Abstract
Oberflächenpotential ist ein häufig übersehen physikalische Eigenschaft, die eine dominante Rolle bei der Adhäsion von Mikroorganismen an Substratoberflächen spielt. Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie (KPFM) ist ein Modul der Rasterkraftmikroskopie (AFM), die die Kontaktpotentialdifferenz zwischen Oberflächen im Nanoskala misst. Die Kombination KPFM mit AFM ermöglicht die gleichzeitige Erzeugung von Oberflächenpotential und topographische Karten von biologischen Proben, wie Bakterienzellen. Hier beschäftigen wir KPFM um die Auswirkungen des Oberflächenpotentials auf die mikrobielle Anhaftung an medizinisch relevanten Oberflächen wie rostfreiem Stahl und Gold zu untersuchen. Oberflächenpotential Karten zeigte Unterschiede in der Oberflächenpotential für mikrobielle Membranen auf unterschiedliche Materialuntergründen. Ein Stufenhöhen Graph wurde erzeugt, um die Differenz des Oberflächenpotentials an einer Grenzfläche zwischen der Substratoberfläche und Mikroorganismen zeigen. Änderungen der zellulären Membranoberflächenpotential haben mit Veränderungen in Verbindung gebracht wordens in den Zellstoffwechsel und Beweglichkeit. Daher stellt KPFM ein mächtiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Änderungen der mikrobiellen Zelloberflächenpotential auf Haftung auf verschiedenen Substratoberflächen zu untersuchen. In dieser Studie zeigen wir, das Verfahren um das Oberflächenpotential der einzelnen Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus USA100 Zellen auf rostfreiem Stahl und Gold mit KPFM charakterisieren.
Introduction
Biofilme auf Geräteoberflächen und in Hautwunden erzeugt ein Problem darstellen für die medizinische Industrie als Biofilme sind widerspenstig, um die Entfernung und kann zu einer erhöhten Rate der Übertragung von Krankheiten und die Antibiotikaresistenz führen. Befestigung ist der erste Schritt in der Biofilmbildung und ist der wichtigste Schritt aufgrund ihrer Reversibilität 1-3. Substratoberflächeneigenschaften spielen eine entscheidende Rolle bei mikrobiellen Anhaftung. Faktoren, wie Oberflächenhärte, Porosität, Rauhigkeit und Hydrophobie wurde gezeigt, dass die mikrobielle Anbringung zu bewirken; aber wenig Forschung Überprüfung der Rolle der Substratoberfläche Potential (SP) auf die mikrobielle Adhäsion getan wurde 4,5. Negativ geladenen Oberflächen verhindern die Anlagerung von Bacillus thuringiensis Sporen Glimmer, Silicium und Gold-6. Veränderungen der zellulären Membranpotential anzeigt, Veränderungen der zellulären Anhaftung und Motilität 5,7. Es ist, dass elektrisch hom beobachtetogeneous Oberflächen leichter zu fördern mikrobielle Adhäsion 5. Charakterisierung des Oberflächenpotentials von Bakterien im Nano einen neuen Weg, um die Haft Kinetik der Bakterien auf verschiedenen Oberflächen zu verstehen, bereitzustellen, und dadurch kann bei der Entwicklung von Anti-Biobewuchs-Strategien helfen. Im Gegensatz zu anderen Methoden zur Charakterisierung der elektro Kinetik der Bakterien, wie elektrophoretischen Lichtstreuung, Zeta-Potential und isoelektrischen Punktbestimmung verwendet wird, ermöglicht die Prüfung der Einzelzellen anstelle von ganzen Kulturen 8-11 Kelvin-Mikroskop (KPFM). Dies ist von Vorteil, wenn zu wollen Zell-Zell vergleichen oder Biofilm elektrischen Eigenschaften mit hoher Genauigkeit und Präzision.
KPFM ist ein Modul der Rasterkraftmikroskopie (AFM). AFM wurde als eine direkte Folge des Rastertunnelmikroskops (STM) 12 entwickelt. Die ersten veröffentlichten Bilder mit STM wurden von Gerd Binnig und Heinrich Rorhrer 1982 12 gemacht 12 zu verwenden. STM kann auch in Flüssigkeiten mit speziellen Sondenspitzen 13 durchgeführt werden. Dies wurde von Lindsay et al., Die STM und AFM Bild DNA-Moleküle in 10 mM HClO 4 in Wasser, auf Goldelektroden 13 verwendet, gezeigt. KPFM hat bei der Bestimmung der Oberflächenpotentiale von DNA- und Protein-Analyse 25 und Biomolekülen Interaktion mit Liganden 26 gezeigt.
KPFM arbeitet durch Messung des Kontaktpotentialdifferenz (CPD) zwischen einem leitenden AFM Cantilever-Spitze und einer ideal leitenden Probe (Abbildung 1, i) 14,15. Proben nicht notwendigerweise leitend (dh biologischen sampl seinn). Imaging kann auf Glimmer, Glas und Siliziumoberflächen (nicht leitend), solange der nicht-leitenden Oberfläche ist dünn, und es ist eine darunterliegende leitende Material 6,7 durchgeführt werden. Die CPD ist äquivalent zu der Oberflächenpotential-Spannung und kann als die Differenz der Austrittsarbeiten zwischen der Spitze (φ Spitze) und der Probe (φ Probe), dividiert durch die negativen Elektronenladung beschrieben (- e). Wenn ein AFM-Spitze in der Nähe einer Probenoberfläche gebracht (getrennt durch Entfernung d) eine elektrostatische Kraft (F s) erzeugt wird infolge des Unterschieds in Fermi Energien (1, II, a) 15. An diesem Punkt sind die Vakuum Energien der Spitze und der Probe (E v) im Gleichgewicht sind und ausgerichtet. Auf die Spitze nach näher an der Probenoberfläche, wobei die Spitze und der Probenoberfläche in elektrischen Kontakt und als Parallelplattenkondensatoren (1, II, b kommen 14,15. An der Stelle, die Fermi Energie der Spitze und der Probenoberfläche ausgerichtet werden und erreichte ein stationäres Gleichgewicht (1, II, b). Die Spitze und Probenoberfläche berechnet und eine V CPD bilden sich aufgrund einer Differenz in E v 's und Arbeitsfunktionen. A F es wirkt auf die elektrische Kontaktfläche auf Grund der gebildeten V CPD. Diese Kraft wird nachfolgend durch die Anwendung eines externen V DC bis zur Spitze, die die gleiche Größenordnung wie der gebildete V CPD hat aufgehoben (Abbildung 1, ii, c). Das angelegte Gleichspannung eliminiert Oberflächenladung im Bereich der elektrischen Kontaktierung und der Betrag V DC erforderlich, die F n der V CPD beseitigen gleich der Differenz in den Arbeitsfunktionen zwischen sample Oberfläche und Spitze 15. Es sei darauf hingewiesen, daß die Arbeitsfunktion der Spitze bekannt ist und es wird von den Herstellern zur Verfügung gestellt werden. In allen KPFM Verfahren wird eine Wechselspannung (V AC, etwa 100 - 500 mV) ist auch an der Spitze, um die oszillierenden elektrischen Kräfte zwischen der Spitze und der Probe 14 zu erzeugen. Dies ermöglicht eine bessere Auflösung bei der Messung von Veränderungen der V CPD und / oder F n. In dieser Hinsicht können Änderungen in der Frequenz oder Amplitude der elektrischen Schwingung von V DC korrigiert werden und das Oberflächenpotential Karten erzeugt werden. Daten aus bestimmten Bereichen dieser Karten können weiter analysiert werden, um elektrische Informationen über bestimmte topographische Merkmale bieten.
(1) Hub-Modus, (2) eine Amplitudenmodulation (AM) Modus, und (3) die Frequenzmodulation (FM) Modus 14,16: KPFM kann in drei Betriebsarten betrieben werden. Lift-Modus war der ursprüngliche incarnation von KPFM. Hub-Modus beruht auf einem Zwei-Durchgangs-Verfahren, in dem eine in Schwingungen versetzte Spitze wird über die Oberfläche gezogen, um ein topographisches Bild zu erhalten. Für den zweiten Durchlauf die Spitze einen vorgegebenen Abstand über der Probe erhöht (von 10 bis 100 nm) und zurück über die gleiche Fläche gescannt. Durch diese beiden Pass Verfahren, Lift-Modus, im Vergleich zu AM- und FM-KPFM dauert die längste Zeit für die Bildaufnahme. Die Anhebung der Spitze von der Oberfläche sorgt dafür, dass nur langfristige F es gemessen wird. Auch wird das Übersprechen zwischen Topographie und Oberflächenpotentialmessungen auf Kosten der erhöhten lateralen Auflösung und Empfindlichkeit entkoppelt.
AM-KPFM verbessert laterale Auflösung und Empfindlichkeit durch Verwendung von Dual-Frequenzen, um gleichzeitig die Probentopographie und Oberflächenpotential (One-Pass-Scan) 14. Im AM-Modus wird der Ausleger mechanisch oszilliert, in der Regel 5% unter dem ersten Resonanzfrequenz (f 0), und elektrisch oszilliert (turch einen V AC) an seinem zweiten Resonanzfrequenz (f 1). Änderungen in der Amplitude von f 0 führen zur Erzeugung von topographischen Daten, während die Änderungen in der Amplitude der f 1, aufgrund von Änderungen in F n und V CPD geben Oberflächenpotentialmessdaten. f 0 und f 1 des Auslegers sind durch erhebliche Frequenzen und Energien, die Übersprechen minimiert 14 Signal getrennt. Der Kopf der E-Box (HEB) der AFM trennt die zwei Signale sowohl topographische zu geben und Oberflächenpotential Daten gleichzeitig in einem Scan. FM-KPFM verbessert die Auflösung noch weiter als AM-KPFM auf biologischen Oberflächen 14. FM-KPFM funktioniert anders als AM-KPFM, dass es Veränderungen in der elektrostatischen Kraft Gradienten anstatt elektrostatische Kraft (F n) 15 misst. Wie AM-Modus nutzt UKW-Modus Dual-Frequenzen und eine singlE-Pass Scan-Mechanismus topographischen zu erhalten und das Oberflächenpotential Daten gleichzeitig 14. Im UKW-Modus, wird der Ausleger mechanisch f 0 in Schwingung versetzt und bei einer niedrigen Frequenz geändert elektrisch in Schwingung versetzt (f mod, in der Regel 1-5 kHz). Bei der elektrostatischen Wechselwirkungen, f 0 und f MOD MIX zu Seitenbändern f 0 ± f mod zu erzeugen. Diese Seitenbänder sind sehr empfindlich auf Veränderungen der elektrostatischen Kraft und kann von f 0 durch die AFM HEB getrennt werden. Da FM-KPFM misst die Entwicklung elektrostatische Kraft Abstufungen, die Spitzen Spitze Form und seine Wartung / Integrität spielen eine entscheidende Rolle in der Gesamtoberflächenpotential Auflösung 14, 15. Oberflächenpotential Auflösung mit AM- und FM-Modi sind im Bereich von 1 nm seitlich 14 -16. Es sei darauf hingewiesen, dass KPFM Bildgebung kann in unpolaren Flüssigkeiten durchgeführt werden, und in jüngerer Zeit hat sich gezeigt, in niedriger Ionen (<10 mM) polare Flüssigkeiten durchgeführt werden (in seinOpen-Loop KPFM Modi, die keine ein Vorspannungs-Rückkoppelungs, erübrigt die Anwendung einer DC-Vorspannung) wie MilliQ Wasser; jedoch KPFM Bildgebung noch auf lebende Zellen in polaren Lösungen 17-20 durchgeführt werden. Zusätzliche Herausforderungen SP Abbildungs flüssig verbunden ist, ist, dass die Lösungen üblicherweise zur Aufrechterhaltung Zellen verwendet (dh, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) haben hohe Konzentrationen an beweglichen Ionen, die Faraday-Reaktionen, Bias induzierten Ladungsdynamik und Ionendiffusion / Umverteilungs 20 führen würde. So kann dieses Experiment Messungen wurden von getrockneten und toten MRSA Zellen auf Poly-L-lysin funktionalisiertes Stahl und Gold-Oberflächen aus rostfreiem unter Umgebungsbedingungen gemacht. Imaging kann in Luft oder Vakuum an biologischen Proben, die zuvor getrocknet worden sind, oder auf Oberflächen immobilisiert 20 durchgeführt werden. Feuchten Bedingungen haben auch gezeigt, dass KPFM Bildgebung Flächen 6 beeinflussen.
In dieser Studie verwendeten wir FM-KPFMund AFM, die Rolle von SP über das Anbringen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus USA100 (MRSA), um Poly-L-lysin funktionalisiertes rostfreiem Stahl und Gold-Oberflächen zu untersuchen. MRSA kurzem erhielt Status als multiresistente (MDR) "Superbazillus" aufgrund ihrer natürlich ausgewählt Beständigkeit gegen viele β-Lactam-Antibiotika und Cephalosporine 21. MRSA-Infektionen sind heute anspruchsvoller, schwer und gewaltig zu behandeln, was zur Verwendung von härteren antimikrobielle Mittel, wie Vancomycin oder Oxazolidinone, die höhere Toxizität beim Menschen, und kann daher nicht als langfristige Behandlungen 22 verwendet werden. Edelstahl wurde wegen ihrer medizinischen Bedeutung und allgemeinem Verwendung als Material in Injektionsnadeln, Bettpfannen, Türgriffe, Waschbecken etc. Gold wurde als Vergleichs verwendete Metall gewählt. FM-KPFM wurde eingesetzt, um zu untersuchen, ob mikrobielle Membran SP ändert sich beim Anbringen an den Substraten.
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Protocol
1. Herstellung der Glasgeschirr und Kulturen
- Bevor Sie mit diesem Experiment fortfahren, bereiten Blut-Agar (SBA) 5% Schafsplatten für den Anbau von MRSA. SBA Inkubation erfolgt während 24 Stunden bei 37 ° C. Nach dieser Zeit sollte einzelne, gut isolierte Kolonien vorhanden, um die anschließende Impfungen in flüssigen Medien verwendet werden können. Speicher strichen SBA-Platten mit Einzelkolonien bei 4 ° C für 1 - 2 Monate.
HINWEIS: Schaf Blutagarplatten in vorgefertigte Pakete, die zwischen 20 kommen - 25 Platten auf der Basis der Hersteller, und bestehen typischerweise aus einer tryptischen Soja-Agar Basis mit der Zugabe von 5% w / v Schafsblut. - Stellen Sie 500 ml tryptische Sojabrühe (TSB) mit 1% Glucose und 0,1% NaCl ergänzt. Danach sammeln und reinigen 2 Probiergläser. Wenn autoklavierbarem Deckel nicht verfügbar für Reagenzgläser sind, verwenden Sie Aluminiumfolie als Deckel. Autoklav TSB und Reagenzgläsern mit einem Feld von 1 ml Pipettenspitzen.
- Unter einer Biosicherheitswerkbank oder in der Nähe eines Bunsen-Brenner, Pipette 5 ml zuvor autoklaviert TSB in autoklavierten Reagenzgläser. Achten Sie darauf, dass genügend Zeit sicherzustellen, gegeben worden ist, um die TSB lassen und Reagenzgläser auf Zimmertemperatur abkühlen. Aus einer zuvor durchzogen von 5% SBA Platte, impfen eine einzelne Kolonie in 6 ml TSB Brühe. Man wird MRSA enthalten, und das zweite Teströhrchen werden als Negativkontrolle verwendet werden, um Sterilität zu gewährleisten.
- Nehmen geimpften TSB Reagenzgläser und legen Sie sie in einer wechselseitigen Inkubator für 24 Stunden bei 37 ° C und bei 200 Umdrehungen pro Minute. Nach dieser Zeit sollte das mikrobielle Wachstum offensichtlich in der MRSA Reagenzglas, während kein Wachstum sollte sich im Kontroll Reagenzglas stattgefunden haben.
- Nehmen Sie 1 ml von 24 Stunden Kultur und Pipette in 6 ml frischem TSB. Bei 37 ° C für 6 Stunden bei 200 rpm.
- Je 1 ml einer 6 h Subkultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 3 Minuten bei 850 x g. Überstand entfernen und resuspendiere das Pellet in 1 ml entionisiertem H 2 O. Zentrifuge, zu wiederholen und erneut zu suspendieren.
- Nehmen rostfreiem Stahl und Gold AFM Probenscheiben (20 mm und 10 mm Durchmesser jeweils) und sauber auf jeder Seite mit 5 ml entionisiertem H 2 O. Halten Probenscheiben in der dominanten Hand mit einer Pinzette und verwenden Sie die Subdominante Hand, um 5 ml auf jeder Seite der Probenplatte pipettieren. Nach Waschen beider Seiten, statt Probenscheiben in ein Becherglas mit 20 ml entionisiertem H 2 O, gefolgt von Ultraschallbehandlung für 1 min.
- Nach der Beschallung Verwendung Pinzette Probenscheiben aus dem Becher zu entfernen. Platzieren der Scheiben, so dass sie lehnen an einem Winkel von 60º gegen die Kante eines offenen Petri Platte auf einem Papiertuch. Verwenden Sie den Deckel der Petrischale, um die Trockenplatten abdecken. Lassen Scheiben trocknen vollständig, bevor Sie fortfahren. 8 h - Die Trocknungszeit kann zwischen 4 variieren.
- Nach dem Trocknen verwenden Pinzette Probenscheiben in eine Petri-Schale legen.
- Optional funktionalisieren die Oberflächen der Probenscheiben mit jedem Material (zB Collagen, Hyaluronsäure, Silber-Nanopartikeln, etc.).
- Für dieses Experiment verwendet Poly-L-Lysin zur Beschichtung der Substratoberfläche. Für poly-L-Lysin-Funktionalisierung Pipetten 200-400 ul 0,1% Poly-L-Lysin (in H 2 O) auf Probeplatten und ließ inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur in einer Petrischale.
- Nach 1 Stunde verwenden Pinzette, um die Probenscheibe zu halten, und wäscht mit 1 ml entionisiertem H 2 O Trocknen lassen auf Küchenpapier, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
- Nehmen Sie 2x gewaschen resuspendierten Zellen und Platte 200-400 ul auf Probenscheiben in einem biologischen Sicherheitsschrank. Wenn Probenplatten werden mit Poly-L-Lysin beschichtet sind, inkubiert 0,5 Stunden bei Raumtemperatur.
- Nach Inkubation der Zellen auf Probeplatten, Waschprobenscheiben vorsichtig mit 1 ml entionisiertem H 2 O. Lassen Platten über Nacht trocknen, bevor Bildgebung.
3. KPFM Imaging
HINWEIS: Für dieses Experimentverwenden Sie ein Agilent 5500 Serie ILM-AFM.
- So starten AFM, schalten Sie Rechnereinheit zusammen mit der AFM HEB und MAC-III-Controller. Öffnen AFM-Imaging-Software (zB Agilent PicoView). Achten Sie darauf, wählen Sie zunächst ACAFM oder welcher Wert korrekte Bezeichnung ist auf der AFM für die Bildgebung im intermittierenden Kontaktmodus.
- Mit AFM Pinzette in der dominanten Hand, halten Sie die gefederte Clip-Halter mit der Subdominante Hand öffnen, setzen Sie ein KPFM Freischwinger in den Kopfstück. Vorsicht beim Umgang mit und die Übertragung der AFM Kopfstück an die AFM, wie dieses Gerät (zumindest auf der ILM 5500-AFM) enthält die fragile Piezokristall Einheit, X, Y, und Z-Scanning Ausrichtungen steuert.
HINWEIS: Die KPFM Auslegern in diesem Fall verwendet wurden, waren Mikromasch leitfähigen DPE (geräuscharm) Auskragungen mit durchschnittlichen Resonanzfrequenzen von 80 kHz und die Federkonstanten von 2,7 N / m. Ausleger mit diesen Resonanzfrequenzen und Federkonstanten wurden aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit ausgewählt.Ausleger mit größeren Federkonstanten und höhere Resonanzfrequenzen können auch für die Bildgebung verwendet werden. - Kopfstück vorsichtig laden in die AFM und schließen Sie die entsprechenden Leitungen (in diesem Fall zwei Leitungen müssen angeschlossen werden: Laserlicht und Bühnenliftmotor).
- Richten Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers. Einige Geräte enthalten eine Kamera-Funktionalität, die für eine einfachere Ausrichtung ermöglicht. Wenn Kamera-Funktionalität ist nicht auf AFM Derzeit richten auf die Cantileverspitze wie beschrieben weiter:
- Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf im Uhrzeigersinn, um den Laser überragen Cantilever-Chip zu bewegen. Wenn der Laser den Chip erreicht sie blockiert und nicht mehr sichtbar sein. Nur Drehe ihn ein paar mal.
- Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf gegen den Uhrzeigersinn, bis der Laserpunkt erscheint wieder. Der Laser ist jetzt auf die Chiprand.
- Drehen Sie den links-nach-rechts-Knopf, um den Laser auf den Ausleger zu positionieren. Da der Laser über den Ausleger gibt sie wird verschwinden und wieder erscheinen in schneller Folge. Der Laserpunkt sollte in der Milchglasabdeckung, wo der Photodiode Einheit wird später sitzen sichtbar sein.
- Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf gegen den Uhrzeigersinn, um den Ort auf der Cantilever zur Spitze hin bewegen, bis der Punkt auf dem Milchglas verschwindet.
- Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf im Uhrzeigersinn nur leicht, um den Laser so zu positionieren, dass es sitzt nur auf der Cantilever-Spitze. Der Laserpunkt wird auf dem Milchglas wieder.
HINWEIS: Dies ist die Laser-Positionierung Methode zur Sprungbrett Ausleger. Für Dreiecksauslegern unterscheidet sich der Angleichungsprozess leicht.
- Nachdem der Laser ausgerichtet ist, halten Sie die Bühne Hubmotor in der Position "offen" für 10 Sekunden, um ausreichend Platz zwischen dem Cantilever und Probe zu gewährleisten, wenn die Befestigung der Probe auf die AFM.
- Zeigen Probe auf dem Probentisch KPFM. Erden Sie die Probe mit einem Kupferdraht. Schließen Sie die entsprechenden Kabel von der AFM auf dem Probentisch. Schließen Sie die sTage an die AFM. In den meisten Fällen ist die Bühne mit Hilfe von Magneten an Ort und Stelle gehalten.
- In der AFM-Software, Melodie beginnt der Ausleger und Ansatz des Auslegerspitze auf die Probe. Stellen Sie sicher, dass die Einschwingzeit bei nicht mehr als 10 ms eingestellt, und dass die Annäherungsgeschwindigkeit nicht 2,0 um / s, um Schäden zu vermeiden Spitze überschreiten.
- Sobald die Cantileverspitze ist auf der Probenoberfläche, wählen Sie eine Bildfenstergröße und ideal Imaging-Bereich. Optimieren I und P Gewinnen zusammen mit dem Ausleger-Sollwert, so dass topographische Abbildung wird optimiert.
- Sobald topographischen Bild optimiert ist, schalten Sie KPFM Modul (UKW- oder AM-Modus, hier verwenden UKW-Modus). Es sei darauf hingewiesen, dass KPFM Bildgebung ist sehr anspruchs außerhalb von 5 & mgr; m × 5 & mgr; m-Abbildungsfenster werden. Auch für eine optimale KPFM Imaging, verwenden Sie eine Auflösung von 512 x 512 mit langsamen Scan-Geschwindigkeiten (0,02-0,05 Zeilen / sec).
- Für FM-KPFM Einstellungen (nicht ACAFM Einstellungen) Legen Sie das Laufwerk Prozent zwischen 5-10%. Stellen Sie den Ausleger frequency zwischen 1-5 kHz mit einer Bandbreite von 2 kHz. I und P Gewinne für die FM-KPFM Einstellungen auf 0,3%.
- Vary Signalbandbreite und I- und P-Gewinne zwischen Probenoberflächen. SP-Bildgebung zu optimieren, weiter anpassen Signalbandbreite und I- und P-Gewinne um optimale Bilder zu erhalten. Der empfohlene Bereich von I und P Gewinne von 0,22 bis 0,35%.
- Verarbeiten und zu analysieren mit post-Bildverarbeitungs-Software, um Daten zu sammeln SP gesammelt KPFM Bilder.
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Representative Results
Die Fähigkeit, SP zu messen mit KPFM beruht auf dem Prinzip, dass sowohl die Probenoberfläche und Cantileverspitze leitend zu einem gewissen Grad. Edelstahl und Gold diente als leitende Oberflächen, auf die MRSA wurden angebracht. KPFM Bilder wurden von 15 MRSA-Zellen auf beiden Oberflächen mit 512 x 512 Auflösungen mit Scanbereiche im Bereich von 5 x 5 & mgr; m bis 10 x 10 & mgr; m genommen, und. Abtasten erfolgte mit Liniengeschwindigkeiten im Bereich von 0,02 Zeilen / Sekunde auf 0,05 Zeilen / Sekunde durchgeführt. Daher mit 512 Datenpunkte pro Zeile und 512 Zeilen zu scannen gesammelt, reichten Scanzeiten von 2.84 h bis 7.11 h. Die Arten der gesammelten Bilder können in 2 gesehen werden kann. KPFM arbeitet mit dualen Frequenzen, und als solche, topographische Bilder werden gleichzeitig zusammen mit den Daten über die elektrischen Eigenschaften der Oberfläche gesammelt. Thermische Filter wurden angewendet, um Karten, um leichter zu erkennen kleine Änderungen in der Oberflächenpotential (2) SP. Daten aus SP Karten wso analysiert postBildVerarbeitungs-Software, um durchschnittliche Oberflächenpotentiale und Standardabweichungen zu bestimmen. Die statistische Auswertung erfolgte mit R Open Source Statistische Programm. Student-t-Tests durchgeführt wurden, um Gruppen mit P <0,05 vergleichen ist als signifikant angesehen.
SP-Bilder wurden analysiert, um die mikrobiellen Zelloberflächenpotential zu bestimmen. Diese wurden dann verglichen mit dem Wachstum auf den verschiedenen Substratoberflächen. Dies wurde, um festzustellen, ob Oberflächentyp einen Effekt auf die mikrobielle Membran Oberflächenpotential durchgeführt. Zunächst versuchten wir, MRSA-Zellen für 3 Stunden auf den Substratoberflächen statisch inkubiert. Es wurden jedoch keine befestigt Mikroben unter dem AFM sichtbar. SP-Daten für saubere und Poly-L-Lysin-funktionalisierte Oberflächen wurde aus 5 x 5 um abgetasteten Bereiche bestimmt. SP-Scans der blanken Edelstahl und blanken Goldsubstraten zeigten insgesamt negativen Oberflächenpotentiale (-0,045 ± 0,057 V und -0,126 ± 0,052 V bzw., P = 0,047, Figur 3). Poly-L-Lysin wurde verwendet, um die Oberflächen zu funktionalisieren sie günstiger für die Zellbindung zu machen. Funktionalisierte Oberflächen zeigten eine Verschiebung der positiven Oberflächenpotentiale für Edelstahl und Gold-Oberflächen (0,133 ± 0,063 V und 0,126 ± 0,030 V bzw. Abbildung 3). Wir untersuchten anschließend den Membranpotentialen von MRSA auf Poly-L-lysin funktionalisiertes Edelstahl und Goldoberflächen. Es wurde festgestellt, dass MRSA Zellmembranpotentiale zwischen rostfreiem Stahl und Gold-Oberflächen variiert. Edelstahloberflächen zu deutlich größeren positiven Membran SPs für Zellen im Vergleich zu ihren Gegen Gold. Beispielsweise kann der SP des MRSA geschalteten Zellen von positiven zu negativen SPs. MRSA zeigten positive SP auf Edelstahloberflächen mit SPs von 0,160 ± 0,022 V und SP von -0,025 ± 0,016 V auf Goldoberflächen (P <0,001).
Um die volle Funktionalität KPFM, ein Beispiel zeigen,einer Schritthöhe Graph von MRSA auf rostfreiem Stahl vorgesehen ist (Figur 4). Dies zeigt die Differenz in der Oberflächenspannung zwischen der Substratoberfläche und der mikrobiellen Membran.
Abbildung 1. Arbeitsprinzipien der Rasterkraftmikroskop (i) und Kelvin-Sonde (ii) mit freundlicher Genehmigung aus (15). Die Grundkonfiguration der AFM ist in (i) gezeigt. In AFM wird eine scharfe Spitze an einem Ausleger durch elektrochemische Abscheidung befestigt. Mikromasch platinbeschichteten leitfähigen DPE (geräuscharm) Auskragungen wurden in diesem Experiment verwendet wurde, hatte Abmessungen von 210 x 30 um, 80 kHz Resonanzfrequenz und die Federkonstanten von 2,7 N / m. Ausleger wurden einer größeren Chip, um eine einfache Handhabung zu ermöglichen befestigt. Einmal im AFM montiert wird ein Laser auf die Auslegerspitze ausgerichtet ist. Auslenkungen in cantilje Spitze werden durch eine Photodiode. Ablenkungen werden verwendet, um topographische Bilder zu erzeugen. (Ii,, b, c a) zeigt das Arbeitsprinzip KPFM. Der Ausleger ist nahe genug an die Oberfläche gebracht, um einen elektrischen Kontakt zu treten kann. Unterschiede in den Oberflächenpotentialen zwischen Spitze und Oberfläche führen die Spitze abzulenken. Eine Gleichspannung angelegt wird, um für diese Ablenkung zu korrigieren. Dieser DC angelegte Spannung ist gleich dem Oberflächenpotential der Substratoberfläche. Je nach Art der verwendeten Bildgebungsmodus (Lift, AM, FM), unterscheidet sich diese Arbeitsweise geringfügig. Abbildung 1 (ii) aus 15 modifiziert.
Abbildung 2. Representative Topographie und Oberflächenpotenzialkarten von MRSA auf Poly-L-Lysin-funktionalisierten Edelstahl und Goldsubstraten. Bilder (i und iii) zeigen repräsentative Topographie Bilder MRSA Zellen auf rostfreiem Stahl und Gold Oberflächen. Bildabmessungen in den X und Y-Achsen der Bilder zusammen mit einer entsprechenden farbigen Höhenprofil zu sehen. (Ii und iv) zeigen die entsprechenden SP Karten des MRSA auf ihren jeweiligen Oberflächen. "Gold" Farbfilter Standard wurden angewandt, um Bilder Topographie während thermische Filter wurden angewendet, um Bilder SP leichter erkennen, kleine Änderungen in der SP. Es sei darauf hingewiesen, dass der SP von Substratoberflächen war nicht homogen sein. SP wurde festgestellt, heterogen mit offensichtlichen positiven und negativen Bereiche auf beiden Substratoberflächen zu verteilen. Dies kann etwa MRSA Zellen, in denen heterogene SPs auf Edelstahl und Goldsubstraten beobachtet zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 3. Oberflächenpotential von Substratoberflächen und MRSA Zellmembranen, Fig. 3 zeigt die entsprechenden KPFM Daten aus rostfreiem Stahl (hier als SS bezeichnet) und Gold-Oberflächen, sowie die Daten aus 15 Zellen. Sternchen stellen signifikante Unterschiede zwischen den Proben mit der Nummer der Sternchen entsprechend dem Vergleichsproben. MRSA-Daten wurden aus Zellen, die funktionalisierte Oberflächen nach 30 min Inkubation befestigt gesammelt. Dies wurde aufgrund der Tatsache, dass keine Zellen gefunden, die den blanken Substratoberflächen nach 3 h befestigen geführt.
Abbildung 4. Schritt hohe Oberflächenpotential Bild von MRSA auf Poly-L-Lysin-funktionalisierten Edelstahl. Mit Post-Bildverarbeitungssoftware wurde ein Stufenhöhen Graphen, um die capabili zeigen generiertBindungen der Software sowie die spürbaren Unterschied im SP zwischen der Substratoberfläche und Zellmembran. Der gewählte Querschnitt ist auf dem entsprechenden SP-Karte mit der grauen Linie dargestellt. Eine Verschiebung von 0,15 V auf der Zelloberfläche auf 0,21 V auf der Substratoberfläche ist deutlich zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
| Unternehmen | Sondentyp | Federkonstante (N / m) | Resonanzfrequenz (kHz) | Cantilever Abmessungen | Tipp Apex Durchmesser |
| Asylum Research | AC240TM-R3 | 2 | 70 | Länge = 240 & mgr; m Breite = 40 & mgr; m </ Td> | 28 nm |
| Bruker AFM Spitzen | SCM-PIT | 2.8 | 75 | Länge = 225 & mgr; m Breite = 28 & mgr; m | 20 nm |
| Mikromasch | Leitfähige DPE (Low-Noise) Ausleger | 2.7 | 80 | Länge = 210 & mgr; m Breite = 30 & mgr; | 40 nm |
| Nano und mehr USA | PtSi-NCH | 42 | 330 | Länge = 125 um Breite = 30 & mgr; | > 25 nm |
| Nanoscience Instruments | AppNano Leitfähige Tapping Mode AFM Spitzen. | 40 | 300 | Länge = 125 um Breite = 35 & mgr; | 30 nm |
| Nanoscience Instruments | AppNano Leitfähige Tapping Mode AFM Spitzen. | 40 | 300 | Länge = 125 um Breite = 35 & mgr; |
Tabelle 1 Unternehmen bietet eine breite Palette von KPFM Sonden. Eine Vielzahl von Firmen bieten inzwischen KPFM Spitze mit unterschiedlichen Spitzenende Durchmesser, Federkonstanten und Resonanzfrequenzen. Tipp Anpassung ist fast grenzenlos, mit Unternehmen in der Regel mit den Auslegern mit benutzerdefinierten Spezifikationen für eine beabsichtigte Experiment bauen. Meist KPFM Sonden sind mit Platin beschichteten Siliziumnitrid. Platin liefert leitfähigen Funktionalität auf den Ausleger. Andere übliche Beschichtungsmaterialien schließen Iridium, Platin + Iridium und Gold. Die meisten KPFM Tipps kann alternativ auch für die elektrische Kraftmikroskopie (EFM) verwendet werden. Tip Spitze ist wichtig für KPFM Ausleger. Größere Tipps Durchmesser opfern höhere Auflösung Topographie Bildgebung für weniger elektrische Störungen. Umgekehrt kleineren Spitzen Durchmesser (<25 nm) bieten eine verbesserte Bildauflösung Topographie sind jedoch anfällig für elektrisches Rauschen. Für diese Studie verwendeten die Forscher Mikromasch Verhaltenive DPE (geräuscharm) Ausleger.
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Discussion
KPFM wurde als ein neues Verfahren zur Gewinnung von elektrischer Oberflächendaten verwendet. Es wurde allgemein als ein Verfahren zur Untersuchung von Ladungsverteilung in der Chemie verwendet worden und hat erst seit kurzem für die Untersuchung von biologischen Systemen im Mikro- und Nano-Skalen angewendet werden. Aus den gesammelten Daten haben wir festgestellt, dass Mikroben schien nicht leicht befestigen zu reinigen Edelstahl und Gold-Oberflächen, auch nach 3 Stunden der statischen Inkubation. Poly-L-Lysin-funktionalisierten Oberflächen zeigten schnelle mikrobielle Anlage nach 30 min. Längere Inkubationszeiten von Mikroben auf funktionalisierten Oberflächen führte zu Zellüberbelegung auf Musterflächen und schlechte Topographie Bilder. Oberflächenfunktionalisierung führte zu einer Verschiebung von negativen zu positiven SP SP für Edelstahl und Gold-Oberflächen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Mikroorganismen, typischerweise einen negativen SPs aufgrund der Komplexbindung von negativ geladenen Ionen um die Zellen einem osmotischen und ionischen Gleichgewicht 23 aufrechtzuerhalten. Es ist auch bekannt,daß das Vorhandensein von Phosphatgruppen in gramnegativen Mikroorganismen und Teichonsäuren in Gram-positiven Mikroorganismen führt ferner zur Bildung von Negativ SPs 24. Die Kenntnis der Grundlagenchemie von Gram positiven und negativen Zellmembranen mussten wir davon ausgehen, dass positive Substrat SPs würde, um eine schnelle mikrobielle Anlage führen. Wie jedoch in den Figuren 2 zu erkennen ist - 4, dass es eine große Verschiebung vom positiven zum negativen MRSA Zelle SPs auf rostfreiem Stahl und Gold Substrate sind. Mikrobielle Befestigung könnte zunächst von der Beschlagnahme von negativen Ionen, um die Membran stattgefunden haben. Nach dem Waschen der Zellen und ließ sie auf den Substratoberflächen trocken, konnten wir seit dem Abwaschen von diesen ionischen Medien. Es sollte auch beachtet werden, dass KPFM Daten nur inklusive der äußeren Zellwandbereichen des Gram-positiven (MRSA) Zellen sein. Es hat sich in einigen Fällen gezeigt worden, daß ein Mikroorganismen Zellmembranpotential kann von der Gegenwart von CaTiO verändernnic antimikrobielle Peptide oder andere Stressoren 8.
Die einzige wesentliche Nachteil KPFM Vergleich zu Standard-Zeta-Potential-Messungen auf die mikrobielle Zellkulturen ist, dass in KPFM die gesammelten Daten an Toten und getrockneten Zellen durchgeführt. KPFM wurde verwendet, um allgemeine Trends in der Zelloberflächenpotentialverschiebungen in Bezug auf verschiedene Befestigungssubstratoberflächen zu untersuchen. Die Anwendung der DC an den Auslegerspitzenspannungen (bis F n entgegenzuwirken), zusammen mit der Anforderung eines leitenden Probenoberfläche zu begrenzen Standard KPFM auf Open-Air-Bildgebung. Imaging in polaren Flüssigkeit ist derzeit nicht möglich, mit Standard KPFM und damit die Abbildung von lebenden Zellen unter Verwendung KPFM ist als der noch möglich. Die Entwicklung von neuen Steuerungs- und Zweifrequenz KPFM Modi Versprechen in ihrer Fähigkeit, Bildflächen in Nieder ionischen Lösungen 18-20 gezeigt. Es ist unsere Hoffnung, dass in Zukunft diese Technologie weiterentwickelt, so dass Bildgebung kann auf liv erfolgene Zellkulturen. Die Bildgebung der Zellen in einer natürlichen Umgebung wäre zweifellos auf die Erzeugung genauer und realistischer Zellmembran SP Daten führen. Für diese Studie wollten wir diese Technik in einer neuartigen Weise gelten mikrobiellen Zellmembran Potentiale zu messen, sowie untersuchen die Hafteigenschaften von MRSA auf einen medizinisch relevanten Oberflächen. Veränderungen in der mikrobiellen Membran SPs wurden nach Inkubation auf den verschiedenen Substratoberflächen beobachtet. Dies kann bedeuten, dass Substrattyp kann den Zellstoffwechsel beeinflussen. Unsere Hoffnung ist, dass diese vorläufigen Daten können auf die Erzeugung von Nanobeschichtungen mit inhärenten elektrischen Ladungen, die zu medizinischen Oberflächen oder Geräte (einschließlich andere Materialien wie Bandagen und Gaze), um die mikrobielle Anlage zu verhindern angewendet werden könnte. Die in diesem Artikel beschriebenen Protokoll soll dazu beitragen Forscher verstehen, die Grundsätze der KPFM und zeigen Wege, wie sie zu messen und zu erstellen SP Karten angewendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
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