Abstract
Potencial de superfície é uma característica física geralmente negligenciado que desempenha um papel dominante na adesão de microorganismos para substrato superfícies. Microscopia de força sonda Kelvin (KPFM) é um módulo de microscopia de força atômica (AFM), que mede a diferença de potencial entre as superfícies de contato na escala nano. A combinação de KPFM com a AFM permite a produção simultânea de potencial de superfície e mapas topográficos de amostras biológicas, tais como células bacterianas. Aqui, nós empregamos KPFM para examinar os efeitos do potencial de superfície sobre a adesão microbiana em superfícies medicamente relevantes, tais como aço inoxidável e ouro. Mapas de potencial de superfície revelou diferenças de potencial de superfície para membranas microbianas em diferentes substratos de materiais. Um gráfico passo-a altura foi gerado para mostrar a diferença de potencial na superfície uma área de fronteira entre a superfície do substrato e microrganismos. Alterações no potencial de membrana da superfície celular têm sido relacionados com a mudanças no metabolismo celular e a motilidade. Portanto, KPFM representa uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para examinar as alterações da superfície microbiana potencial de membrana sobre a adesão a várias superfícies do substrato. Neste estudo, nós demonstramos o procedimento para caracterizar o potencial de superfície de células de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina USA100 individuais em aço inoxidável e ouro usando KPFM.
Introduction
Os biofilmes produzidos nas superfícies dos equipamentos e em feridas cutâneas apresentam um problema para a indústria médica como biofilmes são recalcitrantes à remoção e pode levar a um aumento das taxas de transmissão da doença e resistência aos antimicrobianos. Anexo é o primeiro passo na formação de biofilme e é a etapa mais crítica, devido à sua reversibilidade 1-3. Características de superfície do substrato desempenham um papel crucial na adesão microbiana. Factores tais como a dureza da superfície, a porosidade, rugosidade, hidrofobicidade e têm sido mostrados para efectuar a adesão microbiana; No entanto, pouca investigação examinar o potencial papel da superfície do substrato (SP) na adesão microbiana tem sido feito 4,5. Superfícies carregadas negativamente impedir a penhora de esporos de Bacillus thuringiensis a mica, silício e ouro 6. Alterações no potencial da membrana celular são indicativos de alterações na adesão celular e a motilidade 5,7. Tem sido observado que hom electricamentesuperfícies ogeneous mais facilmente promover a adesão microbiana 5. Caracterizar o potencial de superfície de bactérias à escala nanométrica pode proporcionar uma nova maneira de entender a cinética de adesão de bactérias a superfícies diferentes, e assim pode ajudar no desenvolvimento de estratégias anti-incrustação biológica. Ao contrário de outros métodos utilizados para caracterizar a cinética electro de bactérias, como eletroforética espalhamento de luz, o potencial zeta, e determinação do ponto isoelétrico, microscopia de força sonda Kelvin (KPFM) permite a análise de células individuais em vez de culturas inteiras 11/08. Isso é benéfico quando se quer comparar célula-célula ou biofilme características elétricas com alta precisão e exatidão.
KPFM é um módulo de microscopia de força atômica (AFM). AFM foi desenvolvido como um resultado direto do microscópio de tunelamento (STM) 12. As imagens publicadas pela primeira vez usando STM foram feitas por Gerd Binnig e Heinrich Rorhrer em 1982 12 12 animado. STM também pode ser feito de líquidos usando pontas de prova especializados 13. Isto foi demonstrado por Lindsay et ai., Que utilizado STM e AFM para moléculas de ADN da imagem em 10 mM de HClO 4 e na água, em eléctrodos de ouro 13. KPFM foi demonstrada na determinação dos potenciais de superfície de análise de DNA e proteína de 25 e biomoléculas interacção com ligandos 26.
KPFM opera através da medição da diferença de potencial contacto (CPD), entre uma ponta cantilever condutor e uma amostra de AFM idealmente condutor (Figura 1, i) 14,15. As amostras não têm necessariamente de ser condutora (ie, sampl biológicaes). A imagiologia pode ser realizado em mica, vidro e superfícies de silício (não condutores), desde que a superfície não condutiva é fina e tem um material condutor subjacente 6,7. O DPC é equivalente ao potencial de tensão de superfície e pode ser descrita como a diferença nas funções de trabalho entre a ponta (tip φ) e amostra (amostra φ), dividida pela carga do electrão negativo (- e). Quando uma ponta de AFM condutor é levado para perto de uma superfície da amostra (separados por uma distância d), uma força electrostática (F es) é gerado, devido à diferença nas energias de Fermi (Figura 1, ii, a) 15. Neste ponto, as energias de vácuo da ponta e amostra (E v) estão em equilíbrio e alinhados. Ao trazer a extremidade mais perto da superfície da amostra, a superfície da ponta e a amostra entrem em contacto eléctrico e agir como capacitores de placas paralelas (Figura 1, b, ii 14,15. No ponto, as energias de Fermi superfície da ponta e da amostra se alinham, atingindo um equilíbrio de estado estacionário (Figura 1, ii, b). A ponta e amostra de superfície será cobrado e um CPD V irá formar devido a uma diferença de funções E v 's e de trabalho. A F es age na área de contato elétrico devido ao CPD V formado. Esta força é subsequentemente anulada através da aplicação de um V DC externa da ponta que tem a mesma grandeza que o DPC V formado (Figura 1, ii, c). Esta tensão de CC aplicada elimina carga de superfície na área de contacto eléctrico, e a quantidade de V CC necessária para eliminar as es de F V CPD é igual à diferença nas funções de trabalho entre a sasuperfície mple e gorjeta de 15. Deve notar-se que a função de trabalho da ponta é conhecido e é fornecida pelos fabricantes. Em todos os métodos KPFM, uma tensão alternada (CA V, cerca de 100 - 500 mV) é também aplicado na ponta, a fim de gerar forças eléctricas oscilantes entre a ponta ea amostra 14. Isto proporciona uma melhor resolução ao medir mudanças na V CPD e / ou F es. Neste contexto, as alterações na frequência e amplitude de oscilação eléctrica pode ser corrigido por V DC, e mapas de potencial de superfície pode ser gerado. Os dados de áreas específicas destes mapas pode ser ainda analisada a fornecer informações elétrica sobre características topográficas específicas.
KPFM pode ser operado em três modos: (1) Modo de levantamento, o modo (2), modulação de amplitude (AM), e modulação de frequência (FM) de modo 14,16 (3). Modo de elevação foi o inc inicialarnation de KPFM. Elevador modo baseia-se num método de duas passagens em que um ponta com oscilação é arrastado através da superfície para se obter uma imagem topográfica. Para o segundo passe a ponta é levantada uma distância pré-definida acima da amostra (10-100 nm) e digitalizada para o outro lado da mesma área. Devido a este método de duas passagens, o modo de elevador, em comparação com AM- e FM-KPFM, leva mais tempo para aquisição de imagem. Aumentando a ponta para fora da superfície garante que apenas longo alcance F es é medido. Além disso, conversas cruzadas entre topografia e medições de superfície potenciais é desacoplada à custa do aumento da resolução lateral e sensibilidade.
AM-KPFM melhora a resolução lateral e sensibilidade usando dual-frequências para medir simultaneamente topografia da amostra e potencial de superfície (varredura de uma passagem) 14. No modo de AM, o braço de suporte é oscilado mecanicamente, geralmente 5% abaixo da sua primeira frequência de ressonância (f 0), e electricamente oscilado (through um AC V) em sua segunda frequência de ressonância (f 1). Mudanças na amplitude de f 0, para a geração de dados topográficos, enquanto as mudanças na amplitude de f 1, devido a mudanças na F es e V CPD, fornecer dados de medição do potencial de superfície. f 0 e f 1 do cantilever são separados por freqüências e energias significativas que sinalizam cross-talk é minimizado 14. A caixa eletrônica de cabeça (HEB) da AFM separa os dois sinais para dar tanto topográfico e de superfície de dados potenciais simultaneamente em uma varredura. FM-KPFM melhora a resolução ainda mais longe do AM-KPFM em superfícies biológicas 14. FM-KPFM funciona de forma diferente do que o AM-KPFM no que mede a evolução gradientes força eletrostática, em vez de força eletrostática (F es) 15. Como modo de AM, FM utiliza modo dual-frequências e um singlmecanismo de varredura de e-pass para obter topográfico e de superfície de dados potenciais simultaneamente 14. No modo FM, o cantilever é mecanicamente oscilaram em torno de f 0 e eletricamente oscilou em uma freqüência modificado baixo (f mod, tipicamente 1-5 kHz). Após interações eletrostáticas, f 0 e f mix mod para produzir faixas laterais de f 0 ± f mod. Estas bandas laterais são muito sensíveis às mudanças na força electrostática, e pode ser separado a partir de f 0 HEB através da AFM. Desde FM-KPFM mede as alterações em gradientes de força electrostática, o dicas forma ápice e sua manutenção / integridade desempenhar um papel crítico na superfície global potencial resolução 14, 15. Superfície potencial resolução com AM e modos de FM estão na gama de 1 nm, 14 lateralmente -16. Deve notar-se que KPFM imagiologia pode ser feito em líquidos não polares, e, mais recentemente, tem sido mostrado para ser feito em (<10 mM) líquidos polares de baixo iónico (emKPFM modos de malha aberta, que não requerem uma reacção de polarização, obviando a aplicação de uma polarização DC), tais como água MilliQ; no entanto, KPFM imaging ainda tem de ser feito em células vivas em soluções polares 17-20. Desafios adicionais associados com SP imaging em líquido é que as soluções comumente usado para manutenção de células (ou seja, tampão fosfato salino) têm altas concentrações de íons móveis, o que levaria a reações faradaica, dinâmica de carga induzida por viés e difusão do íon / redistribuição 20. Assim, para esta experiência, as medidas foram tomadas a partir de células secas por MRSA e mortos em superfícies em aço inoxidável funcionalizadas com poli-L-lisina de aço e ouro sob condições ambientes. A imagiologia pode ser realizado em condições de ar ou de vácuo, em amostras biológicas que foram previamente secos ou imobilizados em superfícies 20. Condições de umidade também foram mostrados para afetar imagem KPFM de superfícies 6.
Neste estudo, foram empregados FM-KPFMe AFM para examinar o papel de SP sobre a penhora de resistente à meticilina Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) para superfícies de aço inoxidável e ouro funcionalizadas poli-L-lisina. MRSA foi recentemente ganhou status como um multi-resistente (MDR) "superbactéria", devido à sua resistência selecionados naturalmente a muitos antibióticos β-lactâmicos e cefalosporinas 21. Infecções MRSA são agora mais desafiadora, difícil e formidável de tratar, que conduz à utilização de agentes antimicrobianos mais duras, tais como a vancomicina ou oxazolidinonas que possuem níveis mais elevados de toxicidade em seres humanos e, portanto, não podem ser utilizados como tratamentos de longo prazo 22. O aço inoxidável foi escolhida devido à sua relevância médica e uso comum como um material em agulhas hipodérmicas, comadres, maçanetas, pias, etc. O ouro foi usado como um metal comparativa. FM-KPFM foi utilizado para examinar se microbiana membrana SP muda mediante adesão aos substratos.
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Protocol
1. Preparação de material de vidro e Culturas
- Antes de prosseguir com esta experiência, preparar agar sangue 5% de ovelha (SBA) placas para o cultivo de MRSA. Incubar as placas SBA durante 24 horas à temperatura de 37 ° C. Após este tempo,, colónias individuais bem isoladas deve estar presente para ser utilizado para as inoculações subsequentes em meios líquidos. Loja estrias SBA placas com colónias isoladas a 4 ° C durante 1 - 2 meses.
NOTA: placas de agar de sangue de ovelha-se em embalagens contendo pré-fabricados entre 20-25 placas com base no fabricante, e consistem tipicamente numa base de agar de tripticase de soja com adição de 5% w / v de sangue de ovelha. - Adicione 500 ml de caldo de soja tríptica (TSB) suplementada com 1% de glucose e 0,1% de NaCl. Depois disso, recolher e limpar 2 tubos de ensaio de vidro. Se tampas autoclaváveis não estão disponíveis para tubos de ensaio, use uma folha de alumínio como uma tampa. Autoclave TSB e tubos de ensaio, juntamente com uma caixa de 1 ml pontas de pipeta.
- Debaixo de uma cabine de segurança biológica ou perto de uma Bunsen queimador, pipeta de 5 ml de previamente autoclavada TSB em tubos de ensaio autoclavado. Ter cuidado para garantir que o tempo suficiente tenha sido dada para permitir que o TSB e tubos de ensaio arrefecer até à temperatura ambiente. A partir de uma placa de 5% SBA anteriormente listado, inocular uma única colônia em 6 ml de caldo TSB. Uma vai conter MRSA, e o segundo tubo de ensaio será utilizado como um controlo negativo para assegurar a esterilidade.
- Tome tubos de ensaio TSB inoculados e colocá-los numa incubadora recíproco durante 24 horas a 37 ° C e a 200 rpm. Após este tempo, o crescimento microbiano deve ser aparente no tubo de ensaio, enquanto não houve crescimento de MRSA deve ter ocorrido no tubo de ensaio de controlo.
- Tome 1 ml de cultura de 24 horas e pipeta em 6 ml de TSB fresco. Incubar a 37 ° C durante 6 horas a 200 rpm.
- Pipetar 1 mL de 6 horas de sub-cultura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar durante 3 min a 850 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de H 2 O. desionizada Centrífuga, repito, e suspender novamente.
- Tome aço inoxidável e discos de amostra de AFM ouro (20 mm e 10 mm de diâmetro, respectivamente) e limpar cada um dos lados com 5 ml de H 2 O. desionizada Segurar discos de amostra no lado dominante com uma pinça e usar a mão para subdominant pipeta de 5 ml de cada lado do disco de amostra. Depois de lavar ambos os lados, discos lugar amostra num copo contendo 20 ml de H2O desionizada, seguido por sonicação durante 1 minuto.
- Após utilização de sonicação fórceps para remover os discos da amostra a partir do copo. Coloque os discos de modo que eles se inclinar em um ângulo de 60 ° contra a borda de uma placa de Petri aberta em uma toalha de papel. Utilizar a tampa da placa de Petri para cobrir os discos de secagem. Deixe secar totalmente os discos antes de prosseguir. O tempo de secagem pode variar entre 4-8 horas.
- Depois de seco, use uma pinça para colocar discos de amostra em uma placa de Petri.
- Opcionalmente, funcionalizar as superfícies dos discos com qualquer material de amostra (por exemplo, colagénio, ácido hialurônico, nano-partículas de prata, etc.).
- Para esta experiência, usar poli-L-lisina para revestir a superfície do substrato. Por poli-L-lisina funcionalização, pipeta 200-400 ul de 0,1% de poli-L-lisina (em H2O) em discos de amostras, e deixou incubar durante 1 hora à temperatura ambiente numa placa de Petri.
- Após 1 h, utilizar uma pinça para segurar o disco de amostra, e lava-se com 1 ml de H 2 O. desionizada Deixar secar em toalhas de papel, como descrito no passo 2.2.
- Tome 2x células re-suspenso lavados e placa 200-400 mL em discos de amostra dentro de uma cabine de segurança biológica. Se os discos de amostras são revestidas com poli-L-lisina, incubar durante 0,5 horas à temperatura ambiente.
- Após incubação das células em discos de amostra, lavar discos amostra suavemente com 1 ml de H 2 O. desionizada Vamos discos secar durante a noite antes de imagem.
3. KPFM Imagem
NOTA: Para esta experiência,usar um Agilent série 5500 ILM-AFM.
- Para iniciar AFM, ligue unidade de computador, juntamente com HEB e MAC III controlador da AFM. Abra o software de imagens AFM (por exemplo, da Agilent PicoView). Certifique-se de selecionar inicialmente ACAFM ou qualquer designação correta é no AFM para geração de imagens em modo intermitente-contact.
- Utilizando uma pinça AFM na mão dominante, e segurando o titular clipe de mola aberta com a mão subdominant, coloque um cantilever KPFM para a cabeça-peça. Tenha cuidado ao manusear e transferindo a peça de cabeça AFM para o AFM que esta unidade (pelo menos no 5500 ILM-AFM) contém a unidade de cristal piezo frágil que controla X, Y, Z e direcionalidades digitalização.
NOTA: As consolas KPFM utilizados neste caso foram Mikromasch condutora DPE (baixo ruído) cantilevers com frequências de ressonância média de 80 kHz e primavera constantes de 2,7 N / m. Cantilevers com estas frequências de ressonância e constantes de mola foram escolhidos devido a sua facilidade de uso.Cantilevers com maiores constantes de mola mais elevadas frequências de ressonância e também pode ser usado para imagiologia. - Arrumar com cuidado cabeça peça na AFM e ligar os fios apropriados (neste caso dois fios precisa ser conectado em: Laser e estágio motor de elevação).
- Alinhar o laser para a ponta do braço de suporte. Algumas unidades contêm uma funcionalidade que permite a câmara de alinhamento mais fácil. Se a funcionalidade da câmera não está presente no AFM, alinhar na ponta cantilever conforme descrito a seguir:
- Gire o botão no sentido horário front-to-back para mover o laser overtop o chip cantilever. Quando o laser atinge o chip será bloqueado e não será mais visível. Apenas gire o botão algumas vezes.
- Gire o botão front-to-back sentido anti-horário até o ponto de laser reaparece. O laser é agora na borda do chip.
- Gire o botão da esquerda para a direita para posicionar o laser no cantilever. Como o laser passa sobre o cantilever ele vai desaparecer e reaparecer in rápida sucessão. O ponto de laser deve ser visível na tampa de vidro fosco onde a unidade fotodiodo mais tarde irá se sentar.
- Rode o botão de front-to-back para a esquerda para mover o local para baixo o cantilever para a ponta até o local no vidro fosco desaparece.
- Vire o-to-back frente botão no sentido horário apenas ligeiramente, a fim de posicionar o laser de modo que ele só se senta na ponta cantilever. O ponto de laser irá reaparecer no vidro fosco.
NOTA: Este é o método de posicionamento a laser para consolas trampolim. Para cantilevers triangulares, o processo de alinhamento é um pouco diferente.
- Uma vez que o laser está alinhado, manter o motor na fase de elevação na posição "aberto" durante 10 segundos para assegurar espaço suficiente entre o braço de suporte e fixação da amostra quando a amostra para a AFM.
- Colocar a amostra no palco amostra KPFM. Aterrar a amostra usando um fio de cobre. Ligue os fios apropriados da AFM para o estágio da amostra. Ligue os sTage ao AFM. Na maioria dos casos, a fase é mantida no lugar através de magnetos.
- No software AFM, ajustar o braço de suporte e, em seguida, iniciar abordagem da ponta cantilever para a amostra. Certifique-se de que o tempo de estabilização é fixado em não mais do que 10 ms, e que a velocidade de aproximação não exceder 2,0 mm / s, a fim de evitar danos na ponta.
- Uma vez que a ponta cantilever é na superfície da amostra, selecione um tamanho da janela de imagem e área de imagem ideal. Otimizar ganhos I e P, juntamente com o set point cantilever assim que a imagem topográfica é otimizado.
- Depois de imagem topográfica é otimizado, ligue módulo KPFM (tanto no modo AM FM ou, aqui, use o modo FM). Deve notar-se que KPFM imagem é muito desafiante fora da janela de imagem 5 mm x 5 mm. Além disso, para a imagem latente KPFM ideal, use uma resolução de 512 x 512 com velocidades lentas de digitalização (0,02-0,05 linhas / seg).
- Para definições FM-KPFM (não ACAFM configurações), defina o percentual de carro entre 5-10%. Defina a fr cantileverequency entre 1 - 5 kHz, com uma largura de banda de 2 kHz. Definir I e ganhos P para as definições FM-KPFM a 0,3%.
- Varie a largura de banda do sinal e eu e os ganhos de P entre as superfícies de amostras. Para otimizar SP imagem, ajustar ainda mais a largura de banda do sinal e eu e os ganhos P obter imagens mais favoráveis. O intervalo recomendado de ganhos I e P são 0,22-0,35%.
- Processar e analisar as imagens coletadas KPFM usando software de processamento de pós-imagem para coletar dados SP.
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Representative Results
A capacidade de medir utilizando SP KPFM baseia-se no princípio de que tanto a superfície da amostra e o braço de suporte da ponta condutora são, em certa medida. Aço inoxidável e ouro agiu superfícies como condutores para que MRSA foram anexados. KPFM imagens foram tiradas de 15 células por MRSA em ambas as superfícies com 512 x 512 de resolução, e com as áreas de análise que variam de 5 x 5 mm a 10 x 10 mm. Varredura foi realizada com velocidades de linha que variam de 0,02 linhas / seg de 0,05 linhas / seg. Portanto, com 512 pontos de dados recolhidos por linha e 512 linhas para digitalizar, tempos de varredura variaram de 2,84 a 7,11 hr hr. Os tipos de imagens recolhidas pode ser visto na Figura 2. KPFM opera através de duas frequências, e como tal, são recolhidas imagens topográficas simultaneamente, juntamente com dados sobre as características eléctricas da superfície. Filtros térmicos foram aplicados a SP mapas, a fim de distinguir mais facilmente pequenas alterações no potencial de superfície (Figura 2). Os dados de mapas SP wcomo analisado software de processamento de pós-imagem para determinar o potencial de superfície médias e desvios-padrão. A análise estatística foi realizada por meio de programação R Open Source Estatística. Testes t Student foram realizados para comparar os grupos com P <0,05 significativo.
SP imagens foram analisadas para determinar microbiana potencial de superfície de membrana. Estes foram, em seguida, em comparação com o crescimento nas diferentes superfícies de substratos. Isto foi feito a fim de determinar se o tipo de superfície tinha um efeito sobre microbiana potencial de superfície de membrana. Inicialmente tentou-se incubar células MRSA estaticamente durante 3 horas sobre as superfícies do substrato. No entanto, não há micróbios ligados eram visíveis sob a AFM. SP dados para superfícies funcionalizadas limpo e poli-L-lisina foi determinado a partir de 5 x 5 mm áreas digitalizados. Scans SP dos substratos de aço inoxidável e ouro desencapada mostrou potencial de superfície global negativa (-0,045 ± 0,057 V e -0,126 ± 0,052 V, respectivamente, P = 0,047, Figura 3). A poli-L-lisina foi usada a fim de funcionalizar as superfícies a torná-los mais favorável para a ligação de células. Superfícies funcionalizadas mostrou uma mudança de potencial de superfície positivos das superfícies de aço inoxidável e de ouro (0,133 ± 0,063 V e 0,126 ± 0,030 V, respectivamente, Figura 3). Posteriormente, analisou os potenciais de membrana de MRSA em superfícies de aço inoxidável e ouro funcionalizadas poli-L-lisina. Verificou-se que os potenciais de membrana celular de MRSA variaram entre o aço inoxidável e superfícies de ouro. Superfícies de aço inoxidável aumentaram significativamente maiores SPs membrana positivos para as células quando comparado com o seu homólogo de ouro. Por exemplo, a SP de células MRSA comutada de positivo para negativo SPs. MRSA mostrou SP positivo em superfícies de aço inoxidável com SPs de 0,160 ± 0,022 V e SP de -0,025 ± 0,016 V em superfícies de ouro (P <0,001).
Para mostrar todos os recursos do KPFM, um exemplode um gráfico passo a altura de MRSA em aço inoxidável é fornecida (Figura 4). Isto mostra a diferença de potencial entre a superfície da superfície do substrato e a membrana microbiana.
Figura 1. Princípios de Trabalho do microscópio de força atômica (i) e força de sonda Kelvin microscópio (ii) Reproduzido com permissão do (15). A configuração básica da AFM é mostrado em (i). Em AFM, uma ponta afiada é anexado a um cantilever através da deposição eletroquímica. Foram utilizados Mikromasch DPE (baixo ruído) cantilevers condutores revestida de platina neste experimento tinha dimensões de 210 x 30 mm, freqüência de ressonância de 80 kHz, e constantes de 2,7 N / m primavera. Cantilevers foram ligadas a um chip maior, a fim de permitir a manipulação fácil. Uma vez montada na AFM, um laser é alinhado sobre a ponta do braço de suporte. Deformações o cantilponta sempre são detectados através de um fotodiodo. As deflexões são utilizados para gerar imagens topográficos. (Ii, a, b, c) mostra o princípio de funcionamento de KPFM. O braço de suporte é trazida suficientemente perto da superfície para permitir o contacto eléctrico para ocorrer. Diferenças no potencial de superfície entre a ponta ea superfície causar a ponta para desviar. Uma tensão de CC é aplicada para corrigir esta deflexão. Esta tensão de CC aplicada é igual ao potencial de superfície da superfície do substrato. Dependendo do tipo de modo de imagem utilizada (elevador, AM, FM), este princípio de funcionamento é um pouco diferente. A Figura 1 (ii) foi modificado a partir de 15.
Figura 2. representativas e topografia de superfície potenciais mapas de MRSA sobre substratos de aço inoxidável e ouro funcionalizadas com poli-L-lisina. Imagens (I e III) mostram imagens de topografia representativas células de MRSA sobre aço inoxidável e superfícies de ouro, respectivamente. Dimensões da imagem pode ser visto no eixo de estas imagens coloridas, juntamente com um perfil de altura correspondente X e Y. (Ii e iv) mostram os mapas correspondentes SP do MRSA sobre as respectivas superfícies. Filtros de cor padrão "ouro" foram aplicadas à topografia imagens enquanto filtros térmicas foram aplicados para SP imagens de discernir mais facilmente pequenas mudanças em SP. Deve notar-se que a SP de superfícies de substrato não foi homogénea. SP foi encontrado para ser distribuídos de forma heterogênea, com áreas positivas e negativas aparentes em ambas as superfícies do substrato. Isto pode ser visto em torno de células de MRSA onde SPs heterogêneos são observados em substratos de aço e ouro inoxidável. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. potencial de superfície das superfícies de substrato e membranas celulares de MRSA. A Figura 3 mostra os dados correspondentes KPFM de aço inoxidável (rotulado como aqui SS) e superfícies de ouro, assim como, os dados a partir de 15 células. Os asteriscos representam diferenças significativas entre as amostras com o número de asteriscos correspondentes para as amostras comparadas. MRSA dados foram recolhidos a partir de células ligadas às superfícies funcionalizadas após 30 min de incubação. Isto foi feito devido ao facto de não foram encontradas células ligar-se às superfícies do substrato nus após 3 h.
Figura 4. superfície Passo-altura da imagem potencial de MRSA em aço inoxidável funcionalizado poli-L-lisina. Usando o software de processamento de pós-imagem, um gráfico passo-height foi gerado, a fim de mostrar a capacidalaços de software, bem como, a diferença notável em SP entre a superfície do substrato e membrana celular. A área de secção transversal escolhida é representado no mapa SP correspondente com a linha cinza. Uma mudança de 0,15 V na superfície da célula para 0,21 V na superfície do substrato é claramente evidente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Companhia | Tipo de sonda | Constante da mola (N / m) | Freqüência de ressonância (kHz) | Cantilever Dimensões | Dica Apex Diâmetro |
| Asylum Research | AC240TM-R3 | 2 | 70 | Comprimento = 240 mm Largura = 40 um </ Td> | 28 nm |
| Bruker AFM Sondas | SCM-PIT | 2.8 | 75 | Comprimento = 225 mm Largura = 28 pm | 20 nm |
| Mikromasch | DPE (baixo ruído) Cantilevers condutoras | 2,7 | 80 | Comprimento = 210 mm Largura = 30 um | 40 nm |
| Nano and More EUA | PTSI-NCH | 42 | 330 | Comprimento = 125 mm Largura = 30 um | > 25 nm |
| Nanociência Instruments | AppNano condutoras Tapping modo AFM sondas. | 40 | 300 | Comprimento = 125 mm Largura = 35 um | 30 nm |
| Nanociência Instruments | AppNano condutoras Tapping modo AFM sondas. | 40 | 300 | Comprimento = 125 mm Largura = 35 um |
Tabela 1. As empresas que oferecem uma ampla gama de sondas KPFM. Uma variedade de empresas já oferecem ponta KPFM com variados diâmetros ponta Apex, constantes de mola e frequências de ressonância. Dica personalização está perto ilimitado, com as empresas normalmente oferece para construir cantilevers com especificações personalizadas para uma experiência a que se destinam. A maioria das sondas KPFM são de platina revestido de nitreto de silício. Platinum oferece funcionalidade condutora para o cantilever. Outros materiais de revestimento comum compreende o irídio, platina + irídio, e ouro. A maioria das dicas KPFM também podem ser utilizados alternativamente para a microscopia de força elétrica (EFM). Dica ápice é importante para consolas KPFM. Dicas de maiores diâmetros sacrificar maior resolução de imagem de topografia para menos ruído elétrico. Por outro lado, dicas de menor diâmetro (<25 nm) oferecem melhor resolução de imagem topografia mas são mais propensas a ruído elétrico. Para este estudo, os pesquisadores utilizaram conduta Mikromaschive DPE (baixo ruído) consolas.
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Discussion
KPFM foi empregado como uma nova técnica para a obtenção de dados elétricos de superfície. Ele tem sido comumente usada como um método para a análise de distribuição de carga em química e só recentemente começou a ser aplicado para o estudo de sistemas biológicos na micro e nano-escala. A partir dos dados coletados, descobrimos que os micróbios não pareceu facilmente anexar para limpar superfícies de aço inoxidável e ouro, mesmo após 3 horas de incubação estática. Superfícies funcionalizadas poli-L-lisina foi rápida adesão microbiana após 30 min. Períodos de incubação mais longos de micróbios em superfícies funcionalizadas levou a célula a superlotação nas superfícies de amostras e imagens de topografia pobres. Superfície funcionalização levou a uma mudança de SP negativo para SP positivo para superfícies de aço inoxidável e ouro. Estudos anteriores demonstraram que os microrganismos têm tipicamente SPs negativos devido ao seqüestro de íons carregados negativamente em torno de células para manter osmótica e equilíbrio iônico 23. Sabe-se tambémque a presença de grupos de fosfato em microrganismos gram negativos e ácidos teicóico em microorganismos Gram positivos mais conduz à formação de SPs negativo 24. O conhecimento da química básica de Gram membranas celulares positivo e negativo nos levou a supor que SPs substrato positivas levaria a rápida adesão microbiana. No entanto, como pode ser visto nas Figuras 2 - 4, de que houve uma grande mudança a partir de células positivas para MRSA SPs negativos sobre substratos de aço inoxidável e de ouro, respectivamente. Adesão microbiana poderia ter inicialmente ocorreu a partir do seqüestro de íons negativos ao redor da membrana. Após a lavagem das células e deixando-os secar sobre as superfícies do substrato, que poderia ter sido lavando esta mídia iônica. Além disso, deve notar-se que os dados KPFM é incluído apenas das zonas exteriores da parede celular de bactérias Gram positivo (MRSA) células. Demonstrou-se que em alguns casos um potencial de membrana celular pode alterar microorganismos mediante a presença de Catiopeptídeos antimicrobianos nic ou outros estressores 8.
A principal desvantagem de uma KPFM em comparação com as medições do potencial zeta padrão em culturas de células microbianas é que em KPFM os dados recolhidos são feitos em células mortas e secas. KPFM foi usado para examinar as tendências gerais em potenciais de superfície celular mudanças com relação a diferentes superfícies de substrato de fixação. A aplicação de tensões CC para a ponta cantilever (para neutralizar F es), juntamente com a exigência de uma superfície de amostra condutora, limitar KPFM padrão para abrir ao ar imagens. Imaging no líquido polar não é actualmente possível com KPFM padrão, e assim a imagem de células vivas utilizando KPFM não é como ainda possível. Desenvolvimentos de novo em malha aberta e modos KPFM dupla frequência mostraram a promessa em sua capacidade de superfícies de imagem em soluções de baixo iônicos 18-20. É nossa esperança que no futuro esta tecnologia é mais desenvolvidos de modo que a imagem pode ser feito em live culturas de células. A imagem latente de células em um ambiente mais natural, sem dúvida, levar à geração de dados SP membrana celular mais precisos e realistas. Para este estudo, pretende aplicar esta tecnologia de uma nova forma para medir os potenciais de membrana de células microbianas, bem como estudar as características de aderência de uma superfície em MRSA clinicamente relevante. Alterações na membrana SPs microbianas foram observadas após incubação sobre as diferentes superfícies de substratos. Isto pode implicar que o tipo de substrato pode afectar o metabolismo celular. A esperança é que estes dados preliminares pode levar à geração de nano-revestimentos com cargas eléctricas inerentes que poderiam ser aplicadas a superfícies ou equipamentos médicos (incluindo outros materiais, tais como ligaduras e compressas) a fim de impedir a fixação microbiana. O protocolo descrito no presente artigo se destina a ajudar os pesquisadores a entender os princípios de KPFM e mostrar maneiras pelas quais ele pode ser aplicado para medir e criar mapas SP.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
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