Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

केल्विन जांच बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग बैक्टीरिया की सतह संभावित मापन

Published: November 28, 2014 doi: 10.3791/52327
Automatic Translation
1, 1
1BioNano Laboratory, School of Engineering, University of Guelph

Abstract

सतह संभावित सतहों सब्सट्रेट करने के लिए सूक्ष्मजीवों के आसंजन में एक प्रमुख भूमिका निभाता है कि एक सामान्य अनदेखी की शारीरिक विशेषता है। केल्विन जांच बल माइक्रोस्कोपी (KPFM) नैनो पैमाने पर सतहों के बीच संपर्क संभावित अंतर उपाय है कि परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) के एक मॉड्यूल है। AFM के साथ KPFM के संयोजन सतह संभावित और इस तरह के बैक्टीरियल कोशिकाओं के रूप में जैविक नमूने का स्थलाकृतिक नक्शे के एक साथ पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। यहाँ, हम इस तरह के स्टेनलेस स्टील और सोने के रूप में चिकित्सकीय प्रासंगिक सतहों के लिए माइक्रोबियल आसंजन पर सतह क्षमता के प्रभाव की जांच करने के लिए KPFM रोजगार। सतह संभावित नक्शे अलग सामग्री substrates पर माइक्रोबियल झिल्ली के लिए सतह क्षमता में मतभेद का पता चला। एक कदम ऊंचाई ग्राफ सब्सट्रेट सतह और सूक्ष्मजीवों के बीच एक सीमा क्षेत्र में सतह क्षमता में अंतर दिखाने के लिए तैयार की गई थी। सेलुलर झिल्ली सतह क्षमता में परिवर्तन परिवर्तन के साथ जोड़ दिया गया हैसेलुलर चयापचय और गतिशीलता में एस। इसलिए, KPFM विभिन्न सब्सट्रेट सतहों आसंजन पर माइक्रोबियल झिल्ली सतह क्षमता के परिवर्तन की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। इस अध्ययन में, हम KPFM का उपयोग कर स्टेनलेस स्टील और सोने पर व्यक्तिगत मेथिसिलिन प्रतिरोधी Staphylococcus aureus USA100 कोशिकाओं की सतह संभावित चिह्नित करने के लिए प्रक्रिया प्रदर्शित करता है।

Introduction

Biofilms हटाने के लिए अड़ियल होते हैं और रोग पारेषण और रोगाणुरोधी प्रतिरोध की वृद्धि दर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में उपकरण सतहों पर और त्वचीय घाव में उत्पादित biofilms चिकित्सा उद्योग के लिए एक समस्या प्रस्तुत करते हैं। अनुलग्नक biofilm गठन में पहला कदम है और इसके उलटने 1-3 की वजह से सबसे महत्वपूर्ण कदम है। सब्सट्रेट सतह विशेषताओं माइक्रोबियल लगाव पर एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ऐसी सतह कठोरता, सरंध्रता, खुरदरापन, और hydrophobicity कारक के रूप में माइक्रोबियल लगाव असर दिखाया गया है; हालांकि, माइक्रोबियल आसंजन पर सब्सट्रेट सतह संभावित (सपा) की भूमिका की जांच के छोटे से अनुसंधान 4,5 किया गया है। नकारात्मक आरोप लगाया सतहों अभ्रक, सिलिकॉन, और सोने से 6 बेसिलस thuringiensis बीजाणुओं का लगाव को रोकने के। सेलुलर झिल्ली क्षमता में परिवर्तन सेलुलर लगाव और गतिशीलता 5,7 में परिवर्तन के संकेत हैं। यह विद्युत hom देखा गया है किogeneous सतहों और अधिक आसानी से माइक्रोबियल आसंजन 5 बढ़ावा देने के। Nanoscale पर बैक्टीरिया की सतह संभावित निस्र्पक विरोधी जैव अवरोध रणनीतियों के विकास में सहायता कर सकते हैं, जिससे विभिन्न सतहों के लिए बैक्टीरिया के आसंजन कैनेटीक्स को समझने के लिए एक उपन्यास तरीका प्रदान करते हैं, और कर सकते हैं। ऐसे electrophoretic प्रकाश बिखरने, जीटा संभावित है, और समविद्युतविभव बिंदु दृढ़ संकल्प के रूप में बैक्टीरिया की विद्युत कैनेटीक्स निस्र्पक के लिए इस्तेमाल अन्य विधियों के विपरीत, केल्विन जांच बल माइक्रोस्कोपी (KPFM) व्यक्ति की कोशिकाओं के बजाय पूरे संस्कृतियों 8-11 की परीक्षा के लिए अनुमति देता है। सेल सेल तुलना या उच्च सटीकता और परिशुद्धता के साथ विद्युत विशेषताओं biofilm करने के लिए इच्छुक है, जब यह फायदेमंद है।

KPFM परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) के एक मॉड्यूल है। AFM के स्कैनिंग टनलिंग माइक्रोस्कोप (एसटीएम) 12 का एक सीधा परिणाम के रूप में विकसित किया गया था। एसटीएम का उपयोग कर पहली बार प्रकाशित छवियों 1982 12 में गर्ड बिन्निग और हेनरिक Rorhrer द्वारा किया गया से 12 एसटीएम का उपयोग करने का प्रयास किया है जो जीव उत्साहित उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के निहितार्थ। एसटीएम भी विशेष जांच सुझावों 13 का उपयोग कर तरल पदार्थ में किया जा सकता है। इस लिंडसे एट अल।, सोने इलेक्ट्रोड पर 13, 10 मिमी HClO 4 में और पानी में छवि डीएनए अणु के लिए एसटीएम और AFM का इस्तेमाल किया है जो द्वारा दिखाया गया था। KPFM ligands के 26 के साथ डीएनए और प्रोटीन विश्लेषण 25 और biomolecules बातचीत के भूतल क्षमता का निर्धारण करने में प्रदर्शन किया गया है।

KPFM एक AFM प्रवाहकीय ब्रैकट टिप और एक आदर्श प्रवाहकीय नमूना के बीच संपर्क संभावित अंतर (सीपीडी) को मापने के द्वारा 14,15 (, मैं चित्रा 1) चल रही है। नमूने जरूरी प्रवाहकीय (यानी, जैविक sampl होने की जरूरत नहीं हैते)। इमेजिंग अभ्रक, कांच, और जब तक गैर प्रवाहकीय सतह पतली है और एक अंतर्निहित प्रवाहकीय सामग्री 6,7 के रूप में वहाँ सिलिकॉन सतहों (गैर प्रवाहकीय) पर बाहर किया जा सकता है। सीपीडी सतह संभावित वोल्टेज के बराबर है और नकारात्मक इलेक्ट्रॉन प्रभारी द्वारा विभाजित टिप (φ टिप) और नमूना (φ नमूना) के बीच काम कार्यों में अंतर है, के रूप में वर्णित किया जा सकता है (- ई)। एक प्रवाहकीय AFM टिप एक नमूना की सतह के करीब लाया जाता है जब कारण फर्मी ऊर्जा में अंतर (चित्रा 1, द्वितीय, एक) 15 के लिए एक विद्युत बल (एफ ते) उत्पन्न होता है, (दूरी डी से विभाजित)। इस बिंदु पर, टिप और नमूना (ई वी) के निर्वात ऊर्जा संतुलन और गठबंधन में हैं। करीब नमूना की सतह के लिए टिप लाने पर, टिप और नमूना की सतह समानांतर थाली capacitors के (चित्रा 1, द्वितीय, ख के रूप में बिजली के संपर्क और हरकत में आ गए 14,15। बिंदु पर, टिप और नमूना की सतह के फर्मी ऊर्जा एक स्थिर राज्य संतुलन तक पहुँचने गठबंधन हो गया (चित्रा 1, द्वितीय, ख)। टिप और नमूना की सतह के कारण ई वी के और काम के कार्यों में एक फर्क करने के लिए शुल्क लिया जाएगा और एक वी सीपीडी बनेगी। कारण का गठन वी सीपीडी करने के लिए बिजली के संपर्क क्षेत्र पर एक एफ तों कार्य करता है। इस बल बाद में (चित्रा 1, द्वितीय, सी) का गठन वी सीपीडी के रूप में उसी परिमाण है कि टिप करने के लिए एक बाहरी वी डीसी के आवेदन के माध्यम से निरस्त माना जाता है। इस डीसी वोल्टेज बिजली के संपर्क के क्षेत्र में सतह प्रभारी समाप्त आवेदन किया है, और वी सीपीडी की एफ तों को खत्म करने के लिए आवश्यक वी डीसी की राशि एसए के बीच काम कार्यों में अंतर के बराबर हैmple सतह और टिप 15। यह टिप का काम समारोह में जाना जाता है और यह निर्माताओं द्वारा प्रदान की जाती है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। सभी KPFM तरीकों में, एक एसी वोल्टेज (वी एसी, लगभग 100-500 एम वी) भी टिप और नमूना 14 के बीच दोलन बिजली बलों को उत्पन्न करने के क्रम में टिप करने के लिए लागू किया जाता है। वी सीपीडी और / या एफ तों में परिवर्तन को मापने जब ​​यह बेहतर समाधान प्रदान करता है। इस संबंध में, आवृत्ति या बिजली दोलन के आयाम में परिवर्तन वी डीसी द्वारा सही, और संभावित नक्शे उत्पन्न किया जा सकता सतह जा सकता है। इन मानचित्रों के विशिष्ट क्षेत्रों से डाटा आगे विशिष्ट स्थलाकृतिक सुविधाओं के बारे में बिजली की जानकारी प्रदान करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है।

(1) लिफ्ट मोड, (2) आयाम मॉड्यूलन (एएम) मोड, और (3) आवृत्ति मॉडुलन (एफएम) मोड 14,16: KPFM तीन मोड में संचालित किया जा सकता है। लिफ्ट मोड प्रारंभिक इंक थाKPFM की arnation। लिफ्ट मोड एक डोलती टिप एक स्थलाकृतिक छवि प्राप्त करने के लिए सतह भर में घसीटा है, जिसमें एक दो-पास पद्धति पर निर्भर करता है। दूसरा पास के लिए टिप नमूना के ऊपर एक पूर्व निर्धारित दूरी उठाया है (10 - 100 एनएम) और वापस उसी क्षेत्र भर में स्कैन कर है। कारण AM- और एफएम-KPFM की तुलना में इस दो-पास विधि, लिफ्ट मोड, करने के लिए, छवि अधिग्रहण के लिए सबसे लंबे समय लेता है। सतह से दूर टिप बढ़ाने से ही लंबी दूरी की एफ तों मापा जाता है कि यह सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, स्थलाकृति और सतह संभावित माप के बीच पार बात की वृद्धि हुई पार्श्व संकल्प और संवेदनशीलता की कीमत पर decoupled है।

पूर्वाह्न-KPFM एक साथ नमूना स्थलाकृति और सतह क्षमता (एक-पास स्कैन) 14 को मापने के लिए दोहरे आवृत्तियों का उपयोग करके पार्श्व संकल्प और संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है। पूर्वाह्न मोड में, ब्रैकट यंत्रवत् आम तौर पर 5% अपनी पहली गुंजयमान आवृत्ति नीचे, डोलती है (एफ 0), और विद्युत डोलती (Tअपनी दूसरी गुंजयमान आवृत्ति (एफ 1) पर एक वी एसी) hrough। कारण एफ तों और वी सीपीडी में परिवर्तन करने के लिए एफ 1 के आयाम में परिवर्तन, सतह संभावित माप डेटा दे, जबकि स्थलाकृतिक डेटा की पीढ़ी के लिए एफ 0 की बढ़त के आयाम में परिवर्तन,। एफ 0 और ब्रैकट के एफ 1 पार बात 14 कम से कम है का संकेत है कि महत्वपूर्ण आवृत्तियों और ऊर्जा से अलग हो रहे हैं। AFM की सिर इलेक्ट्रॉनिक्स बॉक्स (एचईबी) दोनों स्थलाकृतिक देने के लिए और एक स्कैन में एक साथ संभावित डेटा सतह के लिए दो संकेतों बाहर अलग करती है। एफएम-KPFM जैविक सतहों पर 14 संकल्प भी आगे से पूर्वाह्न-KPFM में सुधार। एफएम-KPFM यह विद्युत बल ढ़ाल के बजाय विद्युत बल (एफ तों) 15 में परिवर्तन है कि उपायों में पूर्वाह्न-KPFM तुलना में अलग तरह से काम करता है। पूर्वाह्न मोड की तरह, एफएम मोड दोहरे आवृत्तियों और एक singl का इस्तेमालई-पास स्कैनिंग तंत्र स्थलाकृतिक प्राप्त करने और एक साथ 14 संभावित डेटा सतह के लिए। एफएम मोड में, ब्रैकट यंत्रवत् एफ 0 में डोलती है और विद्युत एक कम संशोधित आवृत्ति पर डोलती (आधुनिक एफ, आम तौर पर 1-5 किलोहर्ट्ज़)। Electrostatic बातचीत करने पर, 0 और च आधुनिक विपणन मिश्रण एफ 0 ± च आधुनिक विपणन च पक्ष बैंड का उत्पादन करने के लिए। ये sidebands विद्युत बल में परिवर्तन करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं, और AFM के एचईबी के माध्यम से एफ 0 से अलग किया जा सकता है। एफएम-KPFM विद्युत बल ढ़ाल में परिवर्तन के उपायों के बाद से, सुझावों सुप्रीम आकार और उसके रखरखाव / अखंडता। समग्र सतह संभावित संकल्प 14, 15 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं पूर्वाह्न उपयोग करते हुए संभावित संकल्प सतह और एफएम मोड पार्श्व 1 एनएम की रेंज में 14 हैं -16। यह KPFM इमेजिंग में (गैर-ध्रुवीय तरल पदार्थ में किया जा सकता है, और हाल ही में, कम-आयनिक (<10 मिमी) ध्रुवीय तरल पदार्थ में किया जाना दिखाया गया है कि ध्यान दिया जाना चाहिएऐसे MilliQ पानी के रूप में एक डीसी पूर्वाग्रह के आवेदन obviating, एक पूर्वाग्रह आपके सुझाव की आवश्यकता नहीं है, जो खुले पाश KPFM मोड); हालांकि, KPFM इमेजिंग अभी तक ध्रुवीय समाधान 17-20 में जीवित कोशिकाओं पर किया जाना गया है। तरल में सपा इमेजिंग के साथ जुड़े अतिरिक्त चुनौतियों के समाधान आमतौर पर बनाए रखने की कोशिकाओं के लिए प्रयोग किया जाता है (यानी, फॉस्फेट बफर खारा) Faradaic प्रतिक्रियाओं, पूर्वाग्रह से प्रेरित आरोप गतिशीलता, और आयन प्रसार / पुनर्वितरण 20 के लिए नेतृत्व करेंगे जो मोबाइल आयनों के उच्च सांद्रता है। इस प्रकार, इस प्रयोग के लिए, माप परिवेश की स्थिति के तहत पाली एल Lysine Functionalized स्टेनलेस स्टील और सोना सतहों पर सूखे और मृत मरसा कोशिकाओं से ले जाया गया। इमेजिंग पहले से सूखे या सतहों 20 पर स्थिर कर दिया गया है कि जैविक नमूने पर हवा या वैक्यूम की स्थिति में बाहर किया जा सकता है। आर्द्र परिस्थितियों में भी सतहों 6 की KPFM इमेजिंग प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है।

इस अध्ययन में, हम एफएम-KPFM कार्यरतऔर AFM पाली एल Lysine Functionalized स्टेनलेस स्टील और सोना सतहों मेथिसिलिन प्रतिरोधी Staphylococcus aureus USA100 (मरसा) की कुर्की पर सपा की भूमिका की जांच करने के लिए। मरसा हाल ही में होने के कारण कई β-लेक्टम एंटीबायोटिक दवाओं और सेफैलोस्पोरिन 21 करने के लिए अपने स्वाभाविक रूप से चयनित प्रतिरोध करने के लिए एक बहु दवा प्रतिरोधी (एमडीआर) "superbug" के रूप में स्थिति हुई हैं। MRSA संक्रमण ऐसी vancomycin या लंबी अवधि के उपचार में 22 के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता इसलिए मनुष्यों में उच्च विषाक्तता के स्तर है, और जो oxazolidinones के रूप में कठोर antimicrobials का उपयोग करने के लिए अग्रणी, अब इलाज के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण मुश्किल है, और मजबूत हैं। स्टेनलेस स्टील अपनी चिकित्सा प्रासंगिकता और गोल्ड एक तुलनात्मक धातु के रूप में इस्तेमाल किया गया था आदि चमड़े के नीचे सुई, और bedpans, दरवाज़े के हैंडल, सिंक, में एक सामग्री के रूप में आम प्रयोग की वजह से चुना गया था। एफएम-KPFM माइक्रोबियल झिल्ली सपा substrates के लिए लगाव पर बदलता है अगर जांच करने के लिए उपयोग किया गया था।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

कांच के बने पदार्थ और संस्कृतियों के 1. तैयारी

  1. इस प्रयोग के साथ आगे बढ़ने से पहले, 5% भेड़ रक्त अगर (एसबीए) मरसा उगाने के लिए प्लेटें तैयार करते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एसबीए प्लेटें सेते हैं। इस समय के बाद, एकल, अच्छी तरह से अलग-थलग कालोनियों तरल मीडिया में बाद में inoculations के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए उपस्थित होना चाहिए। 2 महीने - स्टोर 1 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एकल कालोनियों के साथ एसबीए प्लेटें रेखादार।
    नोट: भेड़ के रक्त अगर प्लेटों के बीच 20 से युक्त पूर्व बनाया पैक में आते हैं - निर्माता के आधार पर 25 प्लेटें, और आम तौर पर वी भेड़ के खून / डब्ल्यू 5% के अलावा के साथ एक tryptic सोया अगर आधार से मिलकर बनता है।
  2. 1% ग्लूकोज और 0.1% सोडियम क्लोराइड के साथ पूरक tryptic सोया शोरबा (टीएसबी) के 500 मिलीलीटर बनाओ। इस के बाद, इकट्ठा करने और दो गिलास टेस्ट ट्यूब साफ। Autoclavable पलकों टेस्ट ट्यूब के लिए उपलब्ध नहीं हैं, तो एक टोपी के रूप में एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करें। आटोक्लेव TSB और 1 मिलीलीटर पिपेट सुझावों का एक बॉक्स के साथ साथ टेस्ट ट्यूब।
  3. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत या एक बन्स के पासबर्नर एन, पिपेट पहले से की 5 मिलीलीटर autoclaved टेस्ट ट्यूब में टीएसबी autoclaved। कि पर्याप्त समय सुनिश्चित करने के लिए सावधान रहें टीएसबी जाने के लिए दिया जाता है और टेस्ट ट्यूब कमरे के तापमान को शांत कर दिया गया है। एक पहले से परेशान 5% एसबीए थाली से, 6 मिलीग्राम टीएसबी शोरबा में एक ही कॉलोनी टीका लगाना। एक मरसा में शामिल होंगे, और दूसरा टेस्ट ट्यूब बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।
  4. टीका टीएसबी टेस्ट ट्यूब ले लो और 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए और 200 rpm पर एक पारस्परिक इनक्यूबेटर में उन्हें जगह है। कोई विकास नियंत्रण टेस्ट ट्यूब में हुई है चाहिए, जबकि इस समय के बाद माइक्रोबियल विकास मरसा टेस्ट ट्यूब में स्पष्ट होना चाहिए।
  5. ताजा टीएसबी के 6 मिलीलीटर में 24 घंटा संस्कृति और पिपेट से 1 मिलीलीटर ले लो। 200 rpm पर छह घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. पिपेट एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में 6 घंटा उप-संस्कृति के 1 मिलीलीटर। 850 x जी पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और विआयनीकृत एच 2 ओ के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित अपकेंद्रित्र, दोहराने, और फिर से निलंबित।

  1. स्टेनलेस स्टील और सोने की AFM नमूना डिस्क (20 मिमी और क्रमश: 10 मिमी व्यास) ले लो और विआयनीकृत एच 2 ओ के 5 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक पक्ष साफ संदंश के साथ प्रमुख हाथ में नमूना डिस्क पकड़ो और नमूना डिस्क के प्रत्येक पक्ष पर 5 एमएल पिपेट को subdominant हाथ का उपयोग करें। एक मिनट के लिए sonication द्वारा पीछा किया विआयनीकृत एच 2 ओ के 20 मिलीग्राम से युक्त एक बीकर में दोनों पक्षों ने जगह नमूना डिस्क धोने के बाद।
  2. Sonication के उपयोग संदंश के बाद बीकर से नमूना डिस्क को हटा दें। वे एक कागज तौलिया पर एक खुला पेट्री थाली के किनारे के खिलाफ एक 60 डिग्री के कोण पर झुक इतना है कि डिस्क रखें। सुखाने डिस्क कवर करने के लिए पेट्री थाली के ढक्कन का प्रयोग करें। डिस्क आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से सूखा। 8 घंटा - समय सुखाने 4 के बीच भिन्न हो सकते हैं।
  3. एक बार सूखा, एक पेट्री थाली में नमूना डिस्क स्थान के लिए संदंश का उपयोग करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, (किसी भी सामग्री के साथ नमूना डिस्क की सतहों functionalizeउदाहरण के लिए, कोलेजन, hyaluronan, चांदी नैनो कणों, आदि)।
    2. इस प्रयोग के लिए, कोट करने के लिए पाली एल lysine सब्सट्रेट सतह का उपयोग करें। के लिए पाली एल Lysine functionalization, पिपेट 200 - नमूना डिस्क पर (एच 2 ओ में) 0.1% पाली एल Lysine के 400 μl, और एक पेट्री डिश में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते करते हैं।
    3. 1 घंटे बाद, नमूना डिस्क पकड़ है, और विआयनीकृत एच 2 ओ के 1 एमएल के साथ धोने के लिए संदंश का उपयोग कदम 2.2 में वर्णित के रूप में कागज तौलिए पर शुष्क करते हैं।
  4. 2x धोया फिर से निलंबित कर दिया कोशिकाओं लो और 200 प्लेट - एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर नमूना डिस्क पर 400 μl। नमूना डिस्क पाली एल Lysine लेपित के साथ कर रहे हैं, कमरे के तापमान पर 0.5 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. नमूना डिस्क पर कोशिकाओं के ऊष्मायन के बाद, विआयनीकृत एच 2 ओ के 1 मिलीलीटर के साथ धीरे नमूना डिस्क धोने डिस्क इमेजिंग से पहले रात भर दो सूखी।

3. KPFM इमेजिंग

नोट: इस प्रयोग के लिए,एक Agilent 5500 श्रृंखला इल्म-AFM के लिए उपयोग करें।

  1. AFM के शुरू करने के लिए, AFM के एचईबी और मैक तृतीय नियंत्रक के साथ साथ कंप्यूटर इकाई पर बारी। ओपन AFM इमेजिंग सॉफ्टवेयर (जैसे, Agilent है PicoView)। शुरू में ACAFM या जो भी सही पदनाम विरामी संपर्क मोड में इमेजिंग के लिए AFM के पर है का चयन करने के लिए सुनिश्चित करें।
  2. प्रमुख हाथ में है AFM संदंश का प्रयोग, और subdominant हाथ के साथ खुला वसंत लोड क्लिप धारक पकड़े, सिर-टुकड़े करने में एक KPFM ब्रैकट जगह है। हैंडलिंग और (कम से कम 5500 इल्म-AFM के पर) इस इकाई के रूप में AFM के लिए AFM के सिर टुकड़ा स्थानांतरित करने एक्स, वाई, जेड और स्कैनिंग directionalities कि नियंत्रण कमजोर piezo क्रिस्टल इकाई होता है जब सावधान रहें।
    नोट: इस मामले में इस्तेमाल KPFM cantilevers Mikromasch प्रवाहकीय डीपीई 2.7 एन / मी के 80 kHz और वसंत स्थिरांक की औसत गुंजयमान आवृत्तियों के साथ (कम शोर) cantilevers थे। इन गुंजयमान आवृत्तियों और वसंत स्थिरांक के साथ cantilevers के कारण उपयोग के अपने आसानी के लिए चुने गए हैं।बड़ा वसंत स्थिरांक और उच्च गुंजयमान आवृत्तियों के साथ cantilevers भी इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. ध्यान से AFM के में सिर टुकड़ा लोड और (दो तारों में खामियों को दूर करने की आवश्यकता है कि इस मामले में: लेजर प्रकाश और मंच लिफ्ट मोटर) उपयुक्त तारों को जोड़ने।
  4. ब्रैकट की नोक पर लेजर संरेखित करें। कुछ इकाइयों आसान संरेखण के लिए अनुमति देता है जो एक कैमरा कार्यक्षमता होते हैं। कैमरे की कार्यक्षमता है AFM पर मौजूद नहीं है, तो अगले वर्णित के रूप में, ब्रैकट टिप पर संरेखित:
    1. ब्रैकट चिप ज़्यादा लेजर स्थानांतरित करने के लिए सामने से वापस घुंडी दक्षिणावर्त घुमाएँ। लेजर चिप तक पहुँच जाता है कि यह अवरुद्ध हो जाएगा और अब नहीं दिखाई जाएगी। केवल घुंडी एक बार कुछ बदल जाते हैं।
    2. लेजर हाजिर reappears तक वामावर्त सामने से वापस घुंडी घुमाएँ। लेजर चिप के किनारे पर अब है।
    3. ब्रैकट पर लेजर की स्थिति के लिए छोड़ दिया करने के लिए सही घुंडी घुमाएँ। लेजर ब्रैकट के ऊपर से गुजरता के रूप में यह गायब हो जाते हैं और मैं फिर से बाहर निकलना होगाएन तेजी से उत्तराधिकार। लेजर हाजिर फोटोडायोड इकाई बाद में बैठेंगे जहां पाले सेओढ़ लिया गिलास को कवर में दिखाई जानी चाहिए।
    4. पाले सेओढ़ लिया गिलास मौके पर गायब हो जाता है जब तक सिरे की ओर ब्रैकट नीचे हाजिर करने के लिए कदम वामावर्त सामने से वापस घुंडी बारी।
    5. यह सिर्फ ब्रैकट टिप पर बैठता है तो यह है कि लेजर की स्थिति के लिए आदेश में केवल थोड़ा सामने से वापस घुंडी दक्षिणावर्त बारी। लेजर हाजिर पाले सेओढ़ लिया गिलास पर फिर से बाहर निकलना होगा।
      नोट: यह डाइविंग बोर्ड cantilevers के लिए लेजर पोजीशनिंग विधि है। त्रिकोणीय cantilevers के लिए, संरेखण प्रक्रिया से थोड़ा अलग है।
  5. लेजर गठबंधन किया है एक बार, AFM के लिए नमूना संलग्न जब ब्रैकट और नमूना के बीच पर्याप्त जगह सुनिश्चित करने के लिए 10 सेकंड के लिए "खुले" स्थिति में मंच लिफ्ट मोटर पकड़।
  6. KPFM नमूना मंच पर नमूना रखें। एक तांबे के तार का उपयोग कर नमूना जमीन। नमूना चरण के लिए है AFM से उपयुक्त तारों कनेक्ट। एस कनेक्टAFM के लिए Tage। ज्यादातर मामलों में मंच चुंबक का उपयोग जगह में आयोजित किया जाता है।
  7. AFM के सॉफ्टवेयर में, धुन ब्रैकट और फिर नमूना ब्रैकट टिप के दृष्टिकोण शुरू करते हैं। समय से निपटाने के कोई 10 से अधिक मिसे पर सेट है कि सुनिश्चित करने, और दृष्टिकोण है कि गति टिप क्षति से बचने के क्रम में 2.0 माइक्रोन / सेकंड से अधिक नहीं है।
  8. ब्रैकट टिप नमूना की सतह पर एक बार, एक इमेजिंग खिड़की के आकार और आदर्श इमेजिंग क्षेत्र का चयन करें। स्थलाकृतिक इमेजिंग अनुकूलित है कि इतनी ब्रैकट सेट बिंदु के साथ साथ मैं और पी लाभ का अनुकूलन।
    1. स्थलाकृतिक इमेजिंग अनुकूलित है एक बार, KPFM मॉड्यूल पर बारी (एफएम या पूर्वाह्न मोड, यहाँ, एफएम मोड का उपयोग करें)। यह KPFM इमेजिंग 5 माइक्रोन एक्स 5 माइक्रोन इमेजिंग खिड़की के बाहर बहुत ही चुनौतीपूर्ण है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। (- 0.05 लाइनों / सेक 0.02) इसके अलावा, इष्टतम KPFM इमेजिंग के लिए, धीमी गति से स्कैन गति के साथ एक 512 x 512 संकल्प का उपयोग करें।
  9. 10% - एफएम-KPFM सेटिंग्स के लिए (सेटिंग्स ACAFM नहीं), 5 के बीच ड्राइव प्रतिशत निर्धारित किया है। ब्रैकट fr के सेट2 kHz के एक बैंडविड्थ के साथ 5 किलोहर्ट्ज़ - 1 के बीच equency। 0.3% करने के लिए एफएम-KPFM सेटिंग्स के लिए मैं और पी लाभ निर्धारित करें।
    1. संकेत बैंडविड्थ और मैं और नमूना सतहों के बीच पी लाभ बदलती हैं। सपा इमेजिंग का अनुकूलन करने के लिए, आगे संकेत बैंडविड्थ को समायोजित करने और मैं और पी लाभ इष्टतम छवियों को प्राप्त करने के लिए। 0.35% - मैं और पी लाभ की सिफारिश की सीमा 0.22 से हैं।
  10. प्रक्रिया और सपा डेटा एकत्रित करने के बाद छवि संसाधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर KPFM छवियों एकत्र विश्लेषण।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

KPFM का उपयोग करते हुए सपा को मापने की क्षमता नमूना की सतह और ब्रैकट टिप दोनों कुछ हद तक प्रवाहकीय हैं कि सिद्धांत पर निर्भर करता है। स्टेनलेस स्टील और सोने मरसा जुड़े थे जो करने के लिए के रूप में प्रवाहकीय सतहों में काम किया। KPFM छवियों 512 X 512 संकल्प के साथ दोनों सतहों पर 15 मरसा कोशिकाओं का लिया, और 5 एक्स 5 माइक्रोन से 10 एक्स 10 माइक्रोन से लेकर स्कैन क्षेत्रों के साथ कर रहे थे। स्कैनिंग 0.02 लाइनों / सेकंड से 0.05 लाइनों / सेकंड से लेकर लाइन गति के साथ किया गया। 512 डेटा बिंदुओं स्कैन करने के लिए लाइन और 512 लाइनों के प्रति एकत्र साथ इसलिए, स्कैन टाइम्स 2.84 घंटा से 7.11 घंटा तक बताया गया। एकत्र छवियों के प्रकार चित्रा 2 में देखा जा सकता है। KPFM दोहरी आवृत्तियों का उपयोग कर चल रही है, और इस तरह के रूप में, स्थलाकृतिक छवियों को एक साथ सतह के विद्युत विशेषताओं के बारे में डेटा के साथ एकत्र कर रहे हैं। थर्मल फिल्टर और अधिक आसानी से सतह संभावित (चित्रा 2) में छोटे परिवर्तन विचार करने के क्रम में नक्शे सपा लागू किया गया। सपा नक्शे से डाटा Wविश्लेषण किया के बाद इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के रूप में औसत सतह क्षमता और मानक विचलन का निर्धारण करने के लिए। सांख्यिकीय विश्लेषण आर ओपन सोर्स सांख्यिकीय प्रोग्रामिंग का उपयोग किया गया था। छात्र टी परीक्षण महत्वपूर्ण माना जा रहा है पी <0.05 के साथ समूहों तुलना करने के लिए प्रदर्शन किया गया।

सपा छवियों माइक्रोबियल झिल्ली सतह क्षमता का निर्धारण करने के लिए विश्लेषण किया गया। ये अलग सब्सट्रेट सतहों पर विकास के साथ तुलना में तो थे। इस सतह प्रकार माइक्रोबियल झिल्ली सतह क्षमता पर एक प्रभाव पड़ा, तो यह निर्धारित करने के क्रम में किया गया था। शुरू में हम सब्सट्रेट सतहों पर तीन घंटे के लिए स्थिर रुप से मरसा कोशिकाओं सेते करने का प्रयास किया। हालांकि, कोई संलग्न रोगाणुओं AFM के तहत दिखाई दे रहे थे। स्वच्छ और पाली एल Lysine Functionalized सतहों के लिए सपा डेटा 5 एक्स 5 माइक्रोन स्कैन किया क्षेत्रों से निर्धारित किया गया था। नंगे स्टेनलेस स्टील और नंगे सोने substrates के सपा स्कैन क्रमशः समग्र नकारात्मक सतह क्षमता (-0.045 ± 0.057 वी और -0.126 ± 0.052 वी, पता चला, पी = 0.047, चित्रा 3)। पाली एल Lysine सेल लगाव के लिए उन्हें और अधिक अनुकूल बनाने के लिए सतहों functionalize के क्रम में इस्तेमाल किया गया था। Functionalized सतहों स्टेनलेस स्टील और सोना सतहों (क्रमशः 0.133 ± 0.063 वी और 0.126 ± 0.030 वी, चित्रा 3) के लिए सकारात्मक सतह क्षमता के लिए एक बदलाव दिखाया। हम बाद में पाली एल Lysine Functionalized स्टेनलेस स्टील और सोना सतहों पर मरसा की झिल्ली क्षमता की जांच की। यह मरसा कोशिका झिल्ली क्षमता स्टेनलेस स्टील और सोना सतहों के बीच विभिन्न कि पाया गया था। उनके सोने के समकक्ष की तुलना में जब स्टेनलेस स्टील सतहों की कोशिकाओं के लिए काफी बड़ा सकारात्मक झिल्ली एसपी का नेतृत्व किया। उदाहरण के लिए, मरसा कोशिकाओं की सपा नकारात्मक एसपी को सकारात्मक से बंद कर दिया। मरसा 0.160 ± 0.022 वी के एसपी और सोने की सतहों पर -0.025 ± 0.016 वी के एसपी (पी <0.001) के साथ स्टेनलेस स्टील सतहों पर सकारात्मक सपा दिखाया।

KPFM, एक उदाहरण के पूर्ण क्षमताओं को दिखाने के लिएस्टेनलेस स्टील पर MRSA के एक कदम ऊंचाई ग्राफ की (चित्रा 4) प्रदान की जाती है। इस सब्सट्रेट सतह और माइक्रोबियल झिल्ली के बीच सतह क्षमता में अंतर को दर्शाता है।

चित्रा 1
परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी (i) और केल्विन जांच बल सूक्ष्मदर्शी (द्वितीय) (15) से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित 1. काम सिद्धांतों चित्रा। AFM की बुनियादी विन्यास (मैं) में दिखाया गया है। AFM के अलावा, एक तेज टिप विद्युत बयान के माध्यम से एक ब्रैकट से जुड़ा हुआ है। Mikromasch प्लैटिनम लेपित प्रवाहकीय डीपीई (कम शोर) cantilevers इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया 210 X 30 माइक्रोन के आयामों, 80 किलोहर्ट्ज़ अनुनाद आवृत्ति, और 2.7 एन / मी के वसंत स्थिरांक था। Cantilevers आसान से निपटने के लिए अनुमति देने के लिए एक बड़ा चिप से जुड़े थे। AFM के में इकट्ठे एक बार, एक लेजर ब्रैकट टिप पर गठबंधन किया है। Cantil में Deflectionsकभी टिप एक photodiode के माध्यम से पता चला रहे हैं। Deflections स्थलाकृतिक छवियों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। (द्वितीय, ए, बी, सी) KPFM का काम सिद्धांत से पता चलता है। ब्रैकट घटित करने के लिए बिजली के संपर्क के लिए अनुमति देने के लिए सतह के करीब पर्याप्त लाया जाता है। टिप और सतह के बीच सतह क्षमता में अंतर टिप से ध्यान हटाने के लिए कारण। एक डीसी वोल्टेज इस विक्षेपन के लिए सही करने के लिए लागू किया जाता है। यह डीसी लागू वोल्टेज सब्सट्रेट सतह से सतह क्षमता के बराबर है। इस्तेमाल किया इमेजिंग मोड के प्रकार पर निर्भर करता है (लिफ्ट, AM, एफएम), इस काम सिद्धांत से थोड़ा अलग है। चित्रा 1 (द्वितीय) 15 से संशोधित किया गया है।

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि स्थलाकृति और पाली एल Lysine Functionalized स्टेनलेस स्टील और सोने substrates पर MRSA के संभावित नक्शे सतह। छवियाँ (मैं और तृतीय) प्रतिनिधि स्थलाकृति छवियों को दिखाने क्रमश: स्टेनलेस स्टील और सोना सतहों पर मरसा कोशिकाओं की। छवि आयाम एक इसी रंग का ऊंचाई प्रोफ़ाइल के साथ इन चित्रों के एक्स और वाई अक्ष में देखा जा सकता है। (द्वितीय और चतुर्थ) उनके संबंधित सतहों पर मरसा की इसी सपा नक्शे दिखा। स्टैंडर्ड 'सोना' रंग फिल्टर थर्मल फिल्टर और अधिक आसानी से सपा में छोटे परिवर्तन विचार करने के लिए छवियों को सपा के लिए लागू किया गया है, जबकि छवियों स्थलाकृति के लिए लागू किया गया था। यह सब्सट्रेट सतहों सपा समरूप नहीं था कि ध्यान दिया जाना चाहिए। सपा विभिन्नतापूर्वक दोनों सब्सट्रेट सतहों पर स्पष्ट सकारात्मक और नकारात्मक क्षेत्रों के साथ वितरित किया जाना पाया गया। इस विषम एसपी स्टेनलेस स्टील और सोने substrates पर मनाया जाता है, जहां मरसा कोशिकाओं के आसपास देखा जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

52,327 / 52327fig3highres.jpg "/>
सब्सट्रेट सतहों और मरसा सेलुलर झिल्ली की चित्रा 3. सतह संभावित। 3 चित्रा 15 कोशिकाओं से इसी KPFM स्टेनलेस (एस एस के रूप में यहाँ लेबल) स्टील और सोने की सतहों से डेटा, साथ ही, डेटा से पता चलता है। तारक तुलना में नमूने के लिए इसी तारक की संख्या के साथ नमूनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का प्रतिनिधित्व करते हैं। मरसा डेटा ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद Functionalized सतहों से जुड़ी कोशिकाओं से एकत्र किया गया था। इस वजह से कोई कोशिकाओं को तीन घंटे के बाद नंगे सब्सट्रेट सतहों को देते पाए गए तथ्य यह है कि करने के लिए किया गया था।

चित्रा 4
पाली एल Lysine Functionalized स्टेनलेस स्टील पर मरसा चित्रा 4. कदम ऊंचाई सतह संभावित छवि। पोस्ट-इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, एक कदम ऊंचाई ग्राफ capabili दिखाने के क्रम में उत्पन्न किया गयासॉफ्टवेयर के संबंधों, और साथ ही, सब्सट्रेट सतह और कोशिका झिल्ली के बीच सपा में उल्लेखनीय अंतर। चुना पार के अनुभागीय क्षेत्र ग्रे लाइन के साथ इसी सपा के नक्शे पर प्रतिनिधित्व किया है। सब्सट्रेट सतह पर 0.21 वी कोशिका की सतह पर 0.15 वी से एक बदलाव स्पष्ट रूप से स्पष्ट है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कंपनी जांच के प्रकार लगातार वसंत (एन / एम) गुंजयमान आवृत्ति (KHz) ब्रैकट आयाम एपेक्स व्यास टिप
शरण रिसर्च AC240TM-R3 2 70 लंबाई = 240 माइक्रोन
चौड़ाई = 40 माइक्रोन </ टीडी> 		28 एनएम
Bruker AFM जांच एससीएम-पिट 2.8 75 लंबाई = 225 माइक्रोन
चौड़ाई = 28 माइक्रोन 		20 एनएम
Mikromasch प्रवाहकीय डीपीई (कम शोर) cantilevers 2.7 80 लंबाई = 210 माइक्रोन
चौड़ाई = 30 माइक्रोन 		40 एनएम
नैनो और अधिक संयुक्त राज्य अमेरिका PTSI-एनसीएच 42 330 लंबाई = 125 माइक्रोन
चौड़ाई = 30 माइक्रोन 		> 25 एनएम
नेनौसाइंस उपकरण AppNano प्रवाहकीय दोहन मोड AFM जांच। 40 300 लंबाई = 125 माइक्रोन
चौड़ाई = 35 माइक्रोन 		30 एनएम
नेनौसाइंस उपकरण AppNano प्रवाहकीय दोहन मोड AFM जांच। 40 300 लंबाई = 125 माइक्रोन
चौड़ाई = 35 माइक्रोन

KPFM जांच की एक विस्तृत श्रृंखला की पेशकश तालिका 1. कंपनियां। कंपनियों की एक किस्म अब बदलती टिप सुप्रीम व्यास, वसंत स्थिरांक, और गुंजयमान आवृत्तियों के साथ KPFM टिप प्रदान करते हैं। टिप अनुकूलन कंपनियां आम तौर पर एक उद्देश्य के प्रयोग के लिए कस्टम विनिर्देशों के साथ cantilevers का निर्माण करने की पेशकश के साथ, असीम के पास है। अधिकांश KPFM जांच प्लैटिनम लेपित सिलिकॉन नाइट्राइड रहे हैं। प्लेटिनम ब्रैकट के लिए प्रवाहकीय कार्यक्षमता प्रदान करता है। अन्य आम कोटिंग सामग्री Iridium, प्लेटिनम + Iridium, और सोने में शामिल हैं। अधिकांश KPFM सुझावों को भी वैकल्पिक रूप से बिजली के बल माइक्रोस्कोपी (EFM) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। टिप सुप्रीम KPFM cantilevers के लिए महत्वपूर्ण है। बड़ा व्यास सुझावों कम बिजली के शोर के लिए उच्च संकल्प स्थलाकृति इमेजिंग बलिदान। इसके विपरीत, छोटे व्यास सुझावों (<25 एनएम) प्रस्ताव स्थलाकृति छवि संकल्प में सुधार हुआ है, लेकिन बिजली के शोर से ग्रस्त हैं। इस अध्ययन के लिए शोधकर्ताओं Mikromasch आचरण इस्तेमाल कियाIve डीपीई (कम शोर) cantilevers।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

KPFM सतह विद्युत डेटा प्राप्त करने के लिए एक उपन्यास तकनीक के रूप में नियुक्त किया गया था। यह आमतौर पर रसायन शास्त्र में प्रभारी वितरण की जांच के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया गया है और हाल ही में माइक्रो और नैनो तराजू पर जैविक प्रणालियों के अध्ययन के लिए लागू किया जाना शुरू हो गया है। एकत्र आंकड़ों से हम रोगाणुओं आसानी से भी स्थिर ऊष्मायन के तीन घंटे के बाद, स्टेनलेस स्टील और सोना सतहों को साफ करने के लिए संलग्न करने के लिए प्रकट नहीं किया था कि पाया। पाली एल Lysine Functionalized सतहों 30 मिनट के बाद तेजी से माइक्रोबियल लगाव दिखाया। Functionalized सतहों पर रोगाणुओं की लंबी ऊष्मायन बार नमूना सतहों, और गरीब स्थलाकृति छवियों पर भीड़भाड़ सेल करने के लिए नेतृत्व किया। सतह functionalization स्टेनलेस स्टील और सोना सतहों के लिए सकारात्मक सपा को नकारात्मक सपा से एक बदलाव के लिए नेतृत्व किया। पिछले अध्ययनों सूक्ष्मजीवों आम तौर पर आसमाटिक और आयनिक संतुलन 23 बनाए रखने की वजह से कोशिकाओं के चारों ओर नकारात्मक आयनों का आरोप लगाया sequestering को नकारात्मक एसपीएस है कि पता चला है। यह भी जाना जाता हैग्राम ग्राम सकारात्मक सूक्ष्मजीवों में नकारात्मक सूक्ष्मजीवों और teichoic एसिड में फॉस्फेट समूहों की उपस्थिति के आगे नकारात्मक एसपी 24 के गठन की ओर जाता है। ग्राम सकारात्मक और नकारात्मक कोशिका झिल्ली के बुनियादी रसायन शास्त्र का ज्ञान सकारात्मक सब्सट्रेट एसपी तेजी माइक्रोबियल लगाव के लिए नेतृत्व करेंगे कि कल्पना करने के लिए हमें का नेतृत्व किया। स्टेनलेस स्टील और सोने substrates पर नकारात्मक मरसा सेल एसपी को सकारात्मक से एक बड़ी पारी में क्रमश: वहाँ था कि, 4 - हालांकि, के रूप में आंकड़े 2 में देखा जा सकता है। माइक्रोबियल लगाव शुरू में झिल्ली के आसपास नकारात्मक आयनों की ज़ब्ती से हुआ हो सकता था। कोशिकाओं को धोने और सब्सट्रेट सतहों पर उन्हें सूखी दे पर, हम इस आयनिक मीडिया दूर धोने जा सकता था। इसके अलावा, यह KPFM डेटा ग्राम सकारात्मक (मरसा) कोशिकाओं की बाहरी कोशिका दीवार क्षेत्रों में से केवल समावेशी है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। यह एक सूक्ष्म जीवाणुओं कोशिका झिल्ली संभावित catio की उपस्थिति पर बदल सकता है कि कुछ मामलों में दिखाया गया हैएनआईसी रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स या अन्य तनाव 8।

माइक्रोबियल सेल संस्कृतियों पर मानक जीटा संभावित माप की तुलना में KPFM का एक मुख्य नुकसान KPFM में एकत्र आंकड़ों मर चुका है और सूखे की कोशिकाओं पर किया जाता है। KPFM अलग लगाव सब्सट्रेट सतहों के संबंध के साथ कोशिका की सतह संभावित पाली में सामान्य प्रवृत्तियों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। डीसी के आवेदन ब्रैकट टिप करने के लिए voltages एक प्रवाहकीय नमूना की सतह की आवश्यकता के साथ-साथ, (एफ तों प्रतिक्रिया करने के लिए), खुली हवा में करने के लिए इमेजिंग मानक KPFM सीमा। ध्रुवीय तरल में इमेजिंग मानक KPFM के साथ वर्तमान में संभव नहीं है, और इस तरह KPFM का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं की इमेजिंग अभी तक संभव के रूप में नहीं है। नए खुले पाश और दोहरी आवृत्ति KPFM मोड की घटनाओं में कम-आयनिक समाधान 18-20 में छवि सतहों करने की क्षमता में वादा दिखाया है। ऐसा लगता है कि इमेजिंग लिव पर किया जा सकता है ताकि भविष्य में इस तकनीक के आगे विकसित की है कि हमारी आशा हैई सेल संस्कृतियों। एक और अधिक प्राकृतिक वातावरण में कोशिकाओं की इमेजिंग निस्संदेह अधिक सटीक और यथार्थवादी कोशिका झिल्ली सपा डेटा की पीढ़ी के लिए नेतृत्व करेंगे। इस अध्ययन के लिए हम माइक्रोबियल कोशिका झिल्ली क्षमता को मापने के लिए, साथ ही एक चिकित्सकीय प्रासंगिक सतह पर MRSA के आसंजन विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास रास्ते में इस तकनीक को लागू करना चाहता था। माइक्रोबियल झिल्ली एसपी में परिवर्तन विभिन्न सब्सट्रेट सतहों पर ऊष्मायन पर मनाया गया। इसका अर्थ है कि सब्सट्रेट प्रकार सेलुलर चयापचय को प्रभावित कर सकता संकेत हो सकता है। हमारी आशा है कि इस प्रारंभिक आंकड़ों माइक्रोबियल लगाव को रोकने के क्रम में (जैसे पट्टियाँ और Gauzes रूप में अन्य सामग्री सहित) चिकित्सा सतहों या उपकरणों के लिए लागू किया जा सकता है कि निहित विद्युत शुल्क के साथ नैनो कोटिंग्स की पीढ़ी को जन्म दे सकती है। इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं KPFM के सिद्धांतों और इसे मापने के लिए और सपा नक्शे बनाने के लिए लागू किया जा सकता है जिसमें शो के तरीके को समझने में मदद करने का इरादा है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5500ILM Atomic Force Microscope Agilent Technologies #N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs TED PELLA, INC. #16219 Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes Mikromasch #HQ:DPE-XSC11 There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs TED PELLA, INC. #16218-G Gold sample discs
PicoView Software Agilent Technologies #N9797B 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic) Agilent Technologies #N9797AU-1FP 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge Thomas Scientific #91201513 Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood BD #221261 Pre-made plates
Tryptic Soy Broth BD #257107 Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
  2. Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
  3. Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
  4. Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
  5. Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
  6. Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
  7. Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
  8. Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
  9. Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
  10. Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
  11. Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
  12. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
  13. Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
  14. Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
  15. Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
  16. Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
  17. Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
  18. Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
  19. Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
  20. Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
  21. Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
  22. Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
  23. Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
  24. Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
  25. Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
  26. Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).

Tags

बायोइन्जिनियरिंग अंक 93 केल्विन जांच बल माइक्रोस्कोपी परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी सतह संभावित स्टेनलेस स्टील माइक्रोबियल लगाव बैक्टीरियल biofilms मेथिसिलिन प्रतिरोधी
केल्विन जांच बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग बैक्टीरिया की सतह संभावित मापन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Birkenhauer, E., Neethirajan, S.… More

Birkenhauer, E., Neethirajan, S. Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy. J. Vis. Exp. (93), e52327, doi:10.3791/52327 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter