Abstract
Yüzey potansiyel yüzeyleri alt tabakaya mikroorganizmaların yapışmasında bir rol oynayan bir yaygın olarak gözardı edilen fiziksel özelliğidir. Kelvin prob kuvvet mikroskobu (KPFM) nano-ölçekte yüzeyler arasındaki temas potansiyeli farkı ölçen atomik kuvvet mikroskobu (AFM) bir modül. AFM ile KPFM kombinasyonu yüzey potansiyeli ve örneğin bakteriyel hücreler gibi biyolojik örneklerin topografik haritaları aynı anda oluşturulmasına izin verir. Burada, biz böyle paslanmaz çelik ve altın gibi tıbben ilgili yüzeylere yapışma mikrobiyal yüzey potansiyelinin etkilerini incelemek için KPFM istihdam. Yüzey potansiyel haritalar farklı malzeme yüzeylere mikrobiyal membranların yüzey potansiyeli ortaya çıkmıştır. Bir adım yükseklik grafiği substrat yüzeyi ve mikroorganizmalar arasındaki sınır bölgede yüzey potansiyeli farkı göstermek için üretildi. Hücre zarı yüzeyi potansiyelindeki değişim değişim ile bağlantılı olmuşturhücre metabolizması ve hareketlilik s. Bu nedenle, KPFM çeşitli alt-tabaka yüzeyine yapışmasından sonra mikrobiyal zar yüzeyi potansiyeli değişiklikleri incelemek için kullanılabilir güçlü bir araç oluşturmaktadır. Bu çalışmada, KPFM kullanılması ile paslanmaz çelikten ve altın bireysel metisilin dirençli Staphylococcus aureus USA100 hücre yüzey potansiyelini karakterize etmek için prosedürü gösterir.
Introduction
Biyofilm kaldırılması için inatçı ve hastalık bulaşma ve antimikrobiyal direnç oranlarının artışı yol gibi ekipman yüzeylerinde ve deri yaraları üretilen Biyofilmler medikal sektörü için bir sorun mevcut. Ek biyofilm oluşumunda ilk adım olduğunu ve onun tersinirliği 1-3 dolayı en kritik adımdır. Yüzey yüzey özellikleri mikrobiyal eki çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu tür yüzey sertliği, gözeneklilik, pürüzlülük ve hidrofobiklik gibi faktörler mikrobiyal ek gerçekleştirilmesi gösterilmiştir; Ancak, mikrobiyal yapışma üzerinde yüzey yüzey potansiyeli (SP) rolünü inceleyen çok az araştırma 4,5 yapılmıştır. Negatif yüklü yüzeyleri mika, silikon, ve altın 6 Bacillus thuringiensis sporlarının bağlanmasını önledikleri varsayılır. Hücre zarı potansiyelinde değişiklikler hücre bağlanması ve hareket kabiliyeti 5,7 değişim göstergesidir. Bu elektrik Hom gözlemlenmiştirogeneous yüzeyler daha kolay bir şekilde mikrobiyal yapışma 5 destekler. Nano bakteri yüzey potansiyelini karakterize, anti-biyolojik kirlilik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir böylece çeşitli yüzeylere bakteri yapışma kinetiği anlamak için yeni bir yol sağlar, ve olabilir. Böyle elektroforetik ışık saçılması, zeta potansiyeli ve izoelektrik nokta belirleme gibi bakteri, elektro kinetik tanımlamak için kullanılan diğer yöntemlerin aksine, Kelvin prob kuvvet mikroskobu (KPFM) tek tek hücrelerin yerine tüm kültürlerin 8-11 incelenmesi için izin verir. Hücre-hücre karşılaştırmak veya yüksek doğruluk ve hassasiyet ile elektriksel özelliklerini biyofilm isteyen bu faydalıdır.
KPFM atomik kuvvet mikroskobu (AFM) bir modül. AFM tarama tünelleme mikroskobu (TTM) 12 doğrudan bir sonucu olarak geliştirilmiştir. STM kullanarak ilk yayınlanan görüntüleri 1982 12 Gerd Binnig ve Heinrich Rorhrer tarafından yapılmıştır 12 STM kullanmayı denedi biyologları heyecanlı yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etkileri. STM ayrıca özel prob ipuçları 13 kullanılarak sıvı yapılabilir. Bu Lindsay ve ark., Altın elektrotlar 13, 10 mM HClO4 ve su içinde görüntü DNA molekülleri STM ve AFM kullanılan ile gösterilmiştir. KPFM ligandları 26, DNA ve protein analizi 25 ve biyomoleküllerin etkileşim yüzey potansiyellerinin belirlenmesinde gösterilmiştir.
KPFM AFM iletken konsol ucu ve bir ideal olarak iletken numune arasındaki temas potansiyeli farkı (CPD) ölçerek 14,15 (i Şekil 1) çalışır. Numuneler mutlaka iletken (yani, biyolojik sampl olmak zorunda değilsinizes). Görüntüleme mika, cam ve uzun iletken olmayan yüzey incedir ve bir alt iletken malzeme 6,7 olduğu gibi silikon yüzeyler (iletken olmayan) ile gerçekleştirilebilir. SMG yüzeyi potansiyel gerilimi eşdeğerdir ve negatif elektron yükünün bölü ucu (φ ucu) ve örnek (numune φ) arasındaki iş fonksiyonları farkı olarak tarif edilebilir (- e). İletken bir AFM ucu bir örnek, yüzeye yakın getirildiğinde bağlı Fermi enerjileri arasındaki fark (Şekil 1, II, a) 15 ile bir elektrostatik kuvvet (F lar) oluşturulur, (d mesafesinde ayrılmış). Bu noktada, uç ve örnek (E v) vakum enerjileri denge ve hizalanmış bulunmaktadır. Yakın örnek yüzeyine ucu getirerek üzerine, uç ve örnek yüzeyi paralel plakalı kapasitörler (Şekil 1, ii b gibi elektrik kontağı ve hareket girer 14,15. Noktada uç ve numune yüzeyinden Fermi enerjileri bir kalıcı-hal dengeye ulaşması aynı hizaya gelirler ve (Şekil 1, ü, b). ucu ve örnek yüzeyi nedeniyle E v 'nin ve iş fonksiyonları bir fark tahsil edilecektir ve V SMG oluşturacaktır. Nedeniyle oluşan V CPD elektrik temas alanı üzerinde bir F es görür. Bu kuvvet daha sonra (Şekil 1, II, c) oluşan V CPD ile aynı büyüklüğe sahip ucuna bir dış V DC uygulaması ile etkisiz kılınır. Bu DC gerilim elektrik temas alanında yüzey yükü ortadan kaldırır uygulanan ve V CPD F es ortadan kaldırmak için gerekli V DC miktarı sa arasındaki iş fonksiyonları farka eşittirmple yüzey ve uç 15. Bu ucu iş fonksiyonu bilinen ve üretici tarafından sağlanan not edilmelidir. Tüm KPFM yöntemlerinde, bir AC voltajı (V AC, yaklaşık 100-500 mV) de uç ve örnek 14 arasındaki salınım elektrik kuvvetlerinin üretilmesi için, uç uygulanır. V CPD ve / veya F es değişiklikleri ölçerken daha iyi çözünürlük sağlar. Bu bağlamda, frekans veya elektrik salınım amplitüdünün değişiklikler V DC ile düzeltilir ve potansiyel harita oluşturulabilir yüzey olabilir. Bu haritaların belirli alanlarda elde edilen veriler daha spesifik topografik özellikler hakkında bilgi sağlamak için elektrik analiz edilebilir.
(1) kaldırma modu, (2) genlik modülasyonu (AM) modu, ve (3) frekans modülasyonu (FM) modu 14,16: KPFM üç modda çalıştırılabilir. Asansör modu ilk inc olduKPFM ve arnation. Asansör modu sallanmaktadır ucu topografik görüntü elde etmek yüzey boyunca sürüklenen olduğu bir iki-geçişli yöntemine dayanır. İkinci geçişte için ucu numune üzerinde önceden belirlenmiş bir mesafeyi yükseltildiğinde (10-100 nm) ve tekrar aynı alan boyunca taradı. Nedeniyle AM- ve FM-KPFM göre bu iki taramalı yöntemiyle, asansör moduna, görüntü alımı için uzun zaman alır. Yüzeyden ucu Raising sadece uzun menzilli F es ölçülür sağlar. Ayrıca, topografya ve yüzey potansiyel ölçümleri arasındaki çapraz konuşma artan yanal çözünürlük ve hassasiyet pahasına decoupled.
AM-KPFM aynı anda numune topografya ve yüzey potansiyeli (tek-geçişli tarama) 14 ölçmek için çift frekansları kullanılarak yanal çözünürlük ve hassasiyeti artırır. AM modunda ise, konsol mekanik genel olarak% 5, ilk rezonans frekansı altında salınım (f 0), ve elektrik olarak salınım (tikinci rezonans frekansı (f 1) bir V AC) hrough. Nedeniyle F es ve V CPD değişikliklere f 1 genlik değişiklikleri, yüzey potansiyel ölçüm verileri verirken topoğrafik verilerin nesil f 0 kurşun genlik değişiklikler. fnin 0 ve konsol f 1 çapraz konuşma 14 en aza indirilir sinyal önemli frekansları ve enerji ile ayrılır. AFM başkanı elektroniği kutusu (HEB) hem topografik vermek ve bir tarama aynı anda potansiyel verileri yüzey iki sinyalleri ayırır. FM-KPFM biyolojik yüzeyler 14 çözünürlük daha fazla AM-KPFM geliştirir. FM-KPFM elektrostatik kuvvet geçişlerini yerine elektrostatik kuvvet (F es) 15 değişiklikleri ölçen AM-KPFM daha farklı çalışır. AM modunda gibi, FM modu çift frekansları ve SINGL kullanırE-pass tarama mekanizması topografik elde etmek ve aynı anda 14 potansiyel verileri yüzey. FM modunda, konsol mekanik f 0 sallanmaktadır ve elektriksel düşük modifiye frekansta salınımlandırılan (mod f, tipik 1-5 kHz). Elektrostatik etkileşimler üzerine, 0 ve f mod karışımı f 0 ± f mod f yan bantları üretimi için. Bu yan bantlar elektrostatik kuvvet değişikliklere çok hassastırlar ve AFM HEB yoluyla f 0 ayrılabilir. FM-KPFM elektrostatik kuvvet geçişlerini değişiklikleri ölçen bu yana, ipuçları apeks şekil ve bakım / bütünlük. Genel yüzeye potansiyel çözünürlük 14, 15 kritik rol oynamaktadır AM kullanarak potansiyel çözünürlük Yüzey ve FM modları yanal 1 nm aralığında 14 olan -16. Bu KPFM görüntüleme içinde (polar olmayan sıvılar içinde yapılabilir, ve en son olarak, düşük iyonik (<10 mM), polar sıvılar içinde yapılabilir gösterilmiştir unutulmamalıdırBöyle MilliQ su gibi bir DC önyargı uygulama kalmayabilir, bir önyargı geribildirim gerekmez açık döngü KPFM modları); Ancak, KPFM görüntüleme henüz kutup çözümleri 17-20 canlı hücrelerde yapılması gerekir. Sıvı SP görüntüleme ile ilgili daha başka sorunlar çözümler genel olarak muhafaza hücreleri için kullanılan (yani, fosfat tamponlu tuzlu su) Faradaysal reaksiyonları, önyargı kaynaklı yük dinamikleri ve iyon difüzyon / yeniden dağıtma 20 yol açacak mobil iyonlar, yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Bu durumda, bu deney için, ölçümler ortam koşullarında poli-L-lisin işlevselleştirilmiş paslanmaz çelik, altın yüzeyleri üzerinde kurutuldu ve ölü MRSA hücrelerden alındı. Görüntüleme önceden kurutulmuş ya da yüzey 20 üzerine immobilize edilmiş biyolojik örnekler üzerinde hava veya vakum koşullarında gerçekleştirilebilir. Nemli koşullar da yüzeyleri 6 KPFM görüntüleme etkilediği gösterilmiştir.
Bu çalışmada, biz FM-KPFM istihdamve AFM poli-L-lizin fonksiyonlandırılmış paslanmaz çelik ve altın yüzeylere metisilin dirençli Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) eki SP rolünü incelemek için. MRSA son zamanlarda nedeniyle birçok β-laktam antibiyotikler ve sefalosporinlere 21 olan doğal seçilen direnci bir çok ilaç dirençli (MDR) "Superbug" olarak statüsünü topladı. MRSA enfeksiyonları gibi vankomisin ya da uzun süreli tedavilerde 22 olarak kullanılamaz, bu nedenle, insanlarda daha yüksek toksisite düzeyine sahip ve oksazolidinonların gibi daha sert antimikrobik kullanımına yol açan, hemen tedavi etmek için daha zorlu zordur ve çok büyüktür. Paslanmaz çelik tıbbi alaka ve Altın karşılaştırmalı metal olarak kullanılan vb derialtı iğneler, bedpans, kapı kolları, lavabo, bir malzeme olarak yaygın kullanımı nedeniyle seçildi. FM-KPFM mikrobiyal zar SP yüzeylere eki üzerine değişirse incelemek için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Züccaciye ve Kültürler 1. Hazırlık
- Bu deneyde geçmeden önce,% 5 koyun kanlı agar (SBA) MRSA yetiştirmek için plakaları hazırlamak. 37 ° C'de 24 saat süre ile SBA inkübe edin. Bu süreden sonra, tek bir iyi izole edilmiş koloni sıvı ortam içine eden aşılamalar için kullanılmak üzere mevcut olması gerekmektedir. 2 ay - Mağaza 1 4 ° C'de tek koloniler ile SBA plakaları çizgili.
Not: koyun kanı agar plakaları 20 arasında ihtiva eden önceden hazırlanmış paketlerde gelir - üretici göre 25 plakaları ve tipik olarak hac koyun kanı% 5 w / ilavesi ile bir triptik soya agar baz oluşur. - % 1 glukoz ve% 0.1 NaCI ile takviye edilmiş triptik soya suyu (TSB) içinde, 500 ml olun. Bundan sonra, toplamak ve 2 cam test tüpleri temizleyin. Otoklavlanabilir kapaklar Test tüpleri için kullanılamaz iseniz, bir kap olarak alüminyum folyo kullanın. Otoklav TSB ve 1 ml pipet uçları bir kutu ile birlikte deney tüpleri.
- Bir biyogüvenlik kabini altında veya bir Buns yakınındakibrülör tr, pipet önce 5 ml otoklava deney tüpleri içine TSB otoklava. Yeterli zamanı sağlamak için dikkatli olun TSB izin verilen ve test tüpleri oda sıcaklığında soğumaya olmuştur. Önceden çizgili% 5 SBA plaka, 6 ml TSB suyu içine tek bir koloni aşılamak. Bir MRSA içerecektir ve ikinci bir test tüpü sterilizasyonu sağlamak için bir negatif kontrol olarak kullanılır.
- İnoküle edilmiş TSB test tüpleri alın ve 37 ° C'de 24 saat süre ile 200 rpm'de bir karşılıklı inkübatör içine yerleştirilir. Herhangi bir büyüme kontrol test tüpü içinde meydana gelmiş olmalıdır Bu süre sonra, mikrobiyal büyüme MRSA test tüpünde açık olmalıdır.
- Taze TSB 6 ml 24 saat kültür ve pipetle 1 ml alın. 200 rpm'de 6 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
- Pipet 1.5 ml mikrofüj tüpüne 6 saat alt kültürün 1 ml olmuştur. 850 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı ve deiyonize H2O, 1 ml pelet yeniden askıya Santrifüj, tekrar, ve tekrar askıya.
- Paslanmaz çelik ve altın AFM örnek diskleri (20 mm ve 10 mm çapları) alın ve deiyonize H 2 O 5 ml her tarafını temizlemek Forseps ile dominant elin örnek diskleri tutun ve örnek diskin her iki tarafında 5 ml pipetle için subdominant elinizi kullanın. 1 dakika süreyle sese tabi tutularak ve ardından deiyonize H2O 20 ml ihtiva eden bir çanak içinde her iki tarafında yer örnek diskleri yıkandıktan sonra.
- Sonication kullanım forseps sonra beher örnek diskleri kaldırmak için. Bir kağıt havlu üzerine açık bir Petri plaka kenarına karşı 60 ° açıyla eğilmek böylece diskleri yerleştirin. Kurutma diskleri kapsayacak Petri plaka kapağını kullanın. Diskler devam etmeden önce tamamen kurumasını bekleyin. 8 saat - Kurutma süresi 4 arasında değişebilir.
- Kuruduktan sonra, bir Petri plaka içine örnek diskleri yerleştirmek için forseps kullanabilir.
- İsteğe bağlı olarak, (herhangi bir malzeme ile örnek disklerin yüzeyleri işlevselleştirilmesiörneğin, kolajen, hiyalüronan, gümüş nano-parçacıklar, vs.).
- Bu deney için, kaplamak için poli-L-lisin alt-tabaka yüzeyi kullanır. Için poli-L-lisin işlevselleştirme, pipet 200 - örnek disklere (lH 2 O),% 0.1 poli-L-lisin, 400 ul, ve bir Petri tabağına ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
- 1 saat sonra, numune diski tutun ve deiyonize H2O 1 ml yıkama için forseps kullanabilir Adım 2.2 açıklandığı gibi kağıt havlu üzerinde kurumaya bırakın.
- 2x yıkanmış yeniden askıya hücreleri alın ve 200 plaka - bir biyogüvenlik kabini içinde örnek disklere 400 ul. Örnek diskler ve poli-L-lizin ile kaplanmış ise, oda sıcaklığında, 0.5 saat süre ile inkübe edilir.
- Örnek diskler üzerinde hücrelerin inkübe edildikten sonra, deiyonize H2O, 1 ml ile hafifçe örnek diskleri yıkama Diskler görüntüleme önce gecede kurumasını bekleyin.
3. KPFM Görüntüleme
NOT: Bu deney için,bir Agilent 5500 serisi ILM-AFM kullanın.
- AFM başlatmak için, AFM HEB ve MAC III kontrolörü ile birlikte bilgisayar ünitesi açın. Açık AFM görüntüleme yazılımı (örneğin, Agilent'in PicoView). Başlangıçta ACAFM veya hangisi doğru tanımlama aralıklı temas modunda görüntüleme için AFM üzerinde seçtiğinizden emin olun.
- Dominant elin AFM forseps kullanarak ve subdominant el açık yaylı klips tutucu tutarak, baş-parça içine KPFM konsol yerleştirin. Taşıma ve (en az 5500 ILM-AFM üzerine) Bu birim olarak AFM AFM baş parça aktarılması X, Y ve Z tarama directionalities kontrol kırılgan piezo kristal birimi içerir dikkatli olun.
NOT: Bu durumda kullanılan KPFM konsollar Mikromasch iletken DPE 2.7 N / m 80 kHz ve yay sabitleri ortalama rezonans frekansları ile (düşük-gürültü) konsollar vardı. Bu rezonans frekansları ve yay sabitleri ile konsollar nedeniyle kullanım kolaylığı için seçildi.Daha büyük bir yay sabitleri ve daha yüksek rezonant frekanslarına sahip konsol aynı zamanda görüntüleme için kullanılabilir. - Dikkatle AFM içine baş parça yüklemek ve (iki tel takılı olması gerekir bu durumda: lazer ışığı ve sahne asansör motorunun) uygun kabloları bağlayın.
- Konsolun ucuna lazer hizalama. Bazı birimler kolay uyum sağlayan bir kamera işlevselliği içerir. Kamera işlevi AFM mevcut değilse sonraki açıklandığı gibi, konsol ucuna align:
- Konsol çip üstünlük lazer taşımak için ön-arka düğmesini saat yönünde çevirin. Lazer çip ulaştığında bloke edilecek ve artık görünür olacaktır. Sadece düğmenin bir kaç kez çevirin.
- Lazer nokta tekrar gelene kadar saat yönünün tersine ön-arka düğmesini çevirin. Lazer çipin kenarında şimdi.
- Konsol üzerindeki lazer konumlandırmak için sol-sağ düğmeyi çevirin. Lazer konsol üzerinde geçerken kaybolur ve i yeniden görünürn hızlı arkaya. lazer nokta fotodiyot ünitesi daha sonra oturup buzlu cam kapak görünür olmalıdır.
- Buzlu cam spot kaybolana kadar uca doğru konsol aşağı noktaya taşımak için saat yönünün tersine önden arkaya düğmesini çevirin.
- Sadece konsol ucunda oturur, böylece lazer konumlandırmak için sadece biraz ön-arka düğmesini saat yönünde çevirin. lazer nokta buzlu cam üzerinde yeniden görünür.
NOT: Bu dalış kartı konsollar için lazer konumlandırma yöntemidir. Üçgen konsol için, hizalama işlemi biraz farklıdır.
- Lazer hizalanmış sonra, AFM için örnek takarken konsol ve örnek arasında yeterli boşluk sağlamak için 10 saniye için "açık" konumuna sahne asansör motoru tutun.
- KPFM örnek sahnede örnek yerleştirin. Bir bakır tel kullanılarak örnek topraklayın. Örnek aşamasına AFM uygun teller bağlayın. S bağlayınAFM için tage. Çoğu durumda sahne mıknatıslar kullanılarak yerinde tutulur.
- AFM yazılımında, melodi konsol ve daha sonra örnek konsol ucu yaklaşımını başlar. Zaman yerleşme fazla 10 msn olarak ayarlanmış olduğundan emin olun, ve bu yaklaşım hızları ucu hasarı önlemek için 2.0 mm / sn aşmamaktadır.
- Konsol ucu numune yüzeyinde sonra, bir görüntüleme penceresi boyutu ve ideal görüntüleme alanını seçin. Topografik görüntüleme optimize böylece konsol ayar noktası ile birlikte I ve P kazançlar optimize.
- Topografik görüntüleme optimize sonra, KPFM modülü açın (FM ya da AM modu, burada, FM modunu kullanın). Bu KPFM görüntüleme 5 mm x 5 mm görüntüleme penceresinin dışında çok zor olduğu unutulmamalıdır. (- 0.05 hatları / sn 0.02) Ayrıca, optimum KPFM görüntüleme için, yavaş tarama hızları ile 512 x 512 çözünürlüğü kullanın.
- 10% - FM-KPFM ayarları için (ayarları ACAFM değil), 5 ila sürücü yüzde ayarlayın. Konsol fr ayarlayın2 kHz bant genişliği ile 5 kHz - 1 arası equency. 0.3% FM-KPFM ayarları için I ve P kazançlar ayarlayın.
- Sinyal bant genişliği ve I ve örnek yüzeyleri arasında P kazançlar Vary. SP görüntüleme optimize etmek için, daha fazla sinyal bant genişliği ayarlamak ve I ve P kazançlar optimum görüntü elde etmek. 0.35% - I ve P kazanımların tavsiye aralığı 0.22 vardır.
- Süreç ve SP verilerini toplamak için post-görüntü işleme yazılımı kullanarak KPFM görüntüleri toplanan analiz eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KPFM kullanarak SP ölçmek yeteneği örnek yüzeyi ve konsol ucu hem bir ölçüde iletken olduğu ilkesine dayanmaktadır. Paslanmaz çelik ve altın MRSA tutunduğu gibi iletken yüzeylere harekete geçti. KPFM görüntüleri 512 x 512 çözünürlükte her iki yüzeylerde 15 MRSA hücreleri alındı ve 5 x 5 um den 10 x 10 mm arasında değişen tarama alanları ile yapılmıştır. Tarama 0.02 satır / sn 0.05 satır / sn arasında değişen hat hızı ile gerçekleştirilmiştir. 512 veri noktaları tarama hattı ve 512 hatları başına toplanan ile nedenle, tarama süreleri 2.84 saat arası 7.11 saat arasında değişmektedir. Toplanan görüntülerin türleri Şekil 2'de görülebilir. KPFM çift frekansları kullanarak çalışır ve bu nedenle, topografik görüntüler aynı anda yüzeye elektriksel özellikleri ile ilgili veriler ile birlikte toplanır. Termal filtreler daha kolay bir yüzey potansiyele (Şekil 2) küçük değişiklikler ayırt etmek için harita, SP uygulanmıştır. SP haritaları Veri wanaliz sonrası görüntü işleme yazılımı olarak ortalama yüzey potansiyelleri ve standart sapmaları belirlemek için. İstatistiksel analizler R Açık Kaynak İstatistiksel Programlama kullanılarak yapıldı. Student t-testi anlamlı kabul ediliyor P <0.05 ile gruplarını karşılaştırmak için yapılmıştır.
SP görüntüleri mikrobiyal membran yüzey potansiyelini belirlemek için analiz edilmiştir. Bu farklı alt-tabaka yüzeyleri üzerinde büyüme ile karşılaştırıldığında daha sonra idi. Bu yüzey tipi mikrobiyal zar yüzeyi potansiyeli üzerinde etkisi olup olmadığını belirlemek amacıyla yapıldı. Başlangıçta biz substrat yüzeylerde 3 saat statik MRSA hücrelerini inkübe çalıştı. Ancak, ekli mikroplar AFM altında görünür. Temiz ve poli-L-lisin işlevselleştirilmiş yüzeyler SP verileri, 5 x 5 um taranmış alanlar belirlendi. Çıplak paslanmaz çelik ve çıplak altın yüzeylerde SP taramaları sırasıyla genel negatif yüzey potansiyelleri (-0,045 ± 0.057 V ve -0,126 ± 0.052 V, gösterdiP = 0.047, Şekil 3). Poli-L-lisin, hücre bağlanması için daha uygun hale getirmek için yüzey işlevsel hale getirilmesi için kullanılmıştır. Fonksiyonlandırılmış yüzeyler paslanmaz çelik ve altın yüzeyler (sırasıyla 0.133 ± 0.063 V ve 0.126 ± 0.030 V, Şekil 3) için pozitif yüzey potansiyellerine bir kayma gösterdi. Biz daha sonra poli-L-lisin işlevselleştirilmiş paslanmaz çelik ve altın yüzeyleri MRSA membran potansiyelleri incelendi. MRSA'nın hücre membran potansiyelleri, paslanmaz çelik ve altın yüzeyleri arasında değiştiği tespit edilmiştir. Altın meslektaşı ile karşılaştırıldığında Paslanmaz çelik yüzeyler hücreler için önemli ölçüde daha büyük pozitif membran SP yol açtı. Örneğin, MRSA hücrelerinin SP olumsuz SPs olumlu geçti. MRSA 0.160 ± 0.022 V SPs ve altın yüzeylerde -0,025 ± 0.016 V SP (p <0.001) paslanmaz çelik yüzeyler üzerinde olumlu SP gösterdi.
KPFM, örnek tüm yeteneklerini göstermek içinPaslanmaz çelik MRSA adım yüksekliği grafik (Şekil 4) 'de verilmiştir. Bu alt-tabaka yüzeyi ve mikrobiyal membran arasındaki yüzey potansiyel bakımından farklılığı gösterir.
Atomik kuvvet mikroskobu (i) ve Kelvin prob kuvvet mikroskobu (ii) (15) izni ile yayımlanmaktadır 1. Çalışma prensipleri Şekil. AFM temel yapılandırma (i) 'de gösterilmiştir. AFM olarak, bir sivriltilmiş uç elektrokimyasal birikimi yoluyla bir dirseğe bağlanmıştır. Mikromasch platin kaplı iletken DPE (düşük-gürültü) konsollar Bu deneyde kullanılan 210 x 30 mm boyutları, 80 kHz frekans rezonans, ve 2.7 N / m yay sabitlerini vardı. Çıkma kolay kullanım için izin vermek amacıyla daha büyük bir çipe bağlandı. AFM monte sonra, bir lazer konsol ucu üzerine hizalanır. Cantil deformasyonlarıHiç ucu fotodiyot ile tespit edilir. Defleksiyonlar topografik görüntüler oluşturmak için kullanılır. (Ii a, b, c) KPFM çalışma prensibini gösterir. Konsol oluştuğu elektrik teması sağlamak için yüzeye yakın kadar getirilir. Ucu ve yüzey arasındaki yüzey potansiyelleri farklılıklar ucu saptırmak neden. Bir doğru akım, bu sapma düzeltmek için uygulanır. Bu doğru akım uygulanan voltaj, alt-tabaka yüzeyinin yüzey potansiyeline eşittir. Görüntüleme modunun tipine bağlı olarak (asansör, AM, FM) bu çalışma prensibi biraz farklıdır. Şekil 1, (ii) 15 ile modifiye edilmiştir.
Şekil 2. Temsilcisi topografya ve poli-L-lizin fonksiyonlandırılmış paslanmaz çelik ve altın yüzeylerde MRSA potansiyel haritalar yüzey. Görüntüler (i ve iii) temsilcisi topografya görüntüleri göstermek sırasıyla paslanmaz çelik ve altın yüzeyler, MRSA hücreleri. Resim boyutları karşılık gelen renkli yükseklik profili ile birlikte, bu görüntülerin X ve Y ekseni de görülebilir. (Ii ve iv) kendi yüzeylerinde MRSA gelen SP haritaları gösteriyor. Standard 'altın' renk filtreleri termal filtreler daha kolay SP küçük değişiklikler ayırt görüntüleri SP uygulanmıştır sırasında görüntü topografya uygulanmıştır. Bu alt-tabaka yüzeyleri SP homojen olmadığı not edilmelidir. SP heterojen iki alt tabaka yüzeyleri üzerinde belirgin pozitif ve negatif alanları ile dağıtılmak üzere bulunmuştur. Bu heterojen SP paslanmaz çelik ve altın yüzeylerde görülür MRSA hücrelerinin etrafında görülebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
52.327 / 52327fig3highres.jpg "/>
Alt tabaka yüzeyleri ve MRSA hücresel membranların Şekil 3. Yüzey potansiyeli. Şekil 3 15 hücrelerinden gelen KPFM paslanmaz (SS burada etiketli) çelik ve altın yüzeyler verileri, yanı sıra, verileri göstermektedir. Yıldız karşılaştırıldığında örneklerin tekabül yıldız sayısı ile örnekler arasında önemli farklılıklar gösterir. MRSA veri inkübasyon 30 dakika sonra işlevselleştirilmiş yüzeylerine bağlanmış hücreler toplanmıştır. Bu, hiçbir hücre 3 saat sonra çıplak alt-tabaka yüzeyine bağlamak için bulunmuş olmasından dolayı için yapıldı.
Poli-L-lisin işlevselleştirilmiş paslanmaz çelik MRSA Şekil 4. Aşama Yükseklik yüzey potansiyeli görüntüsü. Post-görüntü işleme yazılımı kullanarak, bir adım yükseklik grafiği capabili göstermek amacıyla oluşturulanYazılımın bağları, yanı sıra, substrat yüzeyi ve hücre zarında arasındaki SP hissedilir bir fark. seçilen kesit alanı gri çizgi ile ilgili SP harita üzerinde temsil edilmektedir. Substrat yüzeyinde 0,21 V hücre yüzeyinde 0.15 V A vardiya açıkça görülmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Şirket | Probe Tipi | Bahar Sabit (N / m) | Rezonans Frekans (kHz) | Konsol Boyutlar | Apex Çapı İpucu |
| İltica Araştırma | AC240TM-R3 | 2 | 70 | Uzunluk = 240 mikron Genişlik = 40 mm </ Td> | 28 mil |
| Bruker AFM Sondalar | SCM-PIT | 2.8 | 75 | Uzunluk = 225 mikron Genişlik = 28 mikron | 20 mil |
| Mikromasch | İletken DPE (Düşük Gürültü) konsol | 2.7 | 80 | Uzunluk = 210 mikron Genişlik = 30 mikron | 40 mil |
| Nano ve daha fazlası ABD | PtSi-NCH | 42 | 330 | Uzunluk = 125 mikron Genişlik = 30 mikron | > 25 mil |
| Nanobilim Cihazları | AppNano İletken dokunulduğunda Modu AFM Sondalar. | 40 | 300 | Uzunluk = 125 mikron Genişlik = 35 mikron | 30 mil |
| Nanobilim Cihazları | AppNano İletken dokunulduğunda Modu AFM Sondalar. | 40 | 300 | Uzunluk = 125 mikron Genişlik = 35 mikron |
KPFM prob geniş bir yelpazede sunan Tablo 1. şirketler. Şirket çeşitli şimdi değişen uç tepe çapları, yay sabitleri ve rezonans frekansları ile KPFM ucu sunuyoruz. İpucu özelleştirme şirketler genellikle bir amaçlanan deney için özel özellikleri ile konsol oluşturmak için sunan, yakın sınırsızdır. En KPFM probları platin kaplı silisyum nitrür bulunmaktadır. Platin konsol iletken işlevsellik sağlar. Diğer yaygın kaplama malzemeleri iridyum, platin + iridyum, ve altın dahil. Çoğu KPFM ipuçları da alternatif elektrik kuvvet mikroskobu (EFM) için kullanılabilir. Öneri tepe KPFM konsollar için önemlidir. Büyük çaplı ipuçları az elektriksel gürültü yüksek çözünürlüklü topoğrafya görüntüleme kurban. Tersine, daha küçük çaplı ipuçları (<25 nm) teklif topografya görüntü çözünürlüğü geliştirilmiş, ancak elektriksel gürültüye daha yatkındır. Bu çalışma için, araştırmacılar Mikromasch davranışları kullanılanive DPE (düşük-gürültü) konsollar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KPFM elektriksel yüzey verilerinin elde edilmesi için yeni bir yöntem olarak kullanılmıştır. Genellikle kimyada yük dağılımının incelenmesi için bir yöntem olarak kullanılmaktadır ve sadece yakın zamanda mikro ve nano ölçeklerde biyolojik sistemlerin çalışma için uygulanacak başlamıştır. Toplanan veriler biz mikropların kolayca bile statik inkübasyon 3 saat sonra, paslanmaz çelik ve altın yüzeyleri temizlemek eklemek için görünmedi bulundu. Poli-L-lisin işlevselleştirilmiş yüzeyler 30 dakika sonra hızlı bir mikrobiyal eki göstermiştir. Işlevselleştirilmiş yüzeylerinde mikrop uzun inkübasyon süreleri, örnek yüzeyleri ve kötü topografya görüntüleri aşırı kalabalık hücre yol açmıştır. Yüzey fonksiyonlandırmalar paslanmaz çelik ve altın yüzeyler için pozitif SP negatif SP bir kaymasına yol açtı. Önceki çalışmalar, mikroorganizmalar tipik olarak ozmotik ve iyonik denge 23 muhafaza nedeniyle hücrelerin etrafında negatif yüklü iyonlarını bağlamak için negatif SPleri sahip olduğunu göstermiştir. Aynı zamanda, bilinenGram Gram pozitif mikroorganizmalar negatif mikroorganizmalar ve teikoik asit fosfat gruplarının mevcudiyeti negatif SP'leri 24 oluşumuna yol açar. Gram pozitif ve negatif hücre zarlarının temel kimya bilgisi pozitif substrat SP hızlı mikrobiyal eki yol açacağını varsaymak götürdü. Paslanmaz çelik ve altın yüzeylerde MRSA negatif hücre SP'leri pozitiften büyük kayma sırasıyla olduğu, 4 - Bununla birlikte, Şekil 2'de görülebilir. Mikrobiyal eki başlangıçta zarın etrafında negatif iyonların haciz gelen meydana gelmiş olabilir. Hücrelerin yıkanması ve alt tabaka yüzeylerinde kurumaya bırakmak üzerine, biz bu iyonik ortamı yıkayarak olabilirdi. Ayrıca, KPFM verileri gram pozitif (MRSA) hücreleri dış hücre duvarı alanlarının sadece dahil olduğu not edilmelidir. Bu mikroorganizmalar, hücre membran potansiyelinin katyo varlığı üzerine değişebilir bazı durumlarda gösterilmiştirnic antimikrobiyal peptidler veya diğer streslerinin 8.
mikrobiyal hücre kültürlerinde standart zeta potansiyel ölçümleri ile karşılaştırıldığında KPFM bir ana dezavantajı KPFM toplanan veriler ölü ve kurutuldu hücrelerde yapılır olmasıdır. KPFM farklı bağlanma alt-tabaka yüzeyleri ile ilgili olarak, hücre yüzeyi potansiyel vardiyalı genel eğilimler incelemek için kullanılmıştır. DC uygulama konsol ucuna gerilimleri bir iletken numune yüzeyinin gereksinimi ile birlikte, (F es karşı koymak), açık hava için görüntüleme standart KPFM sınırlamak. Polar bir sıvı içinde görüntüleme standart KPFM ile mümkün değildir ve bu nedenle KPFM kullanarak canlı hücre görüntüleme henüz mümkün itibarıyla değildir. Yeni açık-döngü ve çift frekans KPFM modları Gelişmeler düşük iyonik çözümleri 18-20 görüntü yüzeylere yeteneklerine umut vaat etmiştir. O görüntüleme liv yapılabilir, böylece gelecekte bu teknolojinin daha da gelişmiş olduğunu, bizim umudumuzE hücre kültürleri. daha doğal bir ortamda hücre görüntüleme şüphesiz daha doğru ve gerçekçi hücre zarı SP verilerinin üretilmesine yol açacaktır. Bu çalışmada biz mikrobiyal hücre zarı potansiyellerini ölçmek, hem de tıbben uygun bir yüzeye MRSA yapışma özelliklerini incelemek için yeni bir şekilde bu teknolojiyi uygulamak istedim. Mikrobiyal zar SPs değişiklikler farklı substrat yüzeylerinde inkübasyon üzerine gözlendi. Bu, alt tabaka tipi hücresel metabolizmasını etkileyebilir anlamına gelebilir. Temennimiz bu ön veriler mikrobiyal eki önlemek için (örneğin bandajlar ve kompres gibi diğer malzemeler dahil) Tıbbi yüzeyleri veya ekipmana uygulanan olabilir doğasında elektrik ücretleri ile nano-kaplama nesil yol açabilir olmasıdır. Bu makalede içinde açıklanan protokol araştırmacılar KPFM ilkelerini ve ölçmek ve SP haritalar oluşturmak için uygulanabilir hangi gösteri yollarını anlamak için tasarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
- Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
- Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
- Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
- Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
- Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
- Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
- Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
- Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
- Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
- Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
- Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
- Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
- Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
- Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
- Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
- Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
- Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
- Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).
