Abstract
Experimental Neuroscience is getuige van een toenemende belangstelling voor de ontwikkeling en toepassing van nieuwe en vaak complexe, closed-loop protocollen, waarbij de stimulus toegepast, hangt in real-time de respons van het systeem. Recente toepassingen variëren van de uitvoering van virtual reality-systemen voor het bestuderen van motorische reacties, zowel in muizen 1 en 2 in de zebravis, om de controle van de aanvallen volgende corticale slag met optogenetics 3. Een belangrijk voordeel van gesloten-lus techniek ligt in het vermogen sonderen hogere dimensionale eigenschappen die niet direct toegankelijk of die afhankelijk zijn van meerdere variabelen, zoals neuronale exciteerbaarheid 4 en betrouwbaarheid, terwijl op hetzelfde moment het maximaliseren van de experimentele throughput. In deze bijdrage en in de context van cellulaire elektrofysiologie beschrijven we hoe verschillende closed-loop protocollen voor het bestuderen van de responseigenschappen van de piramidale corticale neuronen, recintracellulair orded met de patch clamp techniek in acute hersenen plakjes van de somatosensorische cortex van jonge ratten. Omdat er geen commercieel beschikbare of open source software biedt alle functies die nodig zijn voor het efficiënt uitvoeren van de hier beschreven experimenten, een nieuwe software toolbox genaamd LCG 5 werd ontwikkeld, waarvan de modulaire structuur maximaliseert hergebruik van computercode en vergemakkelijkt de implementatie van nieuwe experimentele paradigma. Stimulatie golfvormen worden opgegeven met een compacte meta-beschrijving en volledige experimentele protocollen worden beschreven in de op tekst gebaseerde configuratiebestanden. Daarnaast LCG heeft een command-line interface die geschikt is voor de herhaling van proeven en automatisering van experimentele protocollen.
Introduction
De laatste jaren heeft cellulaire electrofysiologie ontwikkeld van de traditionele open-loop paradigma gebruikt in spanning en stroom clamp experimenten moderne closed-loop protocols. De bekendste closed-loop techniek is misschien wel de dynamische klem 6,7, die de synthetische injectie van kunstmatige voltage-gated ion kanalen nodig om de neuronale membraan spanning 8 te bepalen, de grondige studie van de effecten van niet-deterministische flikkeren op ion kanalen op neuronale respons dynamiek 9, evenals de recreatie in vitro van realistische in vivo- als synaptische achtergrond activiteit 10.
Andere closed-loop paradigma's die zijn voorgesteld onder de reactieve klem 11, in vitro bestuderen van de vorming van zichzelf onderhoudende persistente activiteit en de reactie klem 4,12, de cellulaire mechanismen te onderzoeken onderliggende neuronale exciteerbaarheid.
nhoud "> Hier beschrijven we een krachtig raamwerk dat toelaat aanbrengen diverse closed-loop elektrofysiologische protocollen in de context van whole-cell patch clamp uitgevoerd acute hersencoupes. We tonen hoe somatische membraanspanning opnemen door middel van patch clamp in piramidale neuronen van de somatosensorische cortex van jonge ratten en toe te passen drie verschillende closed-loop protocollen met LCG, een command-line-gebaseerde software toolbox ontwikkeld in het laboratorium van Theoretische Neurobiologie en Neuroengineering.Kortom, de beschreven protocollen zijn, eerst de geautomatiseerde injectie van een reeks stroomtang stimulans golfvormen, die relevant zijn voor de karakterisering van een grote set van actieve en passieve membraan eigenschappen. Deze zijn voorgesteld om de elektrofysiologische fenotype van een cel vast te leggen met betrekking tot de responseigenschappen een stereotype reeks stimulus golfvormen. Bekend als de e-code van een cel (zie bijvoorbeeld & #160; 13,14) wordt een dergelijke verzameling van elektrische responsen door verscheidene laboratoria objectief neuronen classificeren op basis van hun elektrische eigenschappen. Dit omvat de analyse van de stationaire input-output overbrengend verband (FI curve), door een innovatieve techniek die de gesloten lus, real-time controle van de snelheid van afvuren gaat via een proportionele-integrale-afgeleide (PID) regelaar anderzijds de recreatie van realistische in vivo-achtige achtergrond synaptische activiteit in in vitro preparaten 10 en ten derde de kunstmatige verbinding in real-time van twee gelijktijdig opgenomen piramidale neuronen via een virtuele GABAerge interneuronen, die wordt gesimuleerd door de computer.
Bovendien, LCG implementeert de techniek die bekend staat als actieve elektrode Compensation (AEC) 15, die het mogelijk maakt de uitvoering dynamische clamp protocollen het gebruik van een enkele elektrode. Dit maakt compensatie ongewenste effecten (artifacts) van de registratie-elektrode die ontstaan bij gebruik voor het leveren van intracellulaire stimuli. De werkwijze is gebaseerd op een niet-parametrische schatting van het equivalente elektrische eigenschappen van het opnamecircuit.
De technieken en experimentele protocollen beschreven in dit document kunnen eenvoudig worden toegepast in conventionele open-loop spanning en stroom clamp experimenten en kan worden uitgebreid tot andere preparaten, zoals 4,16 extracellulaire of intracellulaire recordings in vivo 17,18. De zorgvuldige montage van de setup voor de hele cel patch clamp elektrofysiologie is een zeer belangrijke stap voor stabiele, hoge kwaliteit opnames. In het volgende gaan we ervan uit dat een dergelijke experimentele opstelling is al beschikbaar voor de experimentator, en onze aandacht richten op het gebruik van LCG beschrijven. De lezer wordt gewezen op 19-22 voor meer tips over optimalisatie en debugging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier beschreven protocol voldoet aan de aanbevelingen en richtlijnen van de ethische commissie van de afdeling Biomedische Wetenschappen van de Universiteit Antwerpen. Dit protocol vereist het opstellen van niet-voelende materiaal uit de geëxplanteerde hersenen van jonge Wistar ratten, verkregen door erkende humane euthanasie technieken.
1. apparatuur Voorbereiding
- Installeren en configureren van de data-acquisitie en stimulatie systeem.
- Gebruik een personal computer (PC) uitgerust met een data-acquisitie (DAQ) kaart ondersteund door Comedi om signalen op te nemen en te sturen analoge stuurspanning naar de elektrofysiologische versterker.
OPMERKING: Comedi is een Linux-module en een bibliotheek die een veelheid van DAQ kaarten van de meest voorkomende fabrikanten ondersteunt: bezoek http://www.comedi.org voor meer informatie. - Indien een computergestuurde patch clamp versterker wordt gebruikt, maken gebruik van een tweede PC naast degene gewijd aan de versterkercontrol.
OPMERKING: Hoewel deze een conventioneel besturingssysteem kan lopen zal de extra PC die in real-time door middel van een speciaal besturingssysteem. Onder deze omstandigheden, is het handig om een enkele monitor, muis en toetsenbord verbonden met de extra pc, terwijl het verbinden met een externe desktop applicatie om de specifieke PC. - Download de ISO image van de Live-CD met een real-time Linux besturingssysteem voorgeïnstalleerd LCG van http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso en branden op een lege cd of USB-stick " .
- Steek de cd in het station van de PC met de DAQ kaart en start het. Ook installeert LCG van zijn online bron repository op een pc met het Linux-besturingssysteem (bijvoorbeeld, Debian en Ubuntu). Raadpleeg de online handleiding voor meer informatie over de installatieprocedure. De handleiding is online beschikbaar op http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
- Boot vanaf de live-cd: this wordt automatisch een volledig geconfigureerd systeem te laden. Om dit te doen, plaatst u de LCG Live CD in de computer cd-rom-drive en start de computer vanaf cd; selecteert u de real-time kernel (standaardoptie) zodra het opstartmenu verschijnt en wacht tot het systeem te initialiseren.
- Kalibreer de DAQ kaart door te typen bij de opdrachtprompt:
sudo comedi_calibrate
of
sudo comedi_soft_calibrate
afhankelijk van de vraag of de data-acquisitie board ondersteunt hardware of software kalibratie respectievelijk (gebruik het commando sudo comedi_board_info om informatie te verkrijgen op het bord). - Stel de geschikte analoog-digitaal en digitaal-naar-analoog omzetting factoren: deze moet toegang tot de handleiding van de cellulaire elektrofysiologische versterker, en met name de specificaties betreffende de conversiefactoren.
- Gebruik een tekstverwerker om het juiste numerieke waarden in het bestand /home/user/.lcg-env te geven, voor de omgevingsvariabelen AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
LET OP: Deze vertegenwoordigen de ingang (AI) en uitgang (AO) winst voor de huidige klem (CC) en spanning klem (VC) modes, en de conversie factoren tussen de spanning commando's die door de computer en de huidige of spanningen gegenereerd door de versterker respectievelijk. - U kunt ook de LCG script voorzien (LCG-vind-conversie-factoren), om de conversie factoren van zijn of haar systeem te vinden.
OPMERKING: De waarden berekend door lcg-vind-conversie-factoren zijn gissingen, die in sommige gevallen moeten afgeknot numeriek te zijn of afgerond om de exacte waarden van de coëfficiënten geven. - Om gebruik te maken lcg-vind-conversie-factoren, beginnen met het aansluiten van de 'model cell' die vaak wordt gekocht met de versterker naar de corresponderende headstage. Open vervolgens een terminal op de Linux machine waar u het uitvoeren van de Live CD en voer de volgende opdracht bij de shell prompt:
lcG-vind-conversie-factoren -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env
LET OP: In beide gevallen (dwz handmatige wijziging van /home/user/.lcg-env of het gebruik van LCG-vind-conversie-factoren), sluiten en openen van de terminal voor de wijzigingen door te voeren. - Indien meerdere headstages gebruikt, stelt de omrekeningsfactoren dezelfde waarden in alle kanalen; als dat niet mogelijk is, raadpleeg dan de LCG online handleiding om te begrijpen hoe u meerdere omrekeningsfactoren in LCG-stimulus of hoe te gebruiken om configuratiebestanden die beter past bij de behoeften van de gebruiker te produceren.
- Gebruik een personal computer (PC) uitgerust met een data-acquisitie (DAQ) kaart ondersteund door Comedi om signalen op te nemen en te sturen analoge stuurspanning naar de elektrofysiologische versterker.
2. Voorbereiding van de Acute Brain Slices van de Somatosensorische Cortex
- Bereiding van oplossingen voor elektrofysiologie.
- Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) door mengen (in mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 25 glucose, 2 CaCl2 en 1 MgCl2. Bereid 10x voorraad oplossingen voor het verminderenvoorbereidingstijd op de dag van het experiment. Bereid 2 L, waarvan één wordt gebruikt voor de bereiding van de plakken en de andere voor opname.
- Verzadigen ACSF met 95% O2 en 5% CO2 gedurende ten minste 30 min voor het begin van de procedure.
- Actuele clamp, gebruikt een intracellulaire oplossing (ICS) bevattende (in mM) 115 K-gluconaat, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Bereid de oplossing in ijs en filteren vóór het begin van de opnamen het risico van verstopping van de pipet te elimineren.
- Brain extractie.
- Verdoven het dier plaatsen van het dier in een inductie kamer met 4% isofluraan en snel onthoofden met behulp van een guillotine of grote schaar.
- Snijd de huid over de middellijn en schuif deze naar de oren.
- Met behulp van een fijne schaar knippen de schedel langs de middellijn. Houd het blad zo dicht mogelijk aan The oppervlak om beschadiging van de onderliggende hersenen te minimaliseren. Open de schedel met een pincet, gebruik een spatel om de oogzenuw en de hersenstam verbreken en voorzichtig neerzetten van de hersenen in ijskoude ACSF.
- Scheid het cerebellum en de twee hemisferen met een scalpel (blad 24).
- Verwijder overtollig water uit een van de twee hersenhelften en lijm deze op een hellend platform met behulp van een druppel superlijm. Voeg snel een paar druppels ACSF via hersenen en overbrengen naar de vibratome kamer.
OPMERKING: Bij de voorbereiding sagittale plakken, de hoek van het platform is het belangrijk om te voorkomen dat schade aan de dendrieten van piramidale cellen tijdens het snijden procedure.
- Bereiding van de segmenten.
- Plaats het blad over de hersenen en de eerste 2,5 ontdoen - 3 mm. Stel de snelheid en frequentie om schade aan het oppervlak van de plak te beperken, terwijl tegelijkertijd het minimaliseren van de tijd nodig voor het snijden procedure.
- Stel de dikte 300 μm en beginnen snijden. Als het mes voorbij de cortex is gegaan, gebruikt een scheermesje of een gebogen naald boven de hippocampus en aan de randen van het corticale gebied van belang te snijden.
- Leg de plakjes in een multi-well incubatiekamer bij 32 gehouden - 34 ° C.
- Trek het mes en herhaal de punten 2.3.2 en 2.3.3 tot 5-8 plakjes gesneden. De beste plakjes zijn meestal degenen waarbij de bloedvaten parallel aan het oppervlak zijn.
- Incubeer de schijfjes gedurende 30 minuten na het laatste segment wordt geplaatst in de kamer.
3. Patch-clamp opnamen van Layer 5 Piramidaal Neuronen
- Plaats een schijfje in de opname kamer en zoek naar gezonde cellen. Deze cellen hebben meestal een lager contrast, een glad uiterlijk en zijn niet gezwollen.
- Inspecteer het segment onder de microscoop met een vergroting van 40x lens en zoeken naar cellen in laag 5, op ongeveer 600 tot 1000 urn van het oppervlak van de hersenen. Zodra een geschikte cel wordt gevonden, belasting een derde van de micropipet met ICS en plaats deze in de headstage.
- Op de personal computer met de live CD of de pre-geconfigureerde Linux besturingssysteem, lanceren een command shell (bijvoorbeeld, bash) en op zijn prompt soort het commando LCG-nul. Dit garandeert dat de DAQ kaart niet rijdt de versterker.
- Breng 30 - 50 mbar overdruk door op de zuiger van een injectiespuit gemeenschappelijk verbonden door buismateriaal met de pipet houder en met behulp van de microscoop, plaats de pipet ongeveer 100 micrometer boven het segment.
OPMERKING: Plaats de pipet in een positie die de directe route toelaat de doelwitcel voorkeur met naderingsmodus van de micromanipulator. - Waarnemend op de controles van de elektrofysiologie versterker, passen de pipet offset en de output een test puls (10 mV) in spanning klem mode.
- Verlaag de druk tot 10-30 mbar (afhankelijk pipetgrootte) Door terugtrekken van dezuiger van de injectiespuit; voorzichtig benaderen de cel en controleer voor de vorming van een indeuking door het observeren van het beeld op de video camera. Monitor de test puls voor een verhoging van de weerstand te allen tijde, door te kijken naar de huidige golfvorm weergegeven op de oscilloscoop aangesloten op de elektrofysiologie versterker (als alternatief kunt u de opdracht LCG-seal-test te gebruiken om toezicht te houden de pipet weerstand).
- Laat de druk en eventueel zachtjes negatieve druk op de pipet afdichting vorming helpen bij een toename pipet weerstand en de vorming van een "kuiltje" op de mobiele merken.
- Terwijl de afdichting vormen, geleidelijk af met de potentie -70 mV.
- Zodra een gigaohm afdichting is verkregen, ervoor zorgen dat het bedrijf de huidige tussen 0-30 PA. Breng korte pulsen van negatieve druk (zuiging) om het membraan te breken en de hele-cel configuratie stellen. U kunt injecteren sterk en korte pulsen van spanning (
- Overschakelen naar stroomklem modus en controleer of de rust membraanpotentiaal is een typisch voorbeeld van een gezonde cel. Voor piramidale corticale neuronen met een kalium-gluconaat-gebaseerde oplossing, deze waarde ligt gewoonlijk tussen -65 en -75 mV.
4. Semi-automatische karakterisering van Electrical Properties Response een Neuron's
- Maak een directory om gebruikersgegevens op te slaan. Om deze dienst zijn een script in het LCG live CD die mappen op basis van de datum creëert doen. Om het te gebruiken, typt u bij de opdrachtprompt
cd ~ / experimenten
LCG-creëren-experiment-map -s psp, in_vivo_like
Dit zal een map waar de gegevens voor die cel wordt opgeslagen (en een 'psp' en 'in_vivo_like' submappen) te maken en het zal zijn naam aan de terminal af te drukkenvenster; Het is ook mogelijk om extra informatie zoals pipet resistentie en celtype met deze script. - Verander de map naar de nieuwe map met het commando
cd ~ / <mapnaam>
De naam van de map is degene weergegeven door de opdracht LCG-creëren-experiment-map en zal het tijdstempel van de huidige dag (dat wil zeggen, jaar-maand-dag), zoals in 20140331A01. - Zorg ervoor dat de versterker is ingesteld om te werken in de huidige klem modus, dat de kabels zijn aangesloten en de externe spanning bevel van de versterker, indien aanwezig, is ingeschakeld.
- Voer het commando LCG-ecodeat de opdrachtprompt. Dit vraagt een reeks commando's (namelijk LCG-ap, LCG-vi, LCG-ramp, LCG-tau en LCG-stappen), gebruikt om de basis respons eigenschappen van de cel te karakteriseren. lcg-Ecode vereist dat de gebruiker specificeert parameters: de amplitude van de 1 ms lang stroomstoot gebruikt om één piek wekken in de cel, en de maximale amplitude van de huidige ramp geïnjecteerd in de cel zijn rheobase vinden.
Gebruik de volgende syntaxis:
lcg-Ecode --pulse-amplitude X --ramp-amplitude Y
met een keuze van de waarden X en Y (in pA) is voldoende om de cel open te maken in reactie op een 1 ms durende impuls en een aanhoudende injectie van stroom, respectievelijk.
LET OP: Deze protocollen vereisen het uitvoeren van de numerieke schatting van de 'elektrode kernel' om de actieve elektrode Compensation (AEC) 15 te gebruiken. Een luidruchtige huidige injectie wordt gebruikt om de kernel en de gebruiker wordt gevraagd om het aantal monsters die deel uitmaken van de kernel te bevestigen. Zie 15 voor meer informatie over de betekenis van de elektrode kernel en hoe het aantal kernel monsters te kiezen.
5. Injectie van Conductance via gesimuleerde Synapses en Simulatie van in vivo-achtige Achtergrond Activiteit
- Injectie van gesimuleerde prikkelende postsynaptische potentialen
- Ga naar de map waar u het volgende experiment zal redden, door het intikken van de volgende opdracht bij de opdrachtprompt van de shell:
cd psp / 01 - Kopieer een LCG configuratie bestand naar de huidige directory en open het met een teksteditor (Nano in dit voorbeeld) door het intikken van de volgende opdrachten bij de opdrachtprompt van de schelp (dit voorbeeld configuratie bestand is opgenomen in de broncode en de live cd) :
cp ~ / local / src / lcg / configuraties / epsp.xml
nano epsp.xml
Opmerking: Het is eenvoudig een tekstbestand verschillende entiteiten met elkaar verbonden. Voor meer details zie de Representatieve resultaten sectie. - Indien nodig bewerken de inputChannel, outputChannel, de inputConversionFactor en de outputConversionFactor in dit bestand te installeren van de gebruiker te passen.
- Bereken de elektrode kernel nodig is om de actieve elektrode compensatie uit te voeren 'de methode die LCG om enkele elektrode dynamische klem uit te voeren' door de uitgifte van de command
lcg-kernel
Dit vraagt om het aantal punten in de kernel. Selecteer opnieuw een nummer, zodat de elektrode kernel dekt het einde van de exponentiële verval staart. - Voer de dynamische klem experiment met de opdracht
lcg-experiment -c epsp.xml - Een lijst van de bestanden en visualiseren van de resultaten met de opdracht
ls -l
LCG-plot-file -f laatste
- Ga naar de map waar u het volgende experiment zal redden, door het intikken van de volgende opdracht bij de opdrachtprompt van de shell:
- Injectie van gesimuleerde remmende postsynaptische potentialen
- Maak een map en kopieer de epsp.xml bestand om het door het intikken van de volgende opdrachten bij de opdrachtprompt van de shell:
mkdir ../02
cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
cd ../02 - Het configuratiebestand bewerken met een tekstverwerker: verander de synaptische omkering potentieel en stijgen en vervaltijd constanten van het model synaps Exp2Synapse op het volgende:
parameters>
<E> -80 </ e>
<TauRise> 0.8e-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10e-3 </ tauDecay>
<Parameters>
Sluit de tekstverwerker. - Bereken de elektrode kernel en het uitvoeren van het experiment als in 5.1, door het intikken van de volgende opdrachten bij de opdrachtprompt van de shell:
lcg-kernel
lcg-experiment -c ipsp.xml - Een lijst van de bestanden en visualiseren van de resultaten, door het intikken van de volgende opdrachten bij de opdrachtprompt van de shell:
ls -l
LCG-plot-file -f <filename.h5>
- Maak een map en kopieer de epsp.xml bestand om het door het intikken van de volgende opdrachten bij de opdrachtprompt van de shell:
- Simulatie van in vivo-achtige achtergrond activiteit:
- Ga naar de map waar u het volgende experiment opslaan, zoals eerder aangegeven, door het intikken van de volgende opdrachten bij de opdrachtprompt van de shell:
cd ../../in_vivo_like/01 - Kopieer het configuratiebestand van LCG bron directory, door het intikken van de volgende opdrachten bij de opdrachtprompt van de shell:
cp ~ / local / src / lcg / configuraties / in_vivo_like.xml
nano in_vivo_like.xml - Pas de DAQ configuratieparameters voor de installatie van de gebruiker, zoals beschreven in 5.1.3 en verlaat de editor.
- Bereken de elektrode kernel en het uitvoeren van het experiment als in 5.1, door het intikken van de volgende opdrachten bij de opdrachtprompt van de shell:
lcg-kernel
lcg-experiment -c in_vivo_like.xml -n 10 -i 3
De -n 10 'en' -i 3 'switches geven dat de stimulatie 10 maal worden herhaald om de drie seconden. - Visualiseer de ruwe sporen met behulp van de volgende opdracht bij de opdrachtprompt van de shell:
LCG-plot-file -f alle
- Ga naar de map waar u het volgende experiment opslaan, zoals eerder aangegeven, door het intikken van de volgende opdrachten bij de opdrachtprompt van de shell:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het voorgaande hebben we beschreven hoe de software toolbox LCG gebruiken om de elektrofysiologische eigenschappen van L5 pyramidale cellen te karakteriseren en in vivo-achtige synaptische activiteit in een slice preparaat opnieuw. Het gebruik van een command-interface en semi-automatische protocol aanzetten reproduceerbaarheid en efficiëntie van het experiment, die een grote invloed op het rendement en de kwaliteit van de geproduceerde gegevens heeft. Bovendien, aangezien de data wordt opgeslagen op een consistente manier is het eenvoudig om de analyse om een bepaald doel te verlengen. Figuur 1 toont de typische resultaten van een experiment waarin fundamentele elektrofysiologische eigenschappen van een cel met behulp van zes verschillende protocols zijn gekarakteriseerd.
Meting van de actiepotentiaal vorm en drempel (Figuur 1A): een korte en sterke puls van depolariserende stroom wordt geïnjecteerd om de gemiddelde actiepotentiaal vorm te meten. Het spike drempelberekend als de eerste piek van de derde afgeleide van de actiepotentiaal 24. Meting van de spanning-stroom curve (Figuur 1B): sub-drempel stroompulsen worden geïnjecteerd in de cel, waardoor de meting van passieve responseigenschappen zoals ingangsweerstand en karakterisering van sub-threshold ionische stromen.
Meting van de minimale huidige voldoende voor het opwekken van duurzame afvuren (figuur 1C). Het geïnjecteerde helling huidige maakt karakterisering van de cel als type I of type II oscillator 25. Meting van de frequentie-stroom (FI) curve (figuur 1D) de geïnjecteerde stroom is een functie van het momentane spuitfrequentie en telkens wanneer een nieuwe cel spikes, volgens het gesloten-lus protocol 5 beschreven. Met deze techniek kan een betrouwbare schatting van de FO curve worden verkregen in minder dan 30 sec. Meting van de membrane tijdconstante (Figuur 1E): korte hyperpolarizing stroompuls wordt aan de passieve relaxatie eigenschappen van het membraan te meten. Deze puls wordt dan geschikt om een dubbele exponentiële de membraantijdsconstante (44 ms in dit geval) te berekenen.
Aanpassing coëfficiënt en reactie depolariserende stroom (Figuur 1F): twee supra-drempelwaarden stroom worden geïnjecteerd om de aanpassing coëfficiënt (verhouding tussen de eerste en laatste inter-piek intervallen) te meten. De geautomatiseerde toepassing van een aantal protocollen zoals die beschreven maakt kenmerkend zijn voor elk opgenomen cel in termen van zijn belangrijkste elektrofysiologische eigenschappen en vormt de basis stap voor de inspanningen ter vergelijking tussen de verschillende neuronen en hun rol, zowel in gezondheid en ziekte.
Hoewel LCG bevat een aantal scripts die gespecialiseerde protocollen uit te voeren, de meeste van de kracht en flexibiliteit van de toolbox wonens in het vermogen om experimenten beschrijven via configuratiebestanden. In Sec. 5 wordt beschreven hoe dynamische klem voeren om gesimuleerde achtergrondactiviteit injecteren in het neuron. Hier het concept van de configuratiebestanden en entiteiten wordt geïntroduceerd. Een configuratiebestand is gewoon een tekstbestand met de namen en de onderlinge verbindingen van de elementaire bouwstenen (genaamd entiteiten) die nodig zijn voor het uitvoeren van een bepaalde experiment; Daarom ontwerpen nieuwe paradigma door verbinding entiteiten is een relatief eenvoudig, zoals het delen en hergebruiken van experimentele paradigma. In de in figuur 2 experiment worden vijf eenheden gebruikt:
H5Recorder: registreert de aangesloten entiteiten om een gecomprimeerd bestand. De hdf5 bestandsformaat is gekozen omdat het wordt ondersteund door de meeste programmeertalen zoals Python en MATLAB.
RealNeuron: biedt een abstractielaag voor het technische aspect van de real-time recording en injectie. Het bevat informatie over de data-acquisitie board en voert de actieve elektrode compensatie online. Wanneer een actiepotentiaal wordt gedetecteerd door drempeloverschrijding, Gewone Neuron voert ook een piek in de vorm van een gebeurtenis: deze kan bijvoorbeeld gebruikt volgen de afvuursnelheid tijdens het experiment of om met kunstmatige synapsen.
Poisson: genereert spike treinen na een exponentiële verdeling met een bepaald tarief. Het zaad van dit proces kan worden vastgesteld, zodat proeven kunnen worden gereproduceerd.
SynapticConnection: ontvangt de aren van de generator en stuurt ze naar de juiste synaps na een bepaalde vertragingstijd.
Exp2Synapse: model van een dubbele exponentiële synaps. Het bevat de omkering potentieel en de opkomst en het verval tijd constanten.
Zoals eerder vermeld, wordt elke entiteit verbonden met een of meer andere to samen een experiment. In het voorbeeld van de simulatie van een prikkelende postsynaptische stroom in Sec beschreven. 5.1, zowel de RealNeuron de Exp2Synapse zijn verbonden met de H5Recorder, op te slaan op bestand membraanspanning en synaptische stroom resp. De Poisson dienst levert spikes gegenereerd met een frequentie van 2 Hz tot de SynapticConnection, die op zijn beurt levert de gebeurtenissen de Exp2Synapse na 1 ms. Tenslotte wordt de Exp2Synapse entiteit verbonden met de RealNeuron. Met kleine variaties van het configuratiebestand, zoals in Sec. 5.2 en 5.3, kan een remmende stromingen te simuleren en recreëren in vivo-achtige activiteit.
In figuur 2 wordt getoond hoe met behulp van een klem dynamische configuratie kan men synaptische integratie gecontroleerde wijze bestuderen door simulatie de geïnduceerde stroom in een neuron kunstmatige synapsen. Figuur 2A (boven) toont afzonderlijk postsynaptische potentialen (top ) alsmede de injecteerde stromen. Rood (blauw) sporen duiden prikkelende (remmende) evenementen. Merk op dat de geïnjecteerde stroom is afhankelijk van de membraanspanning en de verandering in geleiding geassocieerd met de activatie van de virtuele synaps.
Door het leveren van Poisson piek treinen bij hogere frequenties de synapsen, kan in vivo-achtige achtergrondactiviteit gesimuleerd (Figuur 2B en 2D). Zelfs tijdens spiking wanneer grote stromen worden geïnjecteerd (black trace onderin figuur 2B), de actieve elektrode Compensatie garandeert dat de vorm van de pieken niet beïnvloed (figuur 2C), terwijl een enkele elektrode wordt gebruikt om gelijktijdig injecteren huidige en noteer de membraanspanning. Herhalende meerdere studies met dezelfde conductiviteit golfvormen maakt zodat de werkzaamheden van 23 een realistischer framework, waardoor de bijdragen van verschillende synapti scheidenc stromen betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van spike timing.
Figuur 3 toont een eenvoudig voorbeeld van hybride netwerk, verkregen door de gelijktijdig twee los pyramidale cellen en het gebruiken van virtuele GABAergic interneuron een vorm van disynaptic remming simuleren een wijdverbreid mechanisme dat in de cerebrale cortex omvat de activatie van Martinotti cellen. 26, 27 Figuur 3A toont een schematische weergave van de experimentele opstelling: een paar echte, los piramidale cellen (zwarte en rode driehoekjes) kunstmatig via een gesimuleerde GABAergic interneuron, gemodelleerd als een lekke integratie-and-fire neuron. De synaps de presynaptische piramidecellen verbinding met de interneuron displays homosynaptic korte termijn faciliteren uitgevoerd overeenkomstig de Tsodyks-Markram model 28, terwijl de synaps verbindt de interneuron en postsynaptische piramidecellen is een bi-exponentiële synaps met opkomst en verval time constanten van 1 en 10 ms, respectievelijk.
De gewichten van beide verbindingen werden op doorbuiging van de postsynaptische membraan potentiaal van ongeveer 2 mV. Figuur 3B en 3C tonen de respons van het presynaptische neuron piramidale een trein van pulsen intracellulair afgeleverd op 90 Hz en de bijbehorende EPSPS in de gesimuleerde hebben interneuron. de parameters van de synaptische verbinding werden aangepast om de kunstmatige neuron zenden een piek na een presynaptische uitbarsting van 3-4 spikes met hoge frequentie, zoals experimenteel gerapporteerd 26,29 Figuur 3D toont het effect van remming op de disynaptic de werkelijke postsynaptische piramidecellen. 10 trials zijn gesuperponeerd, waarbij de neuron gestimuleerd met bevroren in vivo-achtige achtergrondactiviteit vergelijkbaar met die in figuur 2 beschreven Merk de toename van betrouwbaarheid tegen de drie remmende IPSPs,weerspiegeld in het kleinere piek jitter na het activeren van de remmende cel, zoals aangegeven door de rode streepjes onder de spanning sporen.
Figuur 1. Elektrofysiologische karakterisatie van een patched L5 piramidale neuron Output figuur van de e-code protocol voor een typische piramidecellen.; kwantificeringen worden automatisch uitgevoerd en er geen verdere bewerking nodig is. (A) Berekening van actiepotentiaal drempel (stippellijn -50,5 mV). Rode lijn is de gemiddelde vorm actiepotentiaal. (B) Meting van passieve reactie (boven) tot hyperpolarizing stromen (onder). (C) Reactie toenemende depolariserende stroom naar de rheobase stroom (123 Pa) gemeten. (D) spuitfrequentie als functie van de geïnjecteerde stroom, gemeten met een gesloten-lus benadering. Elk grijs punt ligt aan het paar(Huidige geïnjecteerd, inverse van de interspike interval). De rode curve is de lineaire fit met de gegevenspunten en de stippellijn geeft de rheobase gemeten in panel (C). (E) Maatregel van de membraantijdsconstante (43,8 ms). (F) Identificatie van basische actieve eigenschappen van de cel blijkt dat de cel is een regelmatige stekelige neuron en dat er een minimale aanpassing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Recreatie van in vivo- als activiteit met dynamische klem. (A) Simulatie van prikkelende (rood, Sec. 5.1) en remmende (blauw, Sec. 5.2) synapsen, grijze sporen zijn andere realisaties van hetzelfde experiment. (B ) (C) Vormen van de pieken tijdens het experiment in (B). (D) Raster plot van de gegenereerde over 20 trials spikes toont aan dat de neuron uiterst betrouwbaar en nauwkeurig in reactie op dezelfde ingang als gezien in 23 kunnen zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Simulatie van disynaptic remming via een gesimuleerde remmende interneuron (A) Schematische weergave van de opname setup:. De zwarte en rode piramides zijn een paar van de echte piramidale cellen simultaan opgenomen. Zwart en rood geven presynaptische en postsynaptische neuron, respectievelijk. De blauwe cirkel geeft een virtueel GABAergic interneuron, gecontacteerd door de zwarte piramidecellen, die remt op zijn beurt de rode piramidecellen. (B) Reactie van de werkelijke presynaptische neuron piramidale een reeks pulsen afgegeven met een frequentie van 90 Hz, aangegeven met de oranje streepjes boven de spanning spoor. De zwarte streepjes onder de spanning spoor geven de tijden actiepotentialen werden uitgezonden door de presynaptische cel. (C) Reactie van de gesimuleerde interneuron om de trein van spikes uitgezonden door de presynaptische cel. (D)Superpositie van 10 voltage sporen opgenomen van de werkelijke postsynaptische piramidecellen in responsie op de activatie van de gesimuleerde interneuron. De postsynaptische cel werd gestimuleerd met bevroren in vivo-achtige achtergrond activiteit, om betrouwbare spanning dynamiek krijgen. De rode strepen onder de spanning sporen geven de tijdstippen, gedurende opeenvolgende onderzoeken was de postsynaptische neuronen uitgestraalde een actiepotentiaal. Let op de verhoogde nauwkeurigheid na het activeren van de interneuron, aangegeven door een lagere piek jitter in de onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze tekst volledig protocol voor de implementatie van real-time, gesloten-lus cel elektrofysiologische experimenten beschreven met de patch clamp techniek en een recent ontwikkelde software toolbox genoemd LCG. Om de kwaliteit van de opnames te optimaliseren is het belangrijk dat de opname setup geaard, afgeschermd en trillingsvrij: dit zorgt voor een stabiele en duurzame whole-cell toegang tot de cel, die, tezamen met de mogelijkheid van het automatiseren hele delen van de stimulatieprotocollen , maakt maximalisatie van het debiet van het experiment.
Twee gevallen waarin LCG kunnen worden toegepast zijn aangebracht, namelijk de karakterisatie van een cel qua elektrofysiologische eigenschappen (figuur 1), waaronder de snelle berekening van actieve input-output relatie van een neuron, en de recreatie van in vivo-achtige activiteit in een hersenplakje (figuur 2). Such toepassingen liet zien hoe verschillende protocollen bouwen en belicht een aantal van de meest opvallende kenmerken van LCG: de command-line interface maakt het geschikt voor scripting, waardoor de geautomatiseerde toepassing van een reeks protocollen mogelijk maakt. Bovendien, zoals bij figuur 1, waarden verkregen uit een protocol kan worden gebruikt om parameters maat van opeenvolgende protocollen.
Het is mogelijk om in realtime hogere orde functies van de respons van de cel onder analyse (bijvoorbeeld de momentane vuursnelheid, zie figuur 1D) en de stimulatie daarvan te modificeren, bijvoorbeeld door een PID regelaar actuele berekenen nodig is om een constante of tijdsafhankelijke vuursnelheid te handhaven.
De uitvoering geleidingstijd en dynamische klem protocollen met LCG is eenvoudig en vereist slechts een tekst configuratiebestand schrijven, een procedure die kan worden geautomatiseerd door het gebruik van suitvoe scripts. LCG bevat meer dan 30 entiteiten die kunnen worden verbonden aan nieuwe experimentele protocollen bedenken. We beschreven hoe LCG gebruiken met behulp van een command line interface, maar een grafische experiment launcher is ontworpen om te vergemakkelijken het starten experimenten en het veranderen van de parameters door te laten niet-ervaren gebruikers combineren LCG commando's om hun eigen grafische interfaces te creëren.
Twee bestaande gereedschapskisten bieden functionaliteiten vergelijkbaar met LCG: RELACS en RTXI. De eerste is zowel een platform voor het uitvoeren van elektrofysiologische experimenten en voor het analyseren en annoteren van de opgenomen data. Het belangrijkste verschil tussen LCG en bestaande oplossingen is de user interface op basis van een command-line. De voordelen van deze aanpak zijn verschillende: in de eerste plaats, een command-line interface maakt het automatiseren van gestandaardiseerde en repetitieve taken door middel van mogelijk complexe scripts en ten tweede, het laat het inbedden van experimentele studies in meer gecompliceerde workflows geïmplementeerdin high-level scripting taal, zoals Matlab of Python.
Samengevat, de modulaire aard van LCG maakt uitbreiding van het aantal beschikbare experimentele protocollen twee manieren: de eerste en eenvoudigste is door het schrijven ad hoc configuratiebestanden bestaande voorwerpen om nieuwe protocollen voeren. De tweede is door de uitvoering - met behulp van C ++ - nieuwe elementaire objecten die kunnen worden gebruikt om verdere uitbreiding van de mogelijkheden en functies van de LCG. De voorbeelden in dit protocol betrekking op de studie van individuele cellen in de hersenen plakjes. Echter, vergelijkbare protocollen kunnen ook met succes worden toegepast bij in vivo preparaten in zowel intracellulaire als extracellulaire signalen opnemen, en ex vivo preparaten zoals neuronale cultures, opnemen, bijvoorbeeld extracellulaire potentialen door middel multielektroden terwijl stimulerend closed lus 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. Patch Clamping. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
