Abstract
פוטנציאל פני השטח הוא מאפיין פיזי נפוץ להתעלם שמשחק תפקיד דומיננטי בהידבקות של מיקרואורגניזמים למצע משטחים. מיקרוסקופיה קלווין כוח הבדיקה (KPFM) היא מודול של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) המודד את הפרש פוטנציאל קשר בין משטחים בקנה מידת ננו. השילוב של KPFM עם AFM מאפשר לדור בו זמני של פוטנציאל פני השטח ומפות טופוגרפיות של דגימות ביולוגיות כגון תאי חיידקים. כאן, אנו מעסיקים KPFM לבחון את ההשפעות של פוטנציאל פני השטח על הידבקות של חיידקים למשטחים רלוונטיים מבחינה רפואית כגון נירוסטה וזהב. מפות פוטנציאל פני השטח נמצאו הבדלים בפוטנציאל פני השטח לממברנות של חיידקים על מצעי חומר שונים. גרף צעד-גובה נוצר כדי להראות את ההבדל בפוטנציאל פני השטח באזור גבול בין פני המצע ומיקרואורגניזמים. שינויים בפוטנציאל פני השטח קרום תא נקשרו עם שינויים בחילוף חומרים ותנועתיות סלולריים. לכן, KPFM מייצג כלי רב עוצמה שיכול להיות מנוצל כדי לבחון את השינויים של פוטנציאל שטח קרום חיידקים על הידבקות למשטחי מצע שונים. במחקר זה, אנחנו מדגימים את ההליך כדי לאפיין את הפוטנציאל של תאי Staphylococcus aureus USA100 methicillin-עמיד בודדים משטח על נירוסטה וזהב באמצעות KPFM.
Introduction
Biofilms מיוצר על משטחי ציוד ובפצעי cutaneous מהווה בעיה עבור התעשייה הרפואית כbiofilms הוא סרבנים להסרת ויכול להוביל לעלייה בשיעור של העברת מחלות והתנגדות נגד חיידקים. קובץ מצורף הוא הצעד הראשון בהיווצרות biofilm והוא השלב הקריטי ביותר בשל ההפיכות שלה 1-3. מאפייני פני השטח מצע לשחק תפקיד מכריע בקובץ מצורף חיידקים. גורמים כגון קשיחות משטח, נקבוביות, חספוס, והידרופוביות הוכחו להשפיע קובץ מצורף חיידקים; עם זאת, מחקר קטן שבחן את תפקידו של פוטנציאל פני המצע (SP) על הידבקות של חיידקים נעשה 4,5. משטחים טעונים שלילי למנוע ההתקשרות של נבגי thuringiensis Bacillus ליציץ, סיליקון, וזהב 6. שינויים בפוטנציאל הממברנה סלולארי מעידים על שינויים בקובץ מצורף סלולארי ו5,7 תנועתיות. זה נצפה כי Hom חשמלימשטחי ogeneous יותר בקלות לקדם את ההידבקות של חיידקי 5. המאפיין את הפוטנציאל של חיידקי פני השטח בקנה המידה ננומטרי יכול לספק דרך רומן להבין קינטיקה ההידבקות של חיידקים למשטחים שונים, ובכך יכול לסייע בפיתוח אסטרטגיות אנטי-biofouling. בניגוד לשיטות אחרות המשמשות לאפיון קינטיקה אלקטרו של חיידקים, כגון פיזור electrophoretic אור, פוטנציאל זטה, ונחישות נקודת isoelectric, מיקרוסקופיה קלווין כוח הבדיקה (KPFM) מאפשרת הבדיקה של תאים בודדים במקום תרבויות שלמות 8-11. זה מועיל כאשר רוצה להשוות תאי תאים או biofilm מאפיינים חשמליים ברמת דיוק גבוהה ודיוק.
KPFM הוא מודול של מיקרוסקופיה כוח האטומית (AFM). AFM פותח כתוצאה ישירה של מיקרוסקופ מנהור הסורק (STM) 12. התמונות הראשונות שפורסמו באמצעות STM נעשו על ידי גרד ביניג והיינריך Rorhrer בשנת 1982 12 12. יכול להיעשות גם STM בנוזלים באמצעות טיפים בדיקה מיוחדים 13. זה הוצג על ידי לינדזי et al., שהשתמש בSTM וAFM למולקולות DNA תמונה ב 10 מ"מ 4 HClO ובמים, על אלקטרודות זהב 13. KPFM הודגם בקביעת פוטנציאל Surface של ניתוח דנ"א וחלבון 25 ומולקולות ביולוגיות אינטראקציה עם ligands 26.
KPFM פועל על ידי מדידת הבדל המגע הפוטנציאלי (CPD) בין קצה AFM מוליך שלוחה ומדגם באופן אידיאלי מוליך (איור 1, i) 14,15. דוגמאות לא בהכרח חייבות להיות (כלומר, sampl ביולוגי מוליךes). הדמיה יכולה להתבצע על נציץ, זכוכית, וכל עוד המשטח שאינו מוליך הוא דק ויש חומר מוליך בסיסי 6,7 משטחי סיליקון (שאינם מוליכים). CPD הוא שווה ערך למתח פוטנציאל פני השטח וניתן לתאר את ההבדל בפונקציות העבודה בין הקצה (קצה φ) ומדגם (מדגם φ), מחולק בתשלום האלקטרונים השלילי (- ה). כאשר קצה AFM מוליך הוא הביא קרוב למשטח מדגם (מופרד על ידי מרחק d), כוח אלקטרוסטטי (es F) נוצר כתוצאה מההבדל באנרגיות פרמי (איור 1, ii,) 15. בשלב זה, את האנרגיות של הוואקום (v E) וקצה המדגם נמצאות בשיווי משקל ותואם. על הבאת הקצה קרוב יותר אל פני השטח המדגם, משטח הקצה והמדגם בא במגע חשמלי ולפעול כקבלים מקבילים צלחת (איור 1, ii, b 14,15. בנקודה, אנרגיות פרמי של פני השטח וקצה המדגם הופכות מיושרות, והגיעו לשיווי משקל מתמיד (איור 1, ii, ב). משטח הקצה ומדגם יחויב וCPD V יהווה בשל הבדל בפונקציות של v ועבודת E. מעשי es F באזור המגע החשמלי בשל CPD V נוצר. כוח זה בטל לאחר מכן באמצעות היישום של DC V חיצוני לקצה שיש את אותו גודל כמו CPD V נוצר (איור 1, ii, ג). זה מיושם מתח DC מבטל תשלום פני השטח באזור המגע חשמלי, והסכום של V DC הצורך לחסל את es F של CPD V הוא שווה להפרש בפונקציות העבודה בין saמשטח mple וקצה 15. יש לציין שפונקצית העבודה של הקצה ידועה והוא מסופק על ידי יצרנים. בכל שיטות KPFM, מתח AC (V AC, כ 100-500 mV) חל גם על הקצה על מנת ליצור כוחות חשמליים נעים בין הקצה והמדגם 14. זה מספק רזולוציה טובה יותר כאשר מודד שינויים בCPD V ו / או es F. בהקשר זה, שינויים בתדירות או משרעת תנודה חשמלית ניתן לתקן על ידי V DC, ועל פני השטח יכולות להיות שנוצרו מפות פוטנציאליות. נתונים מאזורים ספציפיים של מפות אלה ניתן לנתח נוספים על מנת לספק מידע על תכונות חשמליים טופוגרפיות ספציפיות.
יכול להיות מופעל KPFM בשלושה מצבים: (1) מצב מעלית, (2) מצב אפנון משרעת (AM), ו- (3) מצב 14,16 אפנון תדר (FM). מצב מעלית היה inc הראשוניarnation של KPFM. מצב Lift מסתמך על שיטת שתי עוקפת שבקצה נע נגרר על פני לקבל תמונה טופוגרפית. למעבר שני הקצה מורם מרחק קבוע מראש מעל המדגם (10 - 100 ננומטר) וסרק בחזרה אל מעבר לאותו אזור. בשל שיטה זו שתי עוקפת, מצב מעלית, בהשוואה לאמנון וFM-KPFM, לוקח את הזמן הארוך ביותר לרכישת תמונה. העלאת הקצה מהמשטח מבטיחה כי es F רק ארוך טווח נמדד. כמו כן, לדבר לחצות בין מדידות פוטנציאל טופוגרפיה ופני שטח decoupled על חשבון הרזולוציה רוחב מוגבר ורגישות.
AM-KPFM משפר רזולוציה רוחב ורגישות באמצעות דו-תדרים למדוד טופוגרפיה מדגם ופוטנציאל פני השטח (סריקה חד-פס) 14 בו-זמנית. במצב AM, השלוחה נעה מכאנית, בדרך כלל 5% מתחת לתדר התהודה הראשון שלה (ו 0), ונע חשמלי (through V AC) בתדר התהודה השני שלה (ו 1). שינויים במשרעת של f ליתרון 0 לדור של נתונים טופוגרפיים, ואילו שינויים במשרעת של f 1, כתוצאה משינויים בes F וCPD V, לתת נתוני מדידת פוטנציאל פני השטח. f 0 וf 1 של שלוחה מופרדים על ידי תדרים משמעותיים ואנרגיות שלאותת הצטלבות ממוזערת 14. האלקטרוניקה ראש התיבה (HEB) של AFM מפרידה את שני האותות לתת שני טופוגרפי ונתוני השטח פוטנציאליים בו-זמנית בסריקה אחת. FM-KPFM משפר רזולוציה עוד יותר מאשר AM-KPFM על משטחים ביולוגיים 14. FM-KPFM פועל בצורה שונה מאשר AM-KPFM בכך שהיא מודדת את השינויים בשיפועי כוח אלקטרוסטטי ולא בכוח אלקטרוסטטי (es F) 15. כמו מצב בבוקר, מצב FM מנצל כפולים תדרים וSinglמנגנון סריקת דואר לעבור כדי להשיג טופוגרפי ונתוני השטח פוטנציאליים בו זמנית 14. במצב FM, השלוחה נעה מכאנית בf 0 ונעה חשמלי בתדר שונה נמוך (ו mod, 1 בדרך כלל - 5 kHz). על אינטראקציות אלקטרוסטטיות, f 0 וf תערובת mod לייצר להקות צד f mod ו 0 ±. sidebands אלה רגישים מאוד לשינויים בכוח אלקטרוסטטי, ויכול להיות מופרד מf 0 דרך HEB של AFM. מאז FM-KPFM מודד שינויים בשיפועי כוח אלקטרוסטטי, צורת שיא הטיפים והתחזוקה / שלמותה לשחק תפקיד קריטי בשטח כולל רזולוציה פוטנציאל 14, 15. במשטח רזולוציה פוטנציאלית באמצעות AM ומצבי FM הם בטווח של 1 ננומטר רוחבי 14 -16. יש לציין כי ההדמיה KPFM ניתן לעשות זאת בנוזלים שאינם קוטביים, ולאחרונה, הוכח להיעשות ב( <10 מ"מ) נוזלי קוטב נמוכים יוניים (במצבים פתוח לולאה KPFM שאינו דורשים משוב הטיה, מייתר את היישום של הטיה DC) כגון מים MilliQ; עם זאת, ההדמיה KPFM טרם נעשתה על תאי חיים בפתרונות קוטביים 17-20. אתגרים נוספים הקשורים להדמית SP בנוזל הוא שפתרונות נפוצים לתאי שמירה (כלומר, שנאגרו מלוח פוספט) יש ריכוז גבוה של יונים ניידים, מה שיוביל לתגובות Faradaic, דינמיקת מטען נובע מהטיה, ודיפוזיה יון / חלוקה מחדש 20. כך, לניסוי זה, מדידות נלקחו מתאי MRSA מיובשים ומתים על משטחי poly-L ליזין פונקציונליות נירוסטה וזהב בתנאי סביבה. הדמיה יכולה להתבצע בתנאי אוויר או ואקום על דגימות ביולוגיות שכבר מיובש או משותקת על משטחים 20 בעבר. תנאי לחות גם הוכחו להשפיע הדמיה KPFM של משטחים 6.
במחקר זה, אנחנו עובדים FM-KPFMוAFM כדי לבחון את התפקיד של SP על הקובץ המצורף של methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) למשטחי נירוסטה וזהב פונקציונליות poly-L- ליזין. MRSA לאחרונה צבר מעמד רב-סמים (MDR) "superbug" עמיד בשל התנגדות טבעית שנבחרה לאנטיביוטיקה β-לקטם רב וcephalosporins 21. זיהומי MRSA הם עכשיו יותר מאתגר, קשים, ואימתניים לטיפול, שהובילו לשימוש באנטיביוטיקה חריפה יותר כגון vancomycin או oxazolidinones שיש רמות גבוהות יותר רעילות בבני אדם, ולכן אינו יכול לשמש כטיפול לטווח ארוך 22. נירוסטה נבחרה בשל הרלוונטיות רפואיות שלה ושימוש נפוץ כחומר במחטים תת עורי, סירי לילה, ידיות דלתות, כיורים, וכו 'הזהב שימש כמתכת השוואתית. FM-KPFM נוצל כדי לבחון אם SP קרום חיידקים משתנה על קובץ מצורף למצעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת כלי הזכוכית ותרבויות
- לפני שתמשיך עם הניסוי הזה, להכין אגר 5 כבשים% דם (SBA) צלחות לגידול MRSA. דגירה צלחות SBA למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר פרק זמן זה, מושבות אחת, מבודדות היטב צריכה להיות נוכחת כדי לשמש לחיסונים שלאחר מכן לתקשורת נוזלית. חנות מפוספסת צלחות SBA עם מושבות אחת בC ° 4 ל1-2 חודשים.
הערה: הצלחות אגר דם של הכבשים באות בחבילות שהוכנו מראש, המכילות בין 20 - 25 צלחות המבוססות על היצרן, ובדרך כלל מורכבת מבסיס אגר סויה tryptic עם התוספת של 5% w / דם הכבשים v. - הפוך 500 מיליליטר של מרק tryptic סויה (TSB) בתוספת גלוקוז 1% ו -0.1% NaCl. אחרי זה, לאסוף ולנקות 2 מבחנות זכוכית. אם עפעפי autoclavable שאינם זמינים למבחנות, להשתמש בנייר אלומיניום ככובע. החיטוי TSB ומבחנות יחד עם קופסא הטיפים פיפטה 1 מיליליטר.
- תחת ממשלת בטיחות ביולוגית או בסמוך ללחמניות en מבער, פיפטה 5 מיליליטר של העבר autoclaved TSB למבחנות autoclaved. להיות זהיר כדי להבטיח שמספיק זמן ניתנה כדי לאפשר לTSB ומבחנות להתקרר לטמפרטורת חדר. מצלחת 5% SBA מפוספס בעבר, לחסן מושבה אחת ל -6 מיליליטר מרק TSB. אחד יכיל MRSA, והמבחנה השנייה תשמש כביקורת שלילית על מנת להבטיח סטריליות.
- קח מבחנות TSB מחוסנות ולמקם אותם בחממה הדדית למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס וב 200 סל"ד. לאחר פרק זמן זה התפתחותם של חיידקים צריכה להיות ברורה במבחנת MRSA ואילו צמיחה לא הייתה צריכה להתרחש במבחנת שליטה.
- קח 1 מיליליטר מתרבות 24 שעות ופיפטה לתוך 6 מיליליטר של TSB הטרי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות ב 200 סל"ד.
- פיפטה 1 מיליליטר של תת-תרבות 6 שעות לתוך צינור 1.5 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 850 x גרם. להסיר supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של H 2 O. deionized צנטריפוגה, לחזור, ומחדש להשעות.
"Jove_title"> 2. ניקוי וההרכבה של פלדת אל-חלד ומצעי זהב
- קח נירוסטה ודיסקי מדגם AFM הזהב (20 מ"מ ו -10 מ"מ בקטרים בהתאמה) ולנקות כל צד עם 5 מיליליטר של H 2 O. deionized להחזיק דיסקי מדגם ביד הדומיננטית עם מלקחיים ולהשתמש סובדומיננטה היד לפיפטה 5 מ"ל בכל צד של דיסק המדגם. לאחר שטיפת שני הצדדים, דיסקי מדגם המקום בכוס המכילה 20 מיליליטר של H 2 O deionized ואחריו sonication דקות 1.
- לאחר מלקחיים שימוש sonication להסיר דיסקי מדגם מהכוס. הנח את הדיסקים, כך שהם מתכופפים בזווית 60 מעלות כנגד הקצה של צלחת פטרי פתוחה על מגבת נייר. השתמש המכסה של צלחת פטרי כדי לכסות את דיסקי הייבוש. בואו דיסקים להתייבש לחלוטין לפני שימשיכו. זמן הייבוש יכול להשתנות בין 4-8 שעות.
- לאחר יבש, להשתמש במלקחיים כדי למקם את דיסקי מדגם לתוך צלחת פטרי.
- לחלופין, functionalize המשטחים של דיסקי מדגם עם כל חומר (למשל, קולגן, hyaluronan, ננו-חלקיקי כסף, וכו ').
- לצורך ניסוי זה, להשתמש בפולי-L ליזין למעייל פני המצע. לפולי-L ליזין functionalization, פיפטה 200-400 μl של 0.1% פולי-L ליזין (בH 2 O) על גבי דיסקי מדגם, ולתת דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר בצלחת פטרי.
- אחרי שעה 1, להשתמש במלקחיים כדי להחזיק את דיסק המדגם, ולשטוף עם 1 מיליליטר של H 2 O. deionized בואו יבש על מגבות נייר כמתואר בשלב 2.2.
- קח 2x מחדש מושעה תאים נשטפו וצלחת 200-400 μl על דיסקי מדגם בתוך ארון בטיחות ביולוגי. אם דיסקי מדגם מצופים בpoly-L- ליזין, דגירה של 0.5 שעות בטמפרטורת חדר.
- לאחר הדגירה של תאים על דיסקי מדגם, לשטוף דיסקי מדגם בעדינות עם 1 מיליליטר של H 2 O. deionized בואו דיסקי ייבוש למשך הלילה לפני ההדמיה.
3. KPFM הדמיה
הערה: לצורך ניסוי זה,להשתמש סדרת Agilent 5500 ILM-AFM.
- כדי להתחיל AFM, להפעיל יחידת מחשב יחד עם בקר HEB וMAC III של AFM. תוכנת הדמיה AFM הפתוח (לדוגמא, PicoView של Agilent). הקפד תחילה כדי לבחור ACAFM או לפי הייעוד הנכון הוא על AFM הדמיה במצב לסירוגין-קשר.
- בעזרת המלקחיים AFM ביד הדומיננטית, ומחזיק את בעל קליפ קפיץ פתוח עם סובדומיננטה היד, למקם שלוחה KPFM לראש-חתיכה. היזהר בעת טיפול והעברת הראש-חתיכת AFM לAFM כיחידה זו (לפחות על 5500 ILM-AFM) מכילה יחידת גביש piezo השבירה ששולטת X, Y, Z וdirectionalities סריקה.
הערה: זיזי KPFM משמשים במקרה זה היו DPE מוליך Mikromasch זיזים (רעש נמוך) עם תדר תהודה ממוצע של 80 קבועי kHz והאביב של 2.7 N / m. זיזים עם תדרי תהודה אלה וקבועים קפיץ נבחרו בשל קלות שימוש שלהם.גם זיזים עם קבועי קפיץ גדולים יותר ותדר תהודה גבוה יותר יכולים לשמש להדמיה. - לטעון בזהירות את הראש-פיסה לAFM ולחבר את החוטים המתאימים (במקרה זה שני חוטים צריכים להיות מחוברים לחשמל ב: אור הלייזר ומנוע מעלית שלב).
- יישר את הלייזר על הקצה של שלוחה. יחידות מסוימות מכילות פונקציונלי מצלמה המאפשרת ליישור קל. אם פונקציונלי מצלמה הוא לא מקיים בAFM, ליישר על קצה שלוחה כמתואר הבא:
- סובב את הכפתור בכיוון השעון קדימה ואחורה כדי להעביר את לייזר overtop שבב שלוחה. כאשר הלייזר מגיע לשבב זה יהיה חסום ולא יהיה עוד לעין. לפנות רק את הידית כמה פעמים.
- סובב את הידית הקדמית אל הגב נגד כיוון השעון עד לנקודת הלייזר מופיעה שוב. הלייזר הוא עכשיו על הקצה של השבב.
- סובב את הידית מהשמאל לימין כדי למקם את הלייזר על שלוחה. כמו הלייזר עובר על שלוחתו תיעלם ותופיע מחדש iרצף מהיר n. כתם הלייזר צריך להיות גלוי בכיסוי הזכוכית החלבית שבו יחידת photodiode מאוחר יותר לשבת.
- סובב את הכפתור אל הגב מול נגד כיוון השעון כדי להעביר את הנקודה במורד שלוחה לכיוון הקצה עד הנקודה על הזכוכית החלבית נעלמה.
- הפעל כפתור בכיוון השעון אל הגב מול רק מעט על מנת למצב את הלייזר כך שהוא פשוט יושב על קצה שלוחה. כתם הלייזר יופיע מחדש בזכוכית החלבית.
הערה: זוהי שיטת מיצוב הלייזר לזיזי קרש הקפיצה. לזיזים משולשים, תהליך היישור שונה במקצת.
- ברגע שהליזר מיושר, להחזיק את מנוע מעלית שלב במצב "הפתוח" במשך 10 שניות כדי להבטיח מספיק מקום בין שלוחה והמדגם בעת צירוף המדגם לAFM.
- הנח מדגם על הבמה מדגם KPFM. קרקע המדגם באמצעות חוטי נחושת. חבר את החוטים המתאימים מAFM לבמה המדגם. חבר שלכאחוז לAFM. ברוב המקרים השלב מוחזק במקום באמצעות מגנטים.
- בתוכנת AFM, מנגינת שלוחה ולאחר מכן להתחיל גישה של קצה שלוחה למדגם. ודא שזמן ההסדרה מוגדר על לא יותר מ 10 אלפיות שני, וכי מהירויות גישה לא יעלו על 2.0 מיקרומטר / sec כדי למנוע נזק קצה.
- ברגע שקצה שלוחה הוא על פני השטח המדגם, בחר גודל חלון הדמיה ואזור הדמיה אידיאלי. לייעל רווחים אני וP יחד עם הנקודה להגדיר שלוחה כך שהדמיה טופוגרפית היא מותאמת.
- ברגע שהדמיה טופוגרפית היא מותאמת, להפעיל מודול KPFM (או FM או AM מצב; כאן, להשתמש במצב FM). יש לציין כי ההדמיה KPFM היא מאוד מאתגרת מחוץ לחלון ההדמיה x 5 מיקרומטר 5 מיקרומטר. כמו כן, להדמית KPFM אופטימלית, להשתמש ברזולוציה 512 x 512 עם מהירויות איטיות סריקה (0.02-0.05 קווים / sec).
- להגדרות FM-KPFM (לא ACAFM הגדרות), להגדיר את כונן אחוזים בין 5 - 10%. הגדר את fr שלוחהequency בין 1-5 kHz עם רוחב פס של 2 קילו-הרץ. הגדר אני ורווחי P להגדרות FM-KPFM 0.3%.
- להשתנות רוחב פס של אות ואני ורווחי P בין משטחי מדגם. כדי לייעל את ההדמיה SP, נוסף להתאים רוחב פס של אות ואני ורווחים P כדי להשיג תמונות אופטימליות. הטווח המומלץ של רווחים אני וP הם 0.22-0.35%.
- עיבוד וניתוח תמונות שנאסף KPFM באמצעות תוכנת עיבוד תמונת פוסט-לאסוף נתונים SP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היכולת למדוד SP באמצעות KPFM מסתמכת על העיקרון ששני פני השטח המדגם וקצה שלוחה הם מוליך במידה מסוימת. נירוסטה וזהב פעלו משטחים מוליכים כמו שאליה צורפו MRSA. תמונות KPFM נלקחו 15 תאי MRSA על שני המשטחים עם 512 x 512 החלטות, ועם אזורי סריקה נעים בין 5 x 5 מיקרומטר עד 10 x 10 מיקרומטר. הסריקה בוצעה במהירויות קו שנעו בין 0.02 קווים / sec ל0.05 קווים / sec. לכן, עם 512 נקודות נתונים שנאספו לקווי קו ולסרוק 512, פעמים סריקה נעו בין 2.84 שעות לשעה 7.11. הסוגים של תמונות שנאספו ניתן לראות באיור 2. KPFM פועל באמצעות תדרים כפולים, ובתור שכזה, תמונות טופוגרפיות נאספות לאורך בו זמנית עם נתונים על המאפיינים החשמליים של המשטח. מסננים תרמיים יושמו SP מפות כדי להבחין בשינויים קטנים בפוטנציאל פני השטח (איור 2) בקלות רבה יותר. נתונים ממפות SP wכתוכנת עיבוד תמונת פוסט-נותחה על מנת לקבוע את פוטנציאל פני השטח ממוצע וסטיות תקן. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות תכנות R קוד הפתוח סטטיסטי. מבחני t סטודנט בוצעו השוואה בין קבוצות עם P <0.05 נשקלים משמעותי.
תמונות SP נותחו על מנת לקבוע את פוטנציאל פני השטח קרום חיידקים. אלה היו אז בהשוואה לצמיחה על משטחי מצע השונים. הדבר נעשה על מנת לקבוע אם היה לי סוג משטח השפעה על פוטנציאל פני השטח קרום חיידקים. בתחילה ניסינו לדגירת תאי MRSA סטטי במשך 3 שעות על משטחי המצע. עם זאת, אין חיידקים מצורפים נראו תחת AFM. נתונים SP למשטחים פונקציונליות נקי ופולי-L ליזין נקבעו בין 5 x 5 מיקרומטר אזורים שנסרקו. סריקות SP של מצעי נירוסטה וזהב חשוף החשופים הראו פוטנציאל פני השטח כולל שלילי (-.045 ± 0.057 V ו-.126 ± 0.052 V, בהתאמה, P = .047, איור 3). פולי-L ליזין שימש כדי functionalize המשטחים כדי להפוך אותם יותר נוח לקובץ מצורף תא. משטחים פונקציונליות הראו מעבר לפוטנציאל משטח חיובי למשטחי נירוסטה וזהב (.133 ± .063 V ו0.126 ± 0.030 V, בהתאמה, איור 3). אנו לאחר מכן בחנו את פוטנציאל הקרום של MRSA על משטחי נירוסטה וזהב פונקציונליות poly-L- ליזין. נמצא כי פוטנציאל קרום תא MRSA נע בין נירוסטה ומשטחי זהב. משטחי נירוסטה הובילו לSPs קרום החיובי הגדול יותר באופן משמעותי לתאים בהשוואה לעמיתו הזהב שלהם. לדוגמא, SP של תאי MRSA עבר מחיובי לשלילי SPs. MRSA הראה SP החיובי על משטחי נירוסטה עם SPs של 0.160 ± 0.022 V וSP של -0.025 ± 0.016 V על משטחי זהב (P <0.001).
כדי להציג את מלוא היכולות של KPFM, דוגמאשל גרף צעד-גובה של MRSA על נירוסטה מסופק (איור 4). זה מראה את ההבדל בפוטנציאל פני השטח בין משטח המצע ואת הקרום של חיידקים.
איור 1. עקרונות עבודה של מיקרוסקופ כוח האטומי (i) וכוח הבדיקה קלווין מיקרוסקופ (ii) הודפס מחדש באישור מ( 15). התצורה הבסיסית של AFM מוצגת ב( i). בAFM, קצה מחודד מחובר לשלוחה באמצעות תצהיר אלקטרוכימיים. Mikromasch זיזי מוליך DPE (רעש נמוך) מצופה פלטינה שימשה בניסוי זה היה ממדים של 210 x 30 מיקרומטר, תדר תהודה 80 kHz, וקבועי האביב של 2.7 N / m. זיזים צורפו לשבב גדול יותר על מנת לאפשר לטיפול קל. ברגע שהתאסף בAFM, לייזר מיושר על קצה שלוחה. סטיות בcantilטיפ אי פעם מזוהים באמצעות דיודת אור. סטיות משמשות ליצירת תמונות טופוגרפיות. (Ii, a, b, c) מציגה את עיקרון העבודה של KPFM. השלוחה הביאה מספיק קרוב אל פני השטח כדי לאפשר למגע חשמלי להתרחש. הבדלים בפוטנציאל פני השטח בין קצה המשטח לגרום הקצה להסיט. מתח DC מוחל לתקן סטייה זו. מתח זה DC מיושם שווה לפוטנציאל של פני השטח מצע פני השטח. בהתאם לסוג של מצב הדמיה משמש (מעלית, AM, FM), עיקרון עבודה זה שונה במקצת. איור 1 (ii) שונה מ-15.
איור 2. טופוגרפיה נציג ופני שטח מפות פוטנציאל של MRSA על מצעי נירוסטה וזהב פונקציונליות poly-L- ליזין. תמונות (I ו- III) להראות תמונות טופוגרפיה נציג של תאי MRSA על נירוסטה ומשטחי זהב, בהתאמה. ניתן לראות מידות תמונה בציר X ו- Y של תמונות אלה יחד עם פרופיל גובה צבעוני תואם. (Ii וiv) להראות את מפות SP המקבילות של MRSA על משטחים המיוחסים להם. מסנני הצבע "זהב" הסטנדרטי יושמו טופוגרפיה תמונות תוך מסנני תרמית יושמו SP תמונות להבחין שינויים קטנים בSP בקלות רבה יותר. יש לציין כי SP של משטחי מצע לא היה הומוגנית. SP נמצא שיחולק הטרוגני עם אזורים חיוביים ושליליים לכאורה על שני משטחי המצע. ניתן לראות זאת בסביבת תאי MRSA בי SPs הטרוגנית הם נצפו על מצעי נירוסטה וזהב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
52,327 / 52327fig3highres.jpg "/>
איור 3. פוטנציאל Surface של משטחי מצע וממברנות תאי MRSA. איור 3 מציג את הנתונים המתאימים KPFM מפלדת אל-חלד (המתויגת כאן כSS) ומשטחי זהב, כמו גם, נתונים מ -15 תאים. כוכביות מייצגות הבדלים משמעותיים בין דגימות עם מספר הכוכביות המתאימות לדגימות בהשוואה. נתונים MRSA נאספו מהתאים המצורפים למשטחים פונקציונליות לאחר 30 דקות של דגירה. הדבר נעשה בשל העובדה שלא נמצאו תאים לצרף למשטחי מצע החשופים אחרי 3 שעות.
תמונת איור 4. משטח שלב גובה פוטנציאלי של MRSA על נירוסטה פונקציונליות poly-L- ליזין. שימוש בתוכנת עיבוד תמונת פוסט-, גרף צעד-גובה נוצר כדי להראות capabiliקשרים של התוכנה, כמו גם, ההבדל הבולט בSP בין משטח המצע וקרום תא. שטח החתך נבחר מיוצג על מפת SP המקבילה עם הקו האפור. מעבר מ0.15 V על פני התא ל0.21 V על פני המצע ניכר היטב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| חברה | בדיקה סוג | קבוע קפיץ (N / m) | תדר תהודה (kHz) | מידות שלוחה | עצה קוטר איפקס |
| מקלט מחקר | AC240TM-R3 | 2 | 70 | אורך = 240 מיקרומטר Width = 40 מיקרומטר </ Td> | 28 ננומטר |
| בדיקות AFM ברוקר | SCM-PIT | 2.8 | 75 | אורך = 225 מיקרומטר Width = 28 מיקרומטר | 20 ננומטר |
| Mikromasch | זיזי מוליך DPE (רעש נמוך) | 2.7 | 80 | אורך = 210 מיקרומטר Width = 30 מיקרומטר | 40 ננומטר |
| ננו ועוד ארה"ב | PtSi-NCH | 42 | 330 | אורך = 125 מיקרומטר Width = 30 מיקרומטר | > Nm 25 |
| מכשירים הננו | בדיקות אטימות AppNano טאפינג מצב AFM. | 40 | 300 | אורך = 125 מיקרומטר Width = 35 מיקרומטר | 30 ננומטר |
| מכשירים הננו | בדיקות אטימות AppNano טאפינג מצב AFM. | 40 | 300 | אורך = 125 מיקרומטר Width = 35 מיקרומטר |
חברות טבלת 1. מציעות מגוון רחב של בדיקות KPFM. מגוון רחב של חברות מציעות כעת טיפ KPFM בקטרים שונים קצה קודקוד, קבוע קפיץ, ותדר תהודה. התאמה אישית עצה היא ליד בלתי מוגבלת, עם חברות בדרך כלל מציעות לבנות זיזים עם מפרט מותאם אישית עבור ניסוי מיועד. רוב בדיקות KPFM הן סיליקון ניטריד מצופה פלטינה. פלטינה מספקת פונקציונלי מוליך לשלוחה. חומרי ציפוי נפוץ אחרים כוללים אירידיום, פלטינה + אירידיום, וזהב. גם רוב הטיפים KPFM ניתן להשתמש לחלופין למיקרוסקופיה החשמלית כוח (EFM). שיא עצה חשוב לזיזי KPFM. טיפים בקוטר גדולים יותר להקריב הדמיה טופוגרפיה ברזולוציה גבוהה יותר עבור פחות רעש חשמלי. לעומת זאת, הצעת טיפים קוטר קטן יותר (<25 ננומטר) השתפרה רזולוציה של תמונת טופוגרפיה אבל נוטה יותר לרעש חשמלי. במחקר זה, חוקרים השתמשו בהתנהלות Mikromaschive DPE זיזים (רעש נמוך).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KPFM הועסק כטכניקה חדשנית לקבלת נתונים חשמליים פני השטח. זה בדרך כלל נעשה שימוש כאמצעי לבחינת חלוקת תשלום בכימיה וברק לאחרונה החל להיות מיושם לחקר מערכות ביולוגיות במייקרו וננו-מאזניים. מהנתונים שנאספו מצאנו כי חיידקים לא הופיעו לצרף בקלות לניקוי משטחי נירוסטה וזהב, גם לאחר 3 שעות של הדגירה סטטי. משטחים פונקציונליות פולי-L ליזין הראו קובץ מצורף חיידקים מהירים אחרי 30 דקות. פעמים דגירה ארוכות יותר של חיידקים על משטחים פונקציונליות הובילו לתא צפיפות על משטחי מדגם, ותמונות טופוגרפיה עניות. functionalization המשטח הובילה למעבר מSP השלילי לSP החיובי למשטחי נירוסטה וזהב. מחקרים קודמים הראו שיש לי מיקרואורגניזמים בדרך כלל SPs השלילי בשל sequestering של יונים טעונים שלילי סביב תאים לשמור האוסמוטי ואיזון יוני 23. זה ידוע גם בשםכי הנוכחות של קבוצות פוספט בגרם מיקרואורגניזמים שליליים וחומצות teichoic במיקרואורגניזמים חיוביים גרם מובילה נוספת להיווצרות של 24 SPs השלילי. ידע של הכימיה הבסיסית של קרום תא חיובי ושלילי גרם הוביל אותנו להניח כי SPs מצע החיובי יוביל לקובץ מצורף חיידקים מהירים. עם זאת, כפי שניתן לראות באיורים 2 - 4, שהייתה זזה גדולה מחיובי לSPs תא MRSA השלילי על מצעי נירוסטה וזהב, בהתאמה. קובץ מצורף חיידקים יכול היה תחילה התרחש מהתפיסה של יונים שליליים סביב הקרום. על שטיפת התאים ולתת להם יבשים על משטחי המצע, והיינו לנו שטיפת תקשורת יונית זה. כמו כן, יש לציין כי נתונים KPFM הוא רק כולל של דופן תא האזורים החיצוניים של חיובי גרם (MRSA) תאים. זה הוכח במקרים מסוימים שפוטנציאל קרום תא מיקרואורגניזמים עשוי להשתנות בנוכחות של catioפפטידים nic מיקרוביאלית או גורמי לחץ אחרים 8.
החסרון העיקרי אחד KPFM בהשוואה למדידות פוטנציאל זטה סטנדרטית בתרביות תאים של חיידקים הוא שבKPFM הנתונים שנאספו נעשה על תאים מתים ויבשים. KPFM שימש לבחון מגמות כלליות במשמרות פוטנציאל תא שטח בכל הקשור למשטחי מצע קובץ מצורף שונים. היישום של DC מתחים לקצה שלוחה (כדי לנטרל es F), יחד עם הדרישה של פני השטח מדגם מוליך, להגביל KPFM הסטנדרטי לפתוח-אוויר הדמיה. הדמיה בנוזל קוטבי לא ניתן כיום עם KPFM הסטנדרטי, ובכך ההדמיה של תאי חיים באמצעות KPFM היא לא כמו של עוד אפשרי. התפתחויות של לולאה פתוחה חדשה ומצבי KPFM תדר כפול הראו הבטחה ביכולתם משטחי תמונה בפתרונות נמוכים יוניים 18-20. תקוותנו היא כי בעתיד טכנולוגיה זו פותחה עוד כל כך הדמיה שאפשר לעשות על ליבתרביות תאי דואר. ההדמיה של תאים בסביבה טבעית יותר הייתה ללא ספק תוביל לדור של נתונים SP קרום תא מדויקים יותר ומציאותיים. במחקר זה שאנחנו רוצים ליישם את הטכנולוגיה הזו בצורה רומן למדוד פוטנציאלי קרום תא של חיידקים, כמו גם ללמוד את מאפייני ההדבקה של MRSA על משטח רלוונטי מבחינה רפואית. שינויים בSPs קרום החיידקים נצפו על דגירה על משטחי מצע השונים. זה עשוי לרמוז כי סוג המצע עשוי להשפיע על חילוף חומרים תאיים. התקווה שלנו היא שנתונים ראשוניים זה עלולים להוביל לדור של ננו-ציפויים עם מטענים חשמליים טבועים שיכולים להיות מיושמים על משטחים רפואיים או ציוד (כוללים חומרים אחרים כגון תחבושות וgauzes) על מנת למנוע התקשרות של חיידקים. הפרוטוקול המתואר במאמר זה נועד לסייע לחוקרים להבין את העקרונות של KPFM ודרכים תכנית שבה ניתן ליישם אותו כדי למדוד וליצור מפות SP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
- Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
- Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
- Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
- Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
- Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
- Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
- Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
- Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
- Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
- Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
- Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
- Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
- Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
- Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
- Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
- Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
- Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
- Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).
