Abstract
Oppervlaktepotentiaal is een algemeen uitzicht fysieke eigenschap dat een dominante rol in de hechting van micro-organismen aan substraatoppervlakken speelt. Kelvin sonde kracht microscopie (KPFM) is een module van atomic force microscopie (AFM) dat het contact potentiaalverschil tussen oppervlakken op nano-schaal meet. De combinatie van KPFM AFM maakt gelijktijdige opwekking van oppervlaktepotentiaal en topografische kaarten van biologische monsters zoals bacteriële cellen. Hier maken we KPFM de effecten van de oppervlakte potentiaal op microbiële hechting op medisch relevante oppervlakken zoals roestvrij staal en goud onderzoeken. Oppervlakte potentiaalkaarten geopenbaard verschillen in oppervlaktepotentiaal microbiële membranen van verschillende materialen substraten. Een stap hoogte grafiek werd gegenereerd om het verschil in oppervlaktepotentiaal show in een grensgebied tussen het substraatoppervlak en micro-organismen. Veranderingen in cellulaire membraan oppervlaktepotentiaal zijn verbonden met overstaps in cellulaire metabolisme en motiliteit. Daarom KPFM is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om de veranderingen van microbiële membraanoppervlak potentieel bij hechting op diverse substraatoppervlakken onderzoeken. In deze studie demonstreren we de procedure voor de oppervlaktepotentiaal van individuele methicilline-resistente Staphylococcus aureus USA100 cellen te karakteriseren op roestvrij staal en goud met KPFM.
Introduction
Biofilms geproduceerd op apparatuur oppervlakken en in huidwonden een probleem vormen voor de medische industrie als biofilms zijn recalcitrant te verwijderen en kan leiden tot een verhoogde tarieven van de overdracht van ziekten en antimicrobiële resistentie. Hechting is de eerste stap in biofilmvorming en is de meest kritische stap vanwege de omkeerbaarheid 1-3. Substraat oppervlakte-eigenschappen spelen een cruciale rol op de microbiële gehechtheid. Factoren zoals oppervlakte hardheid, porositeit, ruwheid en hydrofobiciteit is aangetoond dat bacteriële hechting te bewerkstelligen; Er is echter weinig onderzoek naar de invloed van substraatoppervlak potentiaal (SP) op microbiële adhesie gedaan 4,5. Negatief geladen oppervlakken te voorkomen de bevestiging van Bacillus thuringiensis sporen mica, silicium, goud en 6. Veranderingen in cellulaire membraanpotentiaal wijzen op veranderingen in cellulaire hechting en motiliteit 5,7. Het is waargenomen dat elektrisch homogeneous oppervlak te bevorderen microbiële adhesie 5. Karakterisering van de oppervlaktepotentiaal van bacteriën op nanoschaal kan een nieuwe manier om de hechting kinetiek van bacteriën voor verschillende ondergronden begrijpen verschaffen, en daardoor kan helpen bij de ontwikkeling van anti-biofouling strategieën. In tegenstelling tot andere methoden voor het karakteriseren van de electro kinetiek bacteriën zoals elektroforetische lichtverstrooiing, zeta potentiaal en isoelektrisch punt bepalen, Kelvin probe force microscopie (KPFM) maakt het onderzoek van individuele cellen in plaats van gehele kweken 8-11. Dit is gunstig wanneer willen vergelijken cel-cel of biofilm elektrische kenmerken met een hoge nauwkeurigheid en precisie.
KPFM is een module van atomaire kracht microscopie (AFM). AFM werd ontwikkeld als een direct gevolg van de scanning tunneling microscoop (STM) 12. De eerste gepubliceerde beelden met behulp van STM werden gedaan door Gerd Binnig en Heinrich Rorhrer in 1982 12 12. STM kan ook in vloeistoffen met gespecialiseerde meetpennen 13. Dit werd aangetoond door Lindsay et al., Die STM en AFM gebruikt om beelden DNA moleculen in 10 mM HClO 4 en water, op goud elektroden 13. KPFM is aangetoond in het bepalen van de oppervlaktepotentiaal van DNA en eiwitanalyse 25 en biomoleculen interactie met liganden 26.
KPFM werkt door het meten van het contact potentiaalverschil (CPD) tussen een AFM geleidende cantilever tip en een ideaal geleidende monster (Figuur 1, i) 14,15. Monsters niet noodzakelijkerwijs geleidende (dwz biologische Sampl zijnes). Imaging kan op mica, glas en silicium oppervlakken (niet geleidend), zolang de niet-geleidende oppervlak dun en er een onderliggend geleidend materiaal 6,7 uitgevoerd. De CPD is gelijk aan de oppervlaktepotentiaal spanning en kan worden omschreven als het verschil in de werkfuncties tussen de tip (φ tip) en monster (φ monster), gedeeld door de negatieve elektron lading (- e). Wanneer een geleidende AFM tip dicht wordt gebracht op een monsteroppervlak (gescheiden door afstand d), een elektrostatische kracht (F n) gegenereerd door het verschil in Fermi energie (Figuur 1, ii, a) 15. Op dit punt, het vacuüm energieën van de tip en monster (E v) in evenwicht en uitgelijnd. Bij het brengen van de punt dichter bij het monster oppervlak, de tip en sample oppervlak in elektrisch contact en fungeren als parallelle plaat condensatoren (Figuur 1, ii, b komen 14,15. Op het moment, de Fermi energie van de tip en monsteroppervlak gelijkgericht raken, tot een steady-state-evenwicht (figuur 1, ii, b). De tip en sample oppervlak wordt in rekening gebracht en een V CPD zal vormen als gevolg van een verschil in E v 's en werkfuncties. Acts Een F es op het elektrisch contact gebied als gevolg van de gevormde V CPD. Deze kracht wordt vervolgens vernietigd door toepassing van een externe V DC aan de tip die dezelfde grootte als de gevormde V CPD heeft (figuur 1, ii, c). Dit gold gelijkspanning elimineert oppervlaktelading op het gebied van elektrisch contact, en de hoeveelheid V DC noodzakelijk de F es V CPD elimineren is gelijk aan het verschil in de werkfuncties tussen de sample oppervlak en tip 15. Opgemerkt zij dat de werkfunctie van de tip is bekend en wordt geleverd door de fabrikanten. In alle KPFM werkwijzen, een AC spanning (V AC, ongeveer 100-500 mV) wordt ook toegepast op de tip om oscillerende elektrische kracht tussen de tip en monster 14 genereren. Dit zorgt voor een betere resolutie bij het meten van veranderingen in de V CPD en / of F es. In dit opzicht kunnen veranderingen in de frequentie of amplitude van de elektrische oscillatie worden gecorrigeerd door V DC en oppervlakte potentiaalkaarten kunnen worden gegenereerd. Gegevens van specifieke gebieden van deze kaarten kan verder worden geanalyseerd om de elektrische informatie over specifieke topografische kenmerken bieden.
KPFM kan in drie modi: (1) lift stand (2) amplitudemodulatie (AM) modus, en (3) frequentiemodulatie (FM) modus 14,16. Lift-modus was de eerste incarnation van KPFM. Lift-modus is gebaseerd op een twee-pass-methode waarbij een kronkelende tip wordt gesleept over het oppervlak om een topografische afbeelding te verkrijgen. Voor de tweede pas het topje omhoog staat een vooraf ingestelde afstand boven het monster (10-100 nm) en terug over hetzelfde gebied gescand. Door deze twee-pass-methode, lift-modus, in vergelijking met AM- en FM-KPFM, neemt de langste tijd voor het acquisitie. Het verhogen van de tip van het oppervlak zorgt ervoor dat alleen lange afstand F es gemeten. Ook wordt overspraak tussen topografie en oppervlaktepotentiaal metingen ontkoppeld ten koste van toegenomen laterale resolutie en gevoeligheid.
AM-KPFM verbetert de laterale resolutie en gevoeligheid door het gebruik van dual-frequenties voor het gelijktijdig meten monster topografie en oppervlaktepotentiaal (one-pass scan) 14. In de AM-modus, wordt de cantilever mechanisch schommelde, in het algemeen 5% onder het eerste resonantiefrequentie (f 0), en elektrisch schommelde (through een V AC) bij zijn tweede resonantiefrequentie (f 1). Veranderingen in de amplitude van f 0 leidt tot het genereren van topografische gegevens, terwijl veranderingen in de amplitude van f1, door veranderingen in F es en V CPD geven oppervlaktepotentiaalmeter meetgegevens. f 0 en f 1 van de cantilever gescheiden door belangrijke frequenties en energieën signaal overspraak geminimaliseerd 14. Het hoofd elektronica doos (HEB) van de AFM scheidt de twee signalen om zowel topografische geven en oppervlakte potentiële gegevens tegelijkertijd in één scan. FM-KPFM verbetert de resolutie nog verder dan het AM-KPFM op biologische oppervlakken 14. FM-KPFM werkt anders dan de AM-KPFM in dat het meet de ontwikkeling van elektrostatische kracht hellingen in plaats van elektrostatische kracht (F n) 15. Net als de AM-modus, FM-modus maakt gebruik van dual-frequenties en formae bypass aftastmechanisme verkrijgen topografische en oppervlaktepotentiaal gegevens tegelijk 14. In de FM-modus wordt de cantilever mechanisch schommelde bij f 0 en elektrisch schommelde bij een lage gewijzigde frequentie (f mod, meestal 1-5 kHz). Bij elektrostatische interacties, f 0 en f mod mix te zijbanden f 0 ± f mod te produceren. De zijbanden zijn zeer gevoelig voor elektrostatische kracht, en kan uit f 0 gescheiden door AFM HEB. Aangezien FM-KPFM meet de ontwikkeling van elektrostatische kracht hellingen, de tips apex vorm en het onderhoud / integriteit spelen een cruciale rol in de totale oppervlakte potentieel resolutie 14, 15. Oppervlaktepotentiaal resolutie met behulp van AM en FM-modi zijn in het bereik van 1 nm zijwaarts 14 -16. Opgemerkt zij dat KPFM beeldvorming kan worden uitgevoerd in niet-polaire vloeistoffen, en meer recent is aangetoond worden gedaan low-ionische (<10 mM) polaire vloeistoffen (inopen lus KPFM modes die geen vertekening terugkoppeling vereisen, waardoor het niet toepassen van een DC-bias) zoals MilliQ water; echter KPFM beeldvorming nog gebeuren op levende cellen in polaire oplossingen 17-20. Extra uitdagingen van SP beeldvorming vloeistof die oplossingen gebruikt voor het handhaven cellen (bijvoorbeeld, fosfaat gebufferde zoutoplossing) hebben hoge concentraties van mobiele ionen, hetgeen leidt tot Faraday reacties, diagonaal-geïnduceerde lading dynamiek en ionendiffusie / herverdeling 20. Zo dit experiment werden metingen genomen van gedroogd en MRSA dode cellen op poly-L-lysine gefunctionaliseerde roestvrij staal en goud oppervlakken onder omgevingsomstandigheden. Beeldvorming kan plaatsvinden onder omstandigheden lucht of vacuüm worden uitgevoerd op biologische monsters die eerder zijn gedroogd of geïmmobiliseerd op oppervlakken 20. Vochtige omstandigheden hebben ook aangetoond KPFM beeldvorming oppervlakken 6 beïnvloeden.
In deze studie hebben we gebruikt FM-KPFMAFM en de rol van SP op de bevestiging van methicilline-resistente Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) poly-L-lysine gefunctionaliseerde roestvrij staal en goud oppervlakken onderzoeken. MRSA is onlangs oogstte status als een multi-resistente (MDR) "superbacterie" vanwege zijn natuurlijke geselecteerde bestendigheid tegen vele β-lactam antibiotica en cefalosporinen 21. MRSA infecties zijn nu moeilijker, moeilijker en formidabele te behandelen, waardoor het gebruik van hardere antibiotica zoals vancomycine en oxazolidinonen die hogere toxiciteit bij mensen hebben, en daarom niet als langdurige behandeling 22. Roestvrij staal werd gekozen vanwege zijn medisch belang en gemeenschappelijk gebruik als materiaal in injectienaalden, ondersteken, deurkrukken, putten, enz goud werd gebruikt als vergelijkende metaal. FM-KPFM werd gebruikt om te onderzoeken of microbiële membraan SP veranderingen na bevestiging aan de substraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van glaswerk en Culturen
- Voordat u verder gaat met dit experiment, voor te bereiden 5% schapenwol bloed agar (SBA) platen voor het kweken van MRSA. Incubeer SBA platen gedurende 24 uur bij 37 ° C. Hierna moeten centrale, goed geïsoleerde kolonies aanwezig gebruiken voor daaropvolgende entingen in vloeibare media. WINKEL strepen SBA platen met afzonderlijke kolonies bij 4 ° C gedurende 1-2 maanden.
OPMERKING: Schapen agarplaten komen voorgevormde verpakkingen tussen 20-25 platen op basis van de fabrikant, en typisch uit een tryptische soja-agar aangevuld met 5% g / v bloed schapen. - Voeg 500 ml tryptische soja bouillon (TSB) aangevuld met 1% glucose en 0,1% NaCl. Na deze, te verzamelen en te reinigen 2 glazen reageerbuizen. Als autoclaveerbaar deksels zijn beschikbaar voor reageerbuizen, gebruiken aluminiumfolie als een dop. Autoclaaf TSB en reageerbuizen samen met een doos van 1 ml pipet tips.
- Onder een bioveiligheid kast of in de buurt van een Bunsnl brander, pipet 5 ml van eerder geautoclaveerd TSB in geautoclaveerd reageerbuizen. Wees voorzichtig dat er voldoende tijd te waarborgen werd gegeven om te laten de TSB en reageerbuizen afkoelen tot kamertemperatuur. Van een eerder weggeschoten 5% SBA plaat, te enten een enkele kolonie in 6 ml TSB bouillon. Men zal MRSA bevatten, en de tweede reageerbuis wordt gebruikt als een negatieve controle om steriliteit te waarborgen.
- Neem geïnoculeerde TSB reageerbuizen en deze in wederzijdse incubator gedurende 24 uur bij 37 ° C en bij 200 rpm. Hierna microbiële groei zichtbaar in de MRSA reageerbuis moet zijn, geen groei zou hebben plaatsgevonden in de controle reageerbuis.
- Neem 1 ml van 24 uur cultuur en pipet in 6 ml vers TSB. Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 uur bij 200 rpm.
- Pipetteer 1 ml van 6 uur subcultuur in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer gedurende 3 min bij 850 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml gedeïoniseerd H2O Centrifuge, herhalen en opnieuw op te schorten.
- Neem roestvrij staal en goud AFM monster schijven (20 mm respectievelijk 10 mm diameter) en reinig kant met 5 ml gedeïoniseerd H2O Houd monster schijven in de dominante hand met een tang en gebruik de subdominant hand 5 ml pipet aan elke zijde van het monster schijf. Na wassen beide zijden plaats voorbeeld schijven in een bekerglas met 20 ml gedeïoniseerd H2O gevolgd door sonicatie gedurende 1 minuut.
- Na sonicatie gebruik een tang om het monster schijven te verwijderen uit de beker. Plaats de schijven, zodat ze leunen op een hoek van 60 ° tegen de rand van een open Petri plaat op een papieren handdoek. Gebruik het deksel van de Petri plaat ter dekking van de droging schijven. Laat schijven volledig drogen voordat u verder gaat. 8 hr - De droogtijd kan variëren tussen 4.
- Eenmaal droog, een tang om het monster schijven te plaatsen in een Petri plaat.
- Optioneel functionaliseren de oppervlakken van het monster schijven met enig materiaal (bijvoorbeeld, collageen, hyaluronzuur, zilver nanodeeltjes, etc.).
- Voor dit experiment gebruikt poly-L-lysine te bekleden het substraatoppervlak. Voor poly-L-lysine functionalisering, pipet 200-400 gl 0,1% poly-L-lysine (in H2O) op monster schijven, en laat incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een petrischaal.
- Na 1 uur tang om de sample disk houden, en was met 1 ml gedeïoniseerd H2O Laten drogen op keukenpapier zoals beschreven in stap 2.2.
- Neem 2x gewassen opnieuw gesuspendeerde cellen en plaat 200-400 pi op monster schijven in een bioveiligheid kast. Als voorbeeld schijven bekleed met poly-L-lysine, incubeer gedurende 0,5 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Na incubatie van cellen op monster schijven, wassen monster schijven voorzichtig met 1 ml gedeïoniseerd H2O Laat schijven nacht drogen voor de beeldvorming.
3. KPFM Imaging
OPMERKING: Voor dit experiment,Gebruik een Agilent 5500 serie ILM-AFM.
- AFM starten, schakelt u de computer unit samen met de AFM HEB en MAC III controller. Open AFM imaging software (bijvoorbeeld Agilent PicoView). Zorg ervoor dat u kiest aanvankelijk ACAFM of welke de correcte benaming is op de AFM voor de beeldvorming in intermitterende-contact-modus.
- Met behulp van AFM een tang in de dominante hand, en het houden van de verende clip houder geopend met de subdominante de hand, plaats een KPFM cantilever in het hoofd-stuk. Wees voorzichtig bij het hanteren en het overbrengen van de AFM hoofd-stuk aan de AFM als dit toestel (althans op de 5500 ILM-AFM) bevat de fragiele piëzo kristal eenheid die X, Y en Z scannen directionalities controleert.
OPMERKING: De KPFM uitkragingen gebruikt in dit geval waren Mikromasch geleidende DPE (low-noise) uitkragingen met gemiddeld resonante frequenties van 80 kHz en veerconstanten van 2,7 N / m. Cantilevers met deze resonantiefrequenties en veerconstanten werden gekozen vanwege hun gebruiksgemak.Cantilevers met grotere veerconstanten en hogere resonantiefrequenties kunnen ook worden gebruikt voor beeldvorming. - Vul voorzichtig hoofd-stuk in de AFM en sluit de juiste draden (in dit geval twee draden moeten worden aangesloten: laserlicht en podium lift motor).
- Richt de laser op de punt van de cantilever. Sommige eenheden bevatten een camera functionaliteit die het mogelijk maakt voor eenvoudiger uitlijning. Als camera functionaliteit niet aanwezig is op de AFM, uitlijnen op de cantilever tip zoals beschreven volgende:
- Draai de front-to-back-knop naar rechts om de laser te verplaatsen overtop de cantilever chip. Wanneer de laser de chip bereikt zal worden geblokkeerd en niet meer zichtbaar zijn. Draai alleen de knop een paar keer.
- Draai de front-to-back-knop tegen de klok in totdat de laser spot weer verschijnt. De laser is nu aan de rand van de chip.
- Draai de links-naar-rechts knop om de laser op de cantilever te positioneren. Als de laser gaat over de cantilever het zal verdwijnen en weer verschijnen in snelle opeenvolging. De laser spot moet zichtbaar zijn in de matglazen kap waar de fotodiode-later zullen zitten zijn.
- Draai de front-to-back-knop tegen de klok in naar de plek langs de cantilever te verplaatsen naar de punt tot aan de plek op het matglas verdwijnt.
- Draai de front-to-back kloksgewijs slechts licht om de laser te plaatsen zodat behalve kijken op de cantilever tip. De laser spot verschijnt weer op het matglas.
LET OP: Dit is de laser methode voor positiebepaling voor duikplank uitkragingen. Voor driehoekstabilisators, de uitlijning proces enigszins verschilt.
- Zodra de laser is uitgelijnd, houdt het podium lift motor in de stand "open" voor 10 sec om voldoende ruimte tussen de cantilever en de steekproef te waarborgen bij het bevestigen van het monster aan de AFM.
- Plaats monster op de KPFM monster podium. Aard het monster met behulp van een koperen draad. Sluit de juiste draden van de AFM om het monster podium. Sluit de sTage aan de AFM. In de meeste gevallen het podium wordt op zijn plaats gehouden met behulp van magneten.
- In de AFM software, tunen beginnen de cantilever en vervolgens aanpak van de cantilever tip om het monster. Ervoor zorgen dat afwikkeling van de tijd is ingesteld op niet meer dan 10 msec, en dat naderingssnelheden niet meer bedragen dan 2,0 micrometer / sec om tip schade te voorkomen.
- Zodra de cantilever tip is op het monster oppervlak, selecteer een imaging venster grootte en ideaal beeldgebied. Optimaliseren I en P winsten samen met de cantilever setpunt zodat topografische beeldvorming wordt geoptimaliseerd.
- Zodra topografische beeldvorming is geoptimaliseerd, zet KPFM module (FM of AM-modus, hier gebruiken FM-modus). Opgemerkt zij dat KPFM beeldvorming is zeer uitdagend buiten 5 urn x 5 micrometer afbeeldingsvenster. Ook voor een optimale KPFM beeldvorming, gebruik een 512 x 512 resolutie met langzame scan snelheden (0,02-0,05 lijnen / sec).
- Voor FM-KPFM (instellingen die niet ACAFM), stelt u de schijf procent tussen de 5-10%. Stel de cantilever frequency tussen 1-5 kHz met een bandbreedte van 2 kHz. I en P winsten voor de FM-KPFM instellingen tot 0,3%.
- Variëren signaalbandbreedte en I en P winsten tussen monster oppervlakken. SP beeldvorming te optimaliseren, signaalbandbreedte verder aanpassen en I en P winsten tot optimale beelden te verkrijgen. Het aanbevolen bereik van I en P winsten zijn 0,22-0,35%.
- Verwerkt en geanalyseerd verzameld KPFM beelden met behulp van post-beeldbewerkingssoftware SP gegevens te verzamelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De mogelijkheid om SP meten met KPFM berust op het beginsel dat zowel het monsteroppervlak en cantilever tip geleidend enigszins. Roestvrij staal en goud gehandeld als geleidende oppervlakken waarop MRSA werden vastgemaakt. KPFM beelden werden genomen van 15 MRSA-cellen op beide oppervlakken met 512 x 512 resolutie, en met scan gebieden, variërend van 5 x 5 micrometer tot 10 x 10 micrometer. Scanning werd uitgevoerd met lijn snelheden variërend van 0,02 lijnen / sec tot 0,05 lijnen / sec. Daarom, met 512 datapunten verzameld per lijn en 512 lijnen te scannen, scan tijden varieerden van 2.84 uur tot 7.11 uur. De soorten beelden verzameld te zien in figuur 2. KPFM werkt met dubbele frequentie, en als zodanig zijn topografische beelden gelijktijdig verzameld, samen met gegevens over de elektrische eigenschappen van het oppervlak. Thermische filters werden aangebracht op kaarten SP om gemakkelijker te onderscheiden kleine veranderingen in oppervlaktepotentiaal (figuur 2). Gegevens van SP kaarten wzoals geanalyseerd post-image processing software om de gemiddelde oppervlakte potentials en standaarddeviaties te bepalen. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van R Open Source statistisch programma. Student t-tests werden uitgevoerd om groepen te vergelijken met P <0,05 significant worden beschouwd.
SP beelden werden geanalyseerd om microbiële membraanoppervlak waarde te bepalen. Deze werden vervolgens vergeleken met de groei op de verschillende substraatoppervlakken. Dit werd gedaan om te bepalen of het type oppervlak een effect op microbiële membraanoppervlak potentieel had. Aanvankelijk probeerden we MRSA cellen incuberen statisch gedurende 3 uur op de substraatoppervlakken. Echter, niet aangesloten microben waren zichtbaar onder de AFM. SP gegevens schoon en poly-L-lysine gefunctionaliseerde oppervlakken werd bepaald uit 5 x 5 urn gescande gebieden. SP-scans van de kale roestvrij staal en blote goudsubstraten toonde algemene negatieve oppervlaktepotentialen (-0,045 ± 0,057 V en -0,126 ± 0,052 V, respectievelijk, P = 0,047, figuur 3). Poly-L-lysine werd gebruikt om het oppervlak te functionaliseren om ze gunstiger celhechting maken. Gefunctionaliseerde oppervlakken toonde een verschuiving naar positieve oppervlaktepotentialen roestvrij staal en goud oppervlakken (0.133 ± 0.063 V en 0,126 ± 0,030 V, respectievelijk figuur 3). Vervolgens hebben we de membraanpotentialen van MRSA onderzocht poly-L-lysine gefunctionaliseerde roestvrij staal en goud oppervlakken. Het bleek dat MRSA celmembraan potentialen varieerde roestvrij staal en goud oppervlakken. Roestvrij stalen oppervlakken geleid tot aanzienlijk grotere positieve membraan SP voor cellen in vergelijking met hun goud tegenhanger. Bijvoorbeeld, de SP MRSA cellen van positief naar negatief SP. MRSA zich positief SP op roestvrij stalen oppervlakken SP 0,160 ± 0,022 V en SP van -0,025 ± 0,016 V op gouden ondergrond (P <0.001).
Om de volledige capaciteiten van deze KPFM, een voorbeeld toneneen stap hoogte grafiek van MRSA op roestvrij staal is voorzien (figuur 4). Dit toont het verschil in oppervlakte potentiaal tussen het substraatoppervlak en de microbiële membraan.
Figuur 1. Het werk principes van atomic force microscope (i) en Kelvin sonde force microscope (ii) Overgenomen met toestemming van (15). De basisconfiguratie van AFM wordt weergegeven in (i). In AFM, wordt een scherpe punt aan een cantilever door elektrochemische depositie bevestigd. Mikromasch platina beklede geleidende DPE (geluidsarm) cantilevers werden in dit experiment had afmetingen van 210 x 30 urn, 80 kHz resonantiefrequentie en veerconstanten van 2,7 N / m. Uitkragingen werden om zorgen voor een gemakkelijke bediening voor een grotere chip bevestigd. Eenmaal geassembleerd in de AFM, is een laser gericht op de cantilever tip. Ombuigingen in de cantilooit tip worden gedetecteerd door een fotodiode. Afwijkingen worden gebruikt om topografische beelden genereren. (II, a, b, c) toont het werkingsprincipe van KPFM. De cantilever is dicht genoeg gebracht aan het oppervlak mogelijk te maken elektrisch contact optreedt. Verschillen in de oppervlaktepotentialen tussen de tip en het oppervlak veroorzaken de tip om te buigen. Een gelijkspanning te corrigeren voor deze afwijking. Deze DC toegepaste spanning is gelijk aan de oppervlakte potentiaal van het substraatoppervlak. Afhankelijk van het type van imaging-modus gebruikt (lift, AM, FM), dit werkingsprincipe lichtjes verschilt. Figuur 1 (ii) is gewijzigd van 15.
Figuur 2. Representatieve topografie en oppervlakte potentiaalkaarten van MRSA op poly-L-lysine gefunctionaliseerde roestvrij staal en goud substraten. Afbeeldingen (i en iii) er representatieve topografie beelden van MRSA cellen op roestvrij staal en goud oppervlakken, respectievelijk. Afbeelding afmetingen te zien in de X- en Y-as van deze beelden samen met een overeenkomstige gekleurde hoogteprofiel. (Ii en iv) tonen de corresponderende SP kaarten van de MRSA op hun oppervlakken. Standaard 'gouden' kleur filters werden toegepast op beelden topografie terwijl thermische filters werden toegepast op beelden SP om gemakkelijker te onderscheiden van kleine veranderingen in de SP. Opgemerkt zij dat de SP van substraatoppervlakken niet homogeen. SP bleek te heterogeen worden gedistribueerd met duidelijke positieve en negatieve gebieden op beide substraat oppervlakken. Dit kan worden gezien rond MRSA cellen waar heterogene SP's worden waargenomen op roestvrij staal en goud substraten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
52327 / 52327fig3highres.jpg "/>
Figuur 3. oppervlaktepotentiaal van substraatoppervlakken en MRSA celmembranen. Figuur 3 toont de overeenkomstige KPFM gegevens van roestvrij staal (hier aangeduid als SS) en goud oppervlakken, evenals gegevens uit 15 cellen. Sterretjes geven significante verschillen tussen de monsters met het aantal sterretjes overeenkomt met de vergeleken monsters. MRSA gegevens verzameld uit cellen aan gefunctionaliseerde oppervlakken na 30 minuten incubatie. Dit werd gedaan door het feit dat geen cellen bleken te hechten aan het kale substraatoppervlakken na 3 uur.
Figuur 4. Stap hoogte oppervlaktepotentiaal beeld van MRSA op poly-L-lysine gefunctionaliseerde roestvrij staal. Met behulp van post-software voor beeldverwerking, werd een stap in hoogte grafiek gegenereerd om de capabili tonenbanden van de software, en het merkbaar verschil in SP tussen het substraatoppervlak en het celmembraan. Het dwarsdoorsnedegebied gekozen is vertegenwoordigd in de overeenkomstige SP kaart met de grijze lijn. Een verschuiving van 0,15 V op het celoppervlak tot 0,21 V op het substraat oppervlak is duidelijk te zien. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Vennootschap | Probe Type | Spring Constant (N / m) | Resonantiefrequentie (kHz) | Cantilever Afmetingen | Tip Apex Diameter |
| Asiel Onderzoek | AC240TM-R3 | 2 | 70 | Lengte = 240 micrometer Width = 40 micrometer </ Td> | 28 nm |
| Bruker AFM Probes | SCM-PIT | 2.8 | 75 | Lengte = 225 micrometer Width = 28 micrometer | 20 nm |
| Mikromasch | Geleidende DPE (Low-Noise) uitkragingen | 2.7 | 80 | Lengte = 210 micrometer Width = 30 micrometer | 40 nm |
| Nano en Meer USA | PTSI-NCH | 42 | 330 | Lengte = 125 micrometer Width = 30 micrometer | > 25 nm |
| Nanoscience Instrumenten | AppNano Geleidende tapping mode AFM Probes. | 40 | 300 | Lengte = 125 micrometer Width = 35 micrometer | 30 nm |
| Nanoscience Instrumenten | AppNano Geleidende tapping mode AFM Probes. | 40 | 300 | Lengte = 125 micrometer Width = 35 micrometer |
Tabel 1. Bedrijven met een breed scala van KPFM sondes. Een verscheidenheid van bedrijven bieden nu KPFM tip met wisselende tip top diameters, veerconstanten en resonantiefrequenties. Tip maatwerk is vrijwel onbeperkte, met bedrijven gewoonlijk met anderen te uitkragingen met aangepaste specificaties bouwen voor een beoogde experiment. De meeste KPFM sondes zijn platina gecoate siliciumnitride. Platinum biedt geleidende functionaliteit aan de cantilever. Andere veel voorkomende bekledingsmaterialen: iridium, platina + iridium, en goud. De meeste KPFM tips kan ook als alternatief worden gebruikt voor elektrische kracht microscopie (EFM). Tip top is belangrijk voor KPFM uitkragingen. Grotere tips diameter offeren hogere resolutie topografie beeldvorming voor minder elektrische ruis. Omgekeerd kleinere tips diameter (<25 nm) bieden verbeterde image topografie resolutie, maar zijn meer vatbaar voor elektrische ruis. Voor deze studie, onderzoekers gebruikt Mikromasch gedragive DPE (low-noise) uitkragingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KPFM werd gebruikt als een nieuwe techniek voor het verkrijgen van elektrische oppervlakteweerstand gegevens. Het is algemeen gebruikt als een methode voor de behandeling ladingsverdeling chemie en is pas sinds kort worden voor de studie van biologische systemen micro- en nano-schaal. Uit de verzamelde gegevens bleek dat microben leek niet gemakkelijk hechten aan roestvrij staal en goud reinigen oppervlakken, zelfs na 3 uur van statische incubatie. Poly-L-lysine gefunctionaliseerde oppervlakken liet snelle microbiële hechting na 30 min. Langere incubatie tijden van microben op gefunctionaliseerde oppervlakken geleid tot cel overbevolking op monster oppervlakken, en een slechte topografie afbeeldingen. Oppervlak functionalisering geleid tot een verschuiving van negatief naar positief SP SP voor roestvrij staal en goud oppervlakken. Eerdere studies hebben aangetoond dat micro-organismen meestal negatief SP door het sekwestreren van negatief geladen ionen rond cellen osmotische en ionenbalans 23 handhaven. Het is ook bekenddat de aanwezigheid van fosfaatgroepen in Gram-negatieve microorganismen en teichoïnezuren in Gram-positieve micro-organismen leidt verder tot de vorming van negatieve SP 24. Kennis van de elementaire chemie van Gram-positieve en negatieve celmembranen leidde ons om te veronderstellen dat de positieve substraat SP zou leiden tot een snelle microbiële beslag. Zoals blijkt uit de figuren 2-4, dat er een grote verschuiving van positief naar negatief MRSA cel SP op roestvrij staal en goud substraten resp. Microbiële beslag zou in eerste instantie heeft plaatsgevonden vanaf de vastlegging van negatieve ionen rond het membraan. Bij het wassen van de cellen en hen te laten drogen op het substraat oppervlakken, konden we zijn wassen deze ionische media weg. Ook moet worden opgemerkt dat KPFM gegevens worden alleen inclusief de buitenste celwand gebieden van de Gram positieve (MRSA) cellen. Het is in sommige gevallen gebleken dat microorganismen celmembraanpotentiaal kan veranderen van de aanwezigheid van catienic antimicrobiële peptiden of andere stressoren 8.
Het enige nadeel van KPFM vergelijking met standaard zeta potentiaal metingen op microbiële celkweken is dat KPFM de verzamelde gegevens wordt gedaan op dode en gedroogde cellen. KPFM werd gebruikt om algemene trends op het celoppervlak mogelijke verschuivingen met betrekking tot verschillende gehechtheid substraat oppervlakken te onderzoeken. De toepassing van DC spanningen aan de cantilever tip (F es tegen te gaan), samen met de eis van een geleidend monster oppervlak, beperken standaard KPFM open-air imaging. Imaging in polaire vloeistof momenteel niet mogelijk met standaard KPFM, en daarmee de beeldvorming van levende cellen met behulp KPFM is als nog mogelijk. Ontwikkelingen van de nieuwe open-loop en dubbele frequentie KPFM modes hebben aangetoond belofte in hun vermogen om het oppervlak in lage-ionische oplossingen 18-20. Het is onze hoop dat in de toekomst deze technologie wordt verder ontwikkeld zodat de beeldvorming kan worden gedaan op live celculturen. De beeldvorming van de cellen in een meer natuurlijke omgeving zou ongetwijfeld leiden tot het genereren van meer accurate en realistische celmembraan SP data. Voor deze studie wilden we deze technologie toe te passen op een nieuwe wijze om microbiële celmembraan potentialen te meten, alsmede bestuderen de hechteigenschappen van MRSA op een medisch relevante oppervlak. Veranderingen in microbiële membraan SP waargenomen bij incubatie op verschillende substraatoppervlakken. Dit kan betekenen dat type substraat cellulair metabolisme beïnvloeden. De hoop is dat deze voorlopige gegevens leiden tot de productie van nano-coatings met inherente elektrische ladingen die kunnen worden aangebracht op oppervlakken of medische apparatuur (met inbegrip van andere materialen zoals bandages en gazen) om microbiële aanhechting te voorkomen. De in dit artikel beschreven protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen begrijpen van de principes van KPFM en tonen manieren waarop het kan worden toegepast om te meten en te creëren SP kaarten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
- Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
- Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
- Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
- Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
- Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
- Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
- Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
- Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
- Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
- Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
- Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
- Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
- Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
- Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
- Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
- Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
- Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
- Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).
