebrafisk 2, for å kontrollere anfall følgende kortikale slag hjelp optogenetics tre. En viktig fordel med lukket sløyfeteknikker ligger i evnen til sentret høyere dimensjonale egenskaper som ikke er direkte tilgjengelige, eller som er avhengig av flere variable, slik som neuronal eksitabilitet 4 og påliteligheten, mens den på samme tid maksimerer den eksperimentelle gjennomstrømming. I dette bidraget og i sammenheng med mobilelektrofysiologi, beskriver vi hvordan du kan bruke en rekke av lukket-sløyfe-protokoller til studiet av respons egenskapene til pyramide kortikale nevroner, recorded intracellulært med lappen klemmeteknikken i akutte hjerneskiver fra somatosensoriske cortex av unge rotter. Som ingen kommersielt tilgjengelig eller åpen kildekode gir alle funksjonene som kreves for effektivt å utføre forsøkene beskrevet her, ble en ny programvareverktøykasse kalt LCG 5 utviklet, hvis modulær struktur maksimerer gjenbruk av programkode og tilrettelegger for implementering av nye eksperimentelle paradigmer. Stimulerings kurver er spesifisert med en compact meta-beskrivelse og fulle eksperimentelle protokoller er beskrevet i tekst-baserte konfigurasjonsfiler. I tillegg har LCG et kommandolinjegrensesnitt som er egnet for gjentakelse av forsøk og automatisering av eksperimentelle protokoller.
Introduction
I de siste årene har mobilelektro utviklet seg fra den tradisjonelle åpne sløyfe paradigmet ansatt i spenning og strøm klemme eksperimenter til moderne lukket-sløyfe-protokoller. Den mest kjente closed-loop teknikken er kanskje den dynamiske klemme 6,7, noe som gjorde at den syntetiske injeksjon av kunstige spenningsstyrte ionekanaler å bestemme nevronale membranspenning 8, i inngående studie av effekten av ikke-determinis flimring på ionekanaler på nerve dynamikk 9, samt rekreasjon in vitro av realistisk i vivo- som synaptisk bakgrunn aktivitet 10.
Andre lukket-sløyfe paradigmer som er foreslått inkluderer reaktiv klemme 11, for å studere in vitro generering av selv vedvarende vedvarende aktivitet, og responsen klemme 4,12, for å undersøke de cellulære mekanismene bak nevronale eksitabilitet.
ontent "> Her beskriver vi et kraftig rammeverk som gjør det mulig å bruke en rekke av lukket-sløyfe elektro protokoller i sammenheng med hel-celle patch clamp opptak utført i akutte hjerneskiver. Vi viser hvordan du tar opp somatisk membran spenning ved hjelp av patch clamp opptak i pyramidale nevroner fra somatosensoriske cortex av unge rotter og bruke tre forskjellige lukket sløyfe protokoller ved hjelp av LCG, et kommandolinjebasert programvare verktøykasse utviklet i laboratoriet for teoretisk nevrobiologi og Neuroengineering.Kort fortalt, de beskrevne protokoller er først den automatiserte injeksjon av en rekke nåværende klemme stimulansebølgeformer, relevante for karakterisering av et stort sett med aktive og passive egenskaper membran. Disse har blitt foreslått å fange elektro fenotype av en celle i form av sine responsegenskaper til en stereotyp rekke stimulansebølgeformer. Kjent som e-kode i en celle (f.eks se & #160; 13,14), blir en slik samling av elektriske responser benyttes av flere laboratorier til objektiv klassifisere nerveceller på basis av deres elektriske egenskaper. Dette omfatter analyse av den stasjonære kryssløpsoverføringsforhold (Fi kurve), ved en innovativ teknikk som innebærer lukket sløyfe, sanntids styring av raten av avfyring ved hjelp av en proporsjonal-integral-derivat (PID) regulatoren , andre rekreasjon av realistisk in vivo-lignende bakgrunn synaptisk aktivitet i in vitro forberedelser 10 og, tredje kunstig tilkobling i sanntid av to samtidig registrert pyramidale nevroner ved hjelp av en virtuell GABAergic interneuron, som er simulert ved datamaskinen.
I tillegg implementerer LCG den teknikk som er kjent som aktiv elektrode Compensation (AEC) 15, som gjør det mulig å implementere dynamisk klem protokoller ved hjelp av en enkelt elektrode. Dette gjør at kompenserende uønskede effekter (enrtifacts) av opptakselektrode som oppstår når den brukes for å levere intracellulære stimuli. Metoden er basert på en ikke-parametrisk estimat av de ekvivalente elektriske egenskapene til opptakskretsen.
Teknikker og eksperimentelle protokollen beskrevet i denne artikkelen kan lett brukes i konvensjonell åpen sløyfe spenning og strøm klemme eksperimenter og kan utvides til andre preparater som ekstracellulære 4,16 eller intracellulære opptak in vivo 17,18. Den forsiktige montering av oppsettet for hele cellen patch clamp elektrofysiologi er et svært viktig skritt for stabile, høye kvalitet opptak. I det følgende antar vi at en slik eksperimentelle oppsettet er allerede tilgjengelig for eksperimentator, og fokusere på å beskrive bruken av LCG. Leseren blir pekt på 19-22 for flere tips om optimalisering og feilsøking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er beskrevet her er i samsvar med anbefalinger og retningslinjer for etikkomiteen ved Institutt for biomedisin ved Universitetet i Antwerpen. Denne protokollen krever fremstillingen av ikke-sansende materiale fra det eksplanterte hjernen av juvenile Wistar-rotter, erholdt ved godkjente humane eutanasi teknikker.
1. Utstyr Forberedelser
- Installere og konfigurere datainnsamling og stimulering system.
- Bruk en personlig datamaskin (PC) er utstyrt med en datainnsamling (DAQ) kort støttes av Comedi å ta opp signaler og sende analoge styrespenninger til elektrofysiologisk forsterker.
MERK: Comedi er en Linux-modul og bibliotek som støtter en rekke DAQ kort fra de mest vanlige produsenter: besøke http://www.comedi.org for mer informasjon. - I tilfelle en datastyrt patch clamp forsterker er i bruk, kan benytte en annen PC foruten den ene dedikert til forsterkerenkontroll.
MERK: Mens den sistnevnte kan kjøre et konvensjonelt operasjonssystem, vil den ekstra PC operere i sanntid ved hjelp av et spesielt operativsystem. Under disse forholdene, er det praktisk å bruke en enkelt skjerm, mus og tastatur koblet til den ekstra PC, mens du kobler av en remote desktop søknad til egen PC. - Last ned ISO image av Live CD som inneholder en real-time Linux operativsystem med LCG preinstallert fra http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso og brenne den på en tom CD eller USB-pinne " .
- Bare å sette inn CDen i stasjonen på PCen inneholder DAQ kortet og starte den. Alternativt installere LCG fra sin online kilde depotet på en PC som kjører operativsystemet Linux (f.eks Debian eller Ubuntu). Konsultere online anvisningen for informasjon om installasjonsprosedyren. Manualen er tilgjengelig online på http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
- Boot fra live CD: this vil automatisk laste en ferdig konfigurert system. For å gjøre dette, plasserer LCG Live-CDen i datamaskinens CD-ROM-stasjonen og start datamaskinen fra CD; velg sanntid kernel (standardvalg) så snart som oppstartsmenyen vises, og vente på at systemet skal initial.
- Kalibrere DAQ-kortet ved å skrive ved ledeteksten:
sudo comedi_calibrate
eller
sudo comedi_soft_calibrate
avhengig av om datainnsamlingsKortet støtter maskinvare eller programvarekalibrering, henholdsvis (bruk kommandoen sudo comedi_board_info å innhente informasjon på bordet). - Velg egnet analog-til-digital og digital-til-analog omregningsfaktorer: dette krever å ha tilgang til manualen for mobiltelefonelektro forsterker, og spesielt til sine spesifikasjoner på sine omregningsfaktorer.
- Bruk et tekstredigeringsprogram for å spesifisere de aktuelle tallverdier i filen /home/user/.lcg-env, for de miljøvariabler AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
MERK: Disse representerer inngang (AI) og utgang (AO) gevinster for strømtang (CC) og spenning klemme (VC) moduser, og omregningsfaktorer mellom spennings kommandoer gitt av datamaskinen og den nåværende eller spenninger generert av forsterkeren hhv. - Alternativt kan du bruke LCG skriptet (LCG-finn-konverterings-faktorer), for å finne omregningsfaktorer for hans eller hennes system.
MERK: Verdiene som beregnes ved lcg-finne-konverteringsfaktorer er gjetninger, som i noen tilfeller er nødvendig å være numerisk avkortet eller avrundet for å reflektere de eksakte verdiene av omregningsfaktorer. - For å bruke lcg-finne-konverteringsfaktorer, start ved å koble "modell celle" som ofte er kjøpt med forsterkeren til tilsvarende heads. Deretter åpner du en terminal på Linux maskinen der du kjører Live CD, og skriv inn følgende kommando ved shell teksten:
lcg-finne-konverteringsfaktorer -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env
MERK: I begge tilfeller (dvs. manuell endring av /home/user/.lcg-env eller bruk av LKT-finn-konverterings-faktorer), tett og åpne terminal for at endringene skal tre i kraft. - Hvis flere headstages brukes, satt omregningsfaktorene til de samme verdiene i alle kanaler; hvis det ikke er mulig, ta kontakt med LCG online manualen for å forstå hvordan de skal bruke flere omregningsfaktorer i lcg-stimulus eller hvordan å produsere konfigurasjonsfiler som bedre passer brukerens behov.
- Bruk en personlig datamaskin (PC) er utstyrt med en datainnsamling (DAQ) kort støttes av Comedi å ta opp signaler og sende analoge styrespenninger til elektrofysiologisk forsterker.
2. Utarbeidelse av akutt hjerneskiver fra Somatosensoriske Cortex
- Fremstilling av løsninger for elektrofysiologi.
- Forbered Artificial cerebrospinalvæske (ACSF) ved å blande (i mm) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2PO 4, NaHCO3 26, glukose 25, 2 CaCl2, 1 og MgCl2. Forbered 10x lager løsninger for å redusereforberedelse tid på dagen for eksperimentet. Forbered 2 L, som vil man bli anvendt til fremstilling av skivene og den andre for opptaket.
- Mett ACSF med 95% O 2 og 5% CO2 i minst 30 min før begynnelsen av prosedyren.
- For nåværende klemme innspillinger, bruker en intracellulær løsning (ICS) inneholder (i mm) 115 K-gluconate, 20 KCl, 10 HEPES, fire ATP-Mg, 0,3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Forbered løsningen i is og filtrere det før begynnelsen av opptakene for å eliminere risikoen for tilstopping pipetten.
- Brain utvinning.
- Bedøve dyret plassere dyret i en induksjon kammer med 4% isofluran og raskt halshogge den ved hjelp av en giljotin eller store saks.
- Skjær huden langs midtlinjen, og skyv den til ørene.
- Ved hjelp av en fin saks kutte skallen langs midtlinjen. Hold bladet så nært som mulig til the overflate for derved å minimalisere skade på den underliggende hjernen. Åpne skallen med en pinsett, bruk en slikkepott til å kutte synsnerven og hjernestammen og forsiktig slippe hjernen i iskaldt ACSF.
- Separer lillehjernen og de to halvkuler med en skalpell (blad 24).
- Fjern overflødig vann fra en av de to halvkuler og lim den på en tilbøyelig plattform å bruke en dråpe superlim. Raskt legge noen dråper ACSF over hjernen og overføre den til vibratome kammeret.
MERK: Ved fremstilling av sagittale skiver, er vinkelen på plattformen viktig å unngå å skade dendritter av pyramideceller under skjæreprosedyren.
- Fremstilling av skiver.
- Plasser bladet over hjernen og kast den første 2,5 til 3 mm. Juster hastighet og frekvens for å begrense skade på overflaten av skiven, mens på samme tid minimere den nødvendige tid for kutting prosedyren.
- Still tykkelsen til 300 μm og begynne slicing. Når bladet har gått forbi cortex, bruke et barberblad eller en bøyd nål for å skjære over hippocampus, og på kantene av det kortikale området av interesse.
- Plasser skivene i en multi-brønn inkubasjon kammer holdes på 32-34 ° C.
- Trekk bladet og gjenta punktene 2.3.2 og 2.3.3 til 5-8 skiver er kuttet. De beste stykkene er vanligvis de hvor blodkarene er parallelle med overflaten.
- Inkuber skiver i 30 minutter etter den siste skive er plassert i kammeret.
3. Patch-klemme Opptak fra lag 5 pyramidale nevroner
- Plasser en skive i innspillingen kammer og søk etter friske celler. Disse cellene har vanligvis lavere kontrast, et glatt utseende og er ikke svellet.
- Inspisere skive under mikroskop med forstørrelse 40X objektiv og søke etter celler i laget 5, som ligger omtrent 600 til 1000 um fra overflaten av hjernen. Når en egnet celle er funnet, legger en tredjedel av mikropipette med ICS og plassere den i heads.
- På den personlige datamaskinen som kjører live CD eller pre-konfigurerte Linux operativsystem, lansere et kommandoskall (for eksempel bash) og på sitt teksten skriver kommandoen lcg-null. Dette sikrer at DAQ styret ikke driver forsterkeren.
- Anvende 30 - 50 mbar for positivt trykk ved å trykke på stempelet i en vanlig sprøyte, koblet med slange til pipetten holderen og, ved hjelp av mikroskop, plasserer pipetten omtrent 100 mikrometer over stykket.
MERK: Sett pipetten i en posisjon som gjør at en direkterute til målcellen, helst ved hjelp av tilnærming modus mikromanipluatoren. - Handler på kontrollene elektrofysiologien forsterker, justere pipette offset og utgang en test puls (10 mV) i spenning klemme modus.
- Redusere trykket til 10 - 30 mbar (avhengig av pipetten størrelse) ved å trekkestempelet i sprøyten; forsiktig tilnærming cellen og sjekk for dannelsen av et smilehull ved å observere bildet på videokameraet monitor. Overvåke testpuls for en økning i motstand til enhver tid, ved å se dagens bølgeform som vises på oscilloskop koblet til elektro forsterkeren (alternativt kan du bruke kommandoen lcg-sel-test for å overvåke pipette motstand).
- Frigjøre trykket og eventuelt bruke milde undertrykk til pipetten for å forsegle formasjonen når man merke en økning i motstand pipette og dannelse av et "smilehull" på cellen.
- Mens segl former, gradvis redusere holder potensial til -70 mV.
- Når en gigaohm forseglingen er oppnådd, at holdestrømmen er mellom 0-30 pA. Anvende korte pulser av undertrykk (sug) for å bryte membranen og etablere helcelle-konfigurasjon. Alternativt kan du injiserer sterke og korte pulser av spenning (
- Bytt til strømtang modus og kontrollere at hvilemembranpotensialet er typisk for en sunn celle. For kortikale pyramidale nevroner ved hjelp av en kalium-glukonat-basert løsning, er denne verdien vanligvis mellom -65 og -75 mV.
4. Semi-automatisk Karakterisering av et nevron er elektriske respons Properties
- Lag en katalog for å lagre brukerens data. For å gjøre dette ansette et skript inkludert i LCG live CD som skaper mapper basert på dato. Å bruke den, skriver ved ledeteksten
cd ~ / eksperimenter
lcg-create-eksperiment-mappen -s psp, in_vivo_like
Dette vil opprette en mappe der dataene for at cellen blir lagret (og en "psp 'og' in_vivo_like 'undermapper) og det vil skrive navnet sitt til terminalenvinduet; det er også mulig å lagre tilleggsinformasjon som pipette motstand og celletype med dette skriptet. - Endre katalog til den nyopprettede mappen ved hjelp av kommandoen
cd ~ / <mappe>
Mappenavnet vil vises med kommandoen lcg-create-eksperiment-mappen og vil ha tidsstempelet for den aktuelle dagen (dvs. år-måned-dag), som i 20140331A01. - Sørg for at forsterkeren er satt til å operere i strømtang modus, at kablene er tilkoblet og ekstern spenning kommando av forsterkeren, hvis de finnes, er aktivert.
- Skriv inn kommandoen lcg-ecodeat ledeteksten. Dette krever en rekke kommandoer (nemlig lcg-ap, lcg-vi, lcg-rampe, lcg-tau og LCG-trinn), som brukes for å karakterisere grunnleggende responsegenskaper i cellen. LCG-ecode krever at brukeren angir to parametere: amplituden av 1 ms lang strømpuls som brukes til å utløse en enkelt topp i cellen, og den maksimale amplitude for den aktuelle ramp injisert inn i cellen for å finne sin rheobase.
Bruk følgende kommando syntaks:
lcg-ecode --pulse-amplitude X --ramp-amplitude Y
med et utvalg av verdiene X og Y (i Pa), som er tilstrekkelig til å gjøre cellen brann som reaksjon på en 1 ms lang puls og en vedvarende tilførsel av strøm, henholdsvis.
MERK: Disse protokollene krever utføre numerisk estimat på 'elektrode kjerne "for å bruke den aktive elektroden Compensation (AEC) 15. En bråkete nåværende injeksjon brukes til å anslå kjernen og brukeren blir bedt om å bekrefte antall prøver som utgjør kjernen. Se 15 for detaljert informasjon om betydningen av elektroden kernel og hvordan du velger antall kjerneprøver.
5. Injeksjon av Conductance gjennom Simulerte Synapses og Simulering av In Vivo -lignende Bakgrunn aktivitet
- Injeksjon av simulerte eksitatoriske postsynaptiske potensialer
- Bytt til katalogen der du vil lagre det neste forsøket, ved å skrive inn følgende kommando ved ledeteksten av skallet:
cd psp / 01 - Kopiere en LCG konfigurasjonsfilen til gjeldende katalog og åpne den med en tekst editor (Nano i dette eksempelet) ved å skrive inn følgende kommandoer ved ledeteksten av skallet (dette eksempelet konfigurasjonsfilen er inkludert i kildekoden og live cd) :
cp ~ / local / src / lcg / konfigurasjoner / epsp.xml
nano epsp.xml
MERK: Dette er rett og slett en tekstfil med forskjellige enheter som er koblet til hverandre. For mer informasjon se representative resultater delen. - Om nødvendig redigere inputChannel, outputChannel, den inputConversionFactor og outputConversionFactor i denne filen for å matche brukerens oppsett.
- Beregn elektroden kernel nødvendig for å utføre den aktive elektroden kompensasjon 'metoden som brukes av LCG å utføre én elektrode dynamisk klemme' ved å utstede command
lcg-kernel
Dette vil be for antall poeng i kjernen. Igjen, velge et nummer, slik at elektroden kjernen dekker slutten av eksponentiell halen. - Utfør dynamisk klemme eksperiment ved hjelp av kommandoen
lcg-eksperimentere -c epsp.xml - Liste opp filene og visualisere resultatene ved å bruke kommandoen
ls -l
lcg-plot-fil -f siste
- Bytt til katalogen der du vil lagre det neste forsøket, ved å skrive inn følgende kommando ved ledeteksten av skallet:
- Injeksjon av simulerte hemmende postsynaptiske potensialer
- Lag en mappe og kopiere epsp.xml filen til det ved å skrive inn følgende kommandoer ved ledeteksten av skallet:
mkdir ../02
cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
cd ../02 - Redigere konfigurasjonsfilen ved å bruke en teksteditor: endre den synaptiske reversering potensial og stige og forfallet tid konstantene i modellen synapse Exp2Synapse til følgende:
parametere>
<E> -80 </ E>
<TauRise> 0,8 E-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10e-3 </ tauDecay>
<parametere>
Avslutt tekst editor. - Beregn elektroden kernel og utføre eksperimentet som i 5.1, ved å skrive inn følgende kommandoer ved ledeteksten av skallet:
lcg-kernel
lcg-eksperimentere -c ipsp.xml - Liste opp filene og visualisere resultatene, ved å skrive inn følgende kommandoer ved ledeteksten av skallet:
ls -l
lcg-plot-fil -f <filename.h5>
- Lag en mappe og kopiere epsp.xml filen til det ved å skrive inn følgende kommandoer ved ledeteksten av skallet:
- Simulering av in vivo-lignende bakgrunn aktivitet:
- Bytt til katalogen der du vil lagre følgende eksperiment, som tidligere vist, ved å skrive inn følgende kommandoer ved ledeteksten av skallet:
cd ../../in_vivo_like/01 - Kopier konfigurasjonsfilen fra LCG kilde katalogen, ved å skrive inn følgende kommandoer ved ledeteksten av skallet:
cp ~ / local / src / lcg / konfigurasjoner / in_vivo_like.xml
nano in_vivo_like.xml - Juster DAQ konfigurasjonsparametere for brukerens oppsett, som beskrevet i 5.1.3 og avslutter redaktøren.
- Beregn elektroden kernel og utføre eksperimentet som i 5.1, ved å skrive inn følgende kommandoer ved ledeteksten av skallet:
lcg-kernel
lcg-eksperimentere -c in_vivo_like.xml -n 10 -i 3
De '-N 10' og '-i 3' brytere viser at stimuleringen bør gjentas 10 ganger med mellomrom på tre sekunder. - Visual rå spor ved hjelp av følgende kommando ved ledeteksten av skallet:
lcg-plot-fil -f alle
- Bytt til katalogen der du vil lagre følgende eksperiment, som tidligere vist, ved å skrive inn følgende kommandoer ved ledeteksten av skallet:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I de foregående avsnittene har vi beskrevet hvordan du bruker programvaren verktøykasse LCG å karakterisere de elektrofysiologiske egenskapene L5 pyramidale celler og å gjenskape in vivo -lignende synaptisk aktivitet i en skive forberedelse. Bruken av en kommandolinje-grensesnitt og semi-automatisert protokoll favoriserer reproduserbarheten og effektiviteten av forsøket, som kan ha en stor innvirkning på produksjonen og kvaliteten av data som produseres. I tillegg, siden dataene er lagret på en konsistent måte, er det lett å utvide analysen til et bestemt mål. Figur 1 viser et typisk resultat av et eksperiment hvor grunnleggende elektrofysiologiske egenskaper av en celle ved hjelp av seks forskjellige protokoller er blitt karakterisert.
Måling av aksjonspotensialet form og terskel (figur 1A): en kort og sterk puls av depolariserende strøm blir injisert for å måle den gjennomsnittlige virkningspotensialet form. Piggen terskelen erberegnet som den første toppen av den tredje deriverte av virkningspotensialet 24. Måling av spenning-strømkurven (figur 1B): sub-terskel strømpulser som blir injisert inn i cellen, slik at målingen av passive responsegenskaper som inngangsmotstand og karakterisering av sub-terskel ioniske strømmer.
Måling av den minimale strøm er tilstrekkelig for å fremskaffe vedvarende avfyring (figur 1C). Den injiserte rampe av strøm gjør det mulig for karakterisering av cellen som en type I eller type II 25 oscillator. Måling av den frekvensstrøm (Fi) kurve (figur 1D): den injiserte strøm er en funksjon av den øyeblikkelige avfyringsfrekvens og blir oppdatert hver gang cellen pigger, ved hjelp av den lukkede sløyfe-protokoll beskrevet i 5. Ved hjelp av denne teknikken, kan en pålitelig estimering av fi kurve oppnås på mindre enn 30 sek. Måling av membrane tidskonstant (figur 1E): en kort Hyperpolarizing strømpuls blir levert for å måle passive relaksasjonsegenskaper av membranen. Denne puls blir da passe til en dobbelt eksponentiell å beregne membranen tidskonstant (44 ms i dette tilfellet).
Tilpasning koeffisient og respons til depolariserende strøm (figur 1F): to supra-terskelverdier for strøm blir injisert for å måle tilpasning koeffisient (forholdet mellom de første og siste inter-spike intervaller). Den automatiserte anvendelse av en serie av protokoller som de som er beskrevet gjør det mulig å karakterisere hver celle registreres i form av dens sentrale elektrofysiologiske egenskaper og utgjør den grunnleggende trinn for alle forsøk med sikte på å sammenligne forskjellige typer nevroner og deres rolle både i helse og sykdom.
Selv LCG inneholder flere skript som implementerer spesialiserte protokoller, mesteparten av kraften og fleksibiliteten til verktøykassen bors i evnen til å beskrive eksperimenter ved hjelp av konfigurasjonsfiler. I Sec. 5 er det beskrevet hvordan du utfører dynamisk klemme å injisere simulert bakgrunn aktivitet i nervecellen. Her begrepet konfigurasjonsfiler og enheter er innført. En konfigurasjonsfil er rett og slett en tekstfil som inneholder navnene og forbindelsene av alle de grunnleggende byggesteinene (kalt enheter) som er nødvendige for å utføre en gitt eksperiment; Av denne grunn, å utforme nye paradigmer av forbindelsesenheter er en forholdsvis enkel oppgave, som er deler og gjenbruk av eksperimentelle paradigmer. I forsøket vist i figur 2, er fem enheter brukes:
H5Recorder: registrerer tilkoblede enheter til en komprimert fil. Den HDF5 filformat er valgt siden det støttes av de fleste programmeringsspråk som Python og Matlab.
RealNeuron: gir et abstraksjonslag til det tekniske aspektet av sanntids resnor og injeksjon. Den inneholder informasjon om datainnsamling styret og utfører den aktive elektroden kompensasjon online. Når et aksjonspotensial blir detektert ved kryssing av terskelen, fast Neuron utmater også en topp i form av en hendelse: dette kan brukes for eksempel for å overvåke avfyringshastighet i løpet av forsøket, eller for å kommunisere med kunstige synapser.
Poisson: genererer spike togene etter en eksponensiell fordeling med en bestemt hastighet. Frø av denne prosessen kan fikses slik at forsøk kan reproduseres konsekvent.
SynapticConnection: mottar piggene fra generatoren, og sender dem til den riktige synapse etter en gitt forsinkelse.
Exp2Synapse: modell av en dobbel eksponentiell synapse. Den inneholder reversering potensial og vekst og forfall tidskonstanter.
Som nevnt tidligere, er hver enhet forbundet med en eller flere andre to komponere et eksperiment. I det eksempel på simulering av en eksitatorisk postsynaptisk strøm er beskrevet i kap. 5,1, både RealNeuron og Exp2Synapse er koblet til H5Recorder, for å spare til fil membranspenning og synaptiske strøm, henholdsvis. Poisson-enhet leverer pigger som genereres med en frekvens på 2 Hz til SynapticConnection, som i sin tur leverer hendelser til Exp2Synapse etter 1 ms. Endelig er Exp2Synapse enhet som er koblet til RealNeuron. Ved hjelp av små variasjoner av denne konfigurasjonsfilen, som vist i Sek. 5.2 og 5.3, kan man simulere hemmende strømninger og gjenskape in vivo-lignende aktivitet.
I figur 2 er det vist hvorledes, ved hjelp av en dynamisk klemme konfigurasjon, kan man studere synaptisk integrering på en kontrollert måte ved å simulere strømmen som induseres i et neuron med kunstige synapser. Figur 2A (øverst) viser individuelle post-synaptiske potensialer (topp ) sammen med injected strøm. Rød (blå) spor betegne eksitatoriske (hemmende) hendelser. Legg merke til at den injiserte strøm er en funksjon av membranspenningen og av forandringen i konduktans knyttet til aktivering av den virtuelle synapse.
Ved å levere Poisson spike togene ved høyere frekvenser til de synapser, kan in vivo-lignende bakgrunn aktivitet simuleres (figur 2B og 2D). Selv under inndriving når store strømmer blir injisert (sort spor i bunnen av figur 2B), den aktive elektroden kompensasjon garanterer at formen av toppene ikke er påvirket (figur 2C), selv om en eneste elektrode brukes for samtidig å injisere strøm og posten membranen spenning. Repetisjon av flere forsøk med de samme konduktans bølgeformer tillater å utvide arbeidet til 23 til en mer realistisk ramme, noe som gjør det mulig å separere bidragene fra forskjellige synaptic strømmer til pålitelighet og presisjon av spike timing.
Figur 3 viser et enkelt eksempel på en hybridnett, fremstilt ved opptak samtidig fra to ukoblet pyramidale celler og ved hjelp av en virtuell GABAergic interneuron for å simulere en form for disynaptic inhibering, en utbredt mekanisme som i hjernebarken involverer aktivering av Martinotti celler. 26, 27 Figur 3A viser en skjematisk av det eksperimentelle oppsettet: et par virkelige, usammenhengende pyramidale celler (svarte og røde trekanter) er kunstig koblet gjennom en simulert GABAergic interneuron, modellert som en lekk integrere-and-brann neuron. Synapsen som kobler den presynaptiske pyramide cellen til de Interneuron skjermer homosynaptic kortsiktig tilrettelegging gjennomført i henhold til Tsodyks-Markram modell 28, mens synapse kobler interneuron og postsynaptiske pyramidecelle er et bieksponentielt synapse med stige og forfall timeg konstanter 1 og 10 ms, respektivt.
Vektene av begge forbindelser ble justert til å ha en avbøyning i den postsynaptiske membran potensial på omtrent 2 mV. 3B og 3C viser responsen av den presynaptiske nevron pyramide til et tog av intracellulære pulser som leveres ved 90 Hz, og de tilsvarende EPSP i simulert interneuron:. parametrene av synaptisk forbindelse ble justert for å få den kunstige nervecellen avgir en spiss etter en presynaptisk utbrudd av 3-4 toppene ved høy frekvens, som rapportert eksperimentelt 26,29 Figur 3D viser effekten av disynaptic inhibering på den virkelige postsynaptiske pyramidal celle:. 10 forsøkene er overlagret, hvor neuronet er stimulert med frossen in vivo -lignende bakgrunn aktivitet tilsvarende den som er beskrevet i figur 2. Legg merke til at økningen i pålitelighet som følge av de tre inhibitoriske IPSPs,speiles i den mindre pigg jitter etter aktiveringen av den hemmende cellen, som indikert av de røde streker under spennings spor.
Figur 1. Elektro karakterisering av en oppdatert L5 Pyramideformet nevron Utgang figur av e-kode protokoll for en typisk pyramidecelle.; quantifications utføres automatisk og ingen ytterligere redigering er nødvendig. (A) Beregning av aksjonspotensial terskel (stiplet linje -50,5 mV). Rød linje er den gjennomsnittlige virkningspotensialet form. (B) Måling av passiv respons (top) til hyperpolariserer strømmer (nederst). (C) som reaksjon på en økning depolariserende strøm for å måle rheobase strøm (123 pa). (D) avfyringsfrekvens som funksjon av den injiserte strømmen, målt ved anvendelse av en lukket sløyfe tilnærming. Hver grå punkt ligger på par(Strøm som injiseres, inverse av interspike intervall). Den røde kurven er lineær tilpasning til datapunktene og den stiplede linje angir rheobase målt i panel (C). (E) Mål av membranen tidskonstant (43,8 ms). (F) Identifisering av basiske aktive egenskaper av celle avslører at cellen er en vanlig spiking nevroner og at det er minimalt med tilpasning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Recreation av i vivo- lignende aktivitet ved hjelp av dynamisk klemme. (A) Simulering av eksitatoriske (rød, Sec. 5.1) og hemmende (blå, Sec. 5.2) synapser, grå spor er andre erkjennelser av samme eksperiment. (B ) (C) former av toppene i løpet av eksperimentet i (B). (D) Rasterplott av piggene som genereres over 20 forsøk viser at nervecellen kan være svært pålitelig og presis respons på samme inngang som i 23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Simulering av disynaptic hemming via en simulert hemmende interneuron (A) Skjematisk av opptaket oppsettet. De svarte og røde pyramidene representerer et par ekte pyramidale celler innspilt samtidig. Svart og rødt indikerer presynaptisk og postsynaptiske nevron, henholdsvis. Den blå sirkel representerer en virtuell GABAergic interneuron, kontaktet av den sorte pyramidal celle, som i sin tur inhiberer den røde pyramidal celle. (B) Reaksjon av den virkelige presynaptiske nevron pyramide til et tog av pulser som leveres ved en frekvens på 90 Hz, indikert ved de oransje streker over spenningen spor. De sorte streker under spenningen spor indikerer ganger aksjonspotensialer ble sluppet ut av den presynaptiske cellen. (C) Reaksjon av den simulerte interneuron til toget med pigger som utsendes av den presynaptiske cellen. (D)Superposisjon av 10 spennings traser registrert fra den virkelige postsynaptiske pyramidal celle i respons til aktivering av den simulerte interneuron. Postsynaptiske celler ble stimulert med frossen in vivo-lignende bakgrunn aktivitet, for å oppnå pålitelige spennings dynamikk. De røde streker under spennings spor tyder tidene på som, under påfølgende forsøk, de postsynaptiske nevroner slippes et aksjonspotensial. Legg merke til den større presisjon etter aktivering av interneuron, angitt med en nedre pigg jitter tvers forsøk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne teksten en full protokoll for gjennomføring av real-time, ble lukket-sløyfe encellede elektrofysiologiske eksperimenter beskrevet, ved hjelp av patch clamp teknikken og en nylig utviklet programvare verktøykasse kalt LCG. For å optimalisere kvaliteten på opptakene er det avgjørende at innspillingen setup være jordet, skjermet og vibrasjonsfri: Dette sikrer stabil og varig hel-celle tilgang til cellen, som sammen med mulighet for å automatisere hele seksjoner av stimuleringsregimer tillater for maksimering av gjennomstrømningen av forsøket.
To tilfeller der LCG kan brukes har blitt presentert, nemlig karakterisering av en celle i form av sine elektrofysiologiske egenskaper (figur 1), inkludert rask beregning av et nevron aktive kryssløpsforhold, og gjenskaping av in vivo -lignende aktivitet i en hjerne stykke (figur 2). Such programmer viste hvordan å konstruere forskjellige protokoller og fremhevet noen av de mest fremtredende trekk ved LCG: dens kommandolinjegrensesnitt som gjør det egnet for skripting, som muliggjør automatisert anvendelse av en rekke protokoller. I tillegg, som det ble gjort i figur 1, verdier hentet fra en protokoll kan benyttes for å skreddersy parametere av etterfølgende protokoller.
Det er mulig å overvåke i sanntid høyere ordens trekk ved responsen av cellen som skal analyseres (f.eks dens øyeblikkelige skuddtakt, slik det er vist i figur 1D) og modifisere stimulering tilsvarende, for eksempel ved hjelp av en PID-regulator for å beregne den aktuelle som kreves for å opprettholde en konstant eller tidsvarierende skuddtakt.
Gjennomføringen av ledningsevne og dynamisk spenn protokoller med LCG er enkel og krever bare skrive en tekst konfigurasjonsfil, en prosedyre som kan automatiseres ved bruk av siverk skript. LCG omfatter over 30 enheter som kan kobles sammen for å tenke ut nye eksperimentelle protokoller. Beskrev vi hvordan du bruker LCG hjelp av en kommandolinje-grensesnitt, men en grafisk eksperiment launcher har blitt designet for å forenkle starter eksperimenter og endre parametrene ved å la ikke-erfarne brukere kombinere LCG kommandoer for å lage sine egne grafiske grensesnitt.
To eksisterende verktøykasser tilby funksjonalitet som ligner på LCG: RELACS og RTXI. Førstnevnte er både en plattform for å utføre elektrofysiologiske eksperimenter og for å analysere og kommentere de registrerte data. Den største forskjellen mellom LCG og eksisterende løsninger er brukergrensesnittet basert på et kommandolinje. Fordelene med denne tilnærmingen er flere: Først av alt, gjør et kommandolinjegrensesnitt automat standardiserte og repeterende oppgaver ved hjelp av muligens komplekse scripts og for det andre, det kan innebygging eksperimentelle forsøk i mer kompliserte arbeidsflyter implementertpå høyt nivå skriptspråk, for eksempel Matlab eller Python.
I sammendraget, den modulære natur LCG kan utvide antall tilgjengelige eksperimentelle protokoller på to måter: den første og enkleste man er ved å skrive ad hoc konfigurasjonsfiler som bruker de eksisterende objekter til å utføre nye protokoller. Den andre er ved å implementere - ved hjelp av C ++ - nye elementære objekter som kan brukes til å utvide ytterligere egenskapene og funksjonene til LCG. Eksemplene som presenteres i denne protokollen angår studier av individuelle celler i hjerneskiver. Men tilsvarende protokoller kan også med hell benyttes i in vivo forberedelser, for å spille inn både intracellulære og ekstracellulære signaler, og i ex vivo preparater som nevrale kulturer, for å spille inn, for eksempel, ekstracellulære potensialer gjennom multi-elektrode matriser og stimulerer i lukket- sløyfe fire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. Patch Clamping. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
