Abstract
Surface potentiale er en almindeligt overset fysisk egenskab, som spiller en dominerende rolle i vedhæftningen af mikroorganismer til substrat overflader. Kelvin sonde force mikroskopi (KPFM) er et modul af atomic force mikroskopi (AFM), der måler kontakten potentielle forskel mellem overflader på nanoskala. Kombinationen af KPFM med AFM giver mulighed for samtidig generering af overfladen potentiale og topografiske kort af biologiske prøver, såsom bakterieceller. Her beskæftiger vi KPFM at undersøge effekten af overfladen potentiale på mikrobiel adhæsion til medicinsk relevante overflader såsom rustfrit stål og guld. Surface potentielle kort afslørede forskelle i overfladen potentiale for mikrobielle membraner på forskellige materielle substrater. En trin-højde graf blev genereret for at vise forskellen i overfladen potentiale ved en grænse området mellem substratoverfladen og mikroorganismer. Ændringer i cellemembranen overflade potentiale har været forbundet med forandrings i cellulær metabolisme og motilitet. Derfor KPFM repræsenterer et kraftfuldt værktøj, der kan anvendes til at undersøge ændringer i mikrobiel membranoverflade potentiale upon vedhæftning til forskellige substratoverflader. I denne undersøgelse viser vi proceduren karakterisere de potentielle individuelle methicillinresistente Staphylococcus aureus USA100 celler overflade på rustfrit stål og guld ved hjælp KPFM.
Introduction
Biofilm produceres på udstyr overflader og i kutane sår udgør et problem for den medicinske industri som biofilm er genstridige til fjernelse og kan føre til en større procentdel af overførsel af sygdomme og antibiotikaresistens. Attachment er det første skridt i biofilm dannelse og er den mest kritiske trin på grund af sin reversible 1-3. Substratoverfladen egenskaber spiller en afgørende rolle på mikrobiel fastgørelse. Faktorer såsom overfladehårdhed, porøsitet, ruhed og hydrofobicitet er blevet vist at bevirke mikrobiel fastgørelse; har imidlertid lidt forskning undersøger rolle substratoverfladen potentiale (SP) på mikrobiel adhæsion blevet gjort 4,5. Negativt ladede overflader forhindrer fastgørelsen af Bacillus thuringiensis sporer til glimmer, silicium, og guld 6. Ændringer i cellulær membranpotentiale er tegn på ændringer i cellulær vedhæftning og motilitet 5,7. Det er blevet observeret, at elektrisk homogeneous overflader lettere fremmer mikrobiel vedhæftning 5. Karakterisering af potentialet af bakterier overflade i nanoskala kan tilvejebringe en hidtil ukendt måde at forstå vedhæftning kinetik af bakterier til forskellige overflader, og dermed kan bidrage i udviklingen af anti-biofouling strategier. I modsætning til andre metoder til karakterisering af elektro kinetik bakterier, såsom elektroforetisk lysspredning, zeta potentiale, og isoelektriske punkt beslutsomhed, Kelvin sonde force mikroskopi (KPFM) giver mulighed for undersøgelse af de enkelte celler i stedet for hele kulturer 8-11. Det er en fordel, når der ønsker at sammenligne celle-celle eller biofilm elektriske egenskaber med stor nøjagtighed og præcision.
KPFM er et modul af atomic force mikroskopi (AFM). AFM blev udviklet som et direkte resultat af scanning tunneling mikroskop (STM) 12. De første offentliggjorte billeder ved hjælp af STM blev udført af Gerd Binnig og Heinrich Rorhrer i 1982 12 12. STM kan også ske i væsker ved hjælp af specialiserede probespidser 13. Dette blev vist ved Lindsay et al., Der brugte STM og AFM til billedet DNA-molekyler i 10 mM HCIO4 og i vand, på guldelektroder 13. KPFM er blevet påvist i fastlæggelsen af Surface potentialer DNA og protein analyse 25 og biomolekyler interaktion med ligander 26.
KPFM fungerer ved at måle kontakt potentielle forskel (CPD) mellem en AFM ledende cantilever spids og ideelt ledende prøve (figur 1, i) 14,15. Prøver behøver ikke nødvendigvis at være ledende (dvs. biologisk samples). Imaging kan udføres på glimmer, glas og silicium overflader (ikke-ledende), så længe den ikke-ledende overflade er tynd, og der er et underliggende ledende materiale 6,7. Byggevaredirektivet svarer til overfladen potentielle spænding og kan beskrives som forskellen i arbejdsfunktionerne mellem spidsen (φ tip) og prøve (φ prøve), divideret med den negative elektron ladning (- e). Når en ledende AFM spids bringes tæt på en prøve overflade (adskilt af afstanden d), en elektrostatisk kraft (F ES) genereres på grund af forskellen i Fermi energi (figur 1, II, a) 15. På dette tidspunkt vakuum energier spidsen og prøven (E V) er i ligevægt og tilpasset. Ved at bringe spidsen tættere på prøveoverfladen, spidsen og prøvens overflade kommer i elektrisk kontakt og fungerer som parallelle plade kondensatorer (figur 1, II, B 14,15. På det sted, Fermi energier spidsen og prøveoverfladen blive justeret, nå steady state ligevægt (figur 1, II, b). Spidsen og prøve overflade vil blive opkrævet og en V CPD vil danne grund af en forskel i E mod 's og arbejdsfunktioner. En F es virker på den elektriske kontakt området på grund af den dannede V CPD. Denne kraft efterfølgende ophævet ved anvendelse af en ekstern V DC til spidsen, der har samme størrelse som den dannede V CPD (figur 1, II, C). Det gjaldt jævnspænding eliminerer overfladeladning på området elektrisk kontakt, og mængden af V DC nødvendigt at fjerne de F es i V CPD er lig med forskellen i arbejdsfunktionerne mellem sample overflade og drikkepenge 15. Det skal bemærkes, at arbejdsfunktionen af spidsen kendes, og det leveres af fabrikanter. I alle KPFM metoder, en AC spænding (V AC, ca. 100-500 mV) anvendes også til spidsen for at generere oscillerende elektriske kræfter mellem spidsen og prøve 14. Dette giver en bedre opløsning, når måling af ændringer i V CPD og / eller F es. I denne henseende kan ændringer i frekvensen eller amplituden af elektrisk oscillation korrigeres ved V DC, og overflade potentielle kort kan genereres. Data fra bestemte områder af disse kort kan analyseres yderligere for at give elektrisk oplysninger om specifikke topografiske funktioner.
KPFM kan betjenes i tre tilstande: (1) lift tilstand, (2) amplitude modulation (AM) tilstand, og (3) frekvens modulation (FM) tilstand 14,16. Lift-funktion var den oprindelige incarnation af KPFM. Lift tilstand er afhængig af en to-pass metode, hvor en oscillerende spids trækkes hen over overfladen for at opnå et topografisk billede. For den anden passage spidsen hæves en forudindstillet afstand over prøven (10-100 nm) og scannet tilbage over det samme område. På grund af denne to-pass metode, elevator tilstand i forhold til AM- og FM-KPFM, tager længst tid for billedoptagelse. Raising spidsen væk fra overfladen sikrer, at kun langtrækkende F ES måles. Også, krydstale mellem topografi og overflade potentielle målinger afkoblet på bekostning af øget lateral opløsning og følsomhed.
AM-KPFM forbedrer lateral opløsning og følsomhed ved at bruge dobbelt-frekvenser til samtidig prøve topografi og overflade potentiale (one-pass scanning) 14. I AM-modus, er cantilever mekanisk oscilleres, generelt 5% under den første resonansfrekvens (f 0), og elektrisk svinget (through en V AC) ved sin anden resonansfrekvens (f 1). Ændringer i amplituden af f 0 føring til generering af topografiske data, mens ændringer i amplituden af f 1, som følge af ændringer i F es og V CPD, giver overfladen potentielle måledata. f 0 og f 1 af cantilever er adskilt af betydelige frekvenser og energier, der signalerer krydstale minimeres 14. Feltet hoved elektronik (HEB) i AFM adskiller de to signaler til at give både topografisk og overflade potentielle data samtidigt i én scanning. FM-KPFM forbedrer opløsning endnu videre end AM-KPFM på biologiske overflader 14. FM-KPFM virker anderledes end AM-KPFM i, at det måler ændringer i elektrostatiske kraft gradienter snarere end elektrostatisk kraft (F es) 15. Ligesom AM-tilstand, FM-tilstand udnytter dual-frekvenser og en enkee-pass scanning mekanisme til at opnå topografiske og overflade potentielle data samtidigt 14. I FM-tilstand, er cantilever mekanisk oscilleres på f 0 og elektrisk oscilleres ved en lav modificeret frekvens (f mod, typisk 1-5 kHz). Ved elektrostatiske interaktioner, at f 0 og f mod mix producere sidebånd f 0 ± f mod. Disse sidebånd er meget følsom over for ændringer i elektrostatisk kraft, og kan adskilles fra f 0 gennem AFM s HEB. Da FM-KPFM måler ændringer i elektrostatiske kraft gradienter, spille tips apex form og dens vedligeholdelse / integritet en kritisk rolle for den overflade potentiel opløsning 14, 15. Surface potentiel opløsning med AM og FM-indstillinger i intervallet 1 nm til siden 14 -16. Det skal bemærkes, at KPFM billeddannelse kan ske i ikke-polære væsker, og har vist sig for nylig at blive gjort i lav-ionisk (<10 mm) polære væsker (iåben sløjfe KPFM tilstande, som ikke kræver en bias feedback, hvorved man undgår anvendelse af en DC bias), såsom MilliQ vand; Men KPFM billedbehandling endnu skal gøres på levende celler i polære løsninger 17-20. Yderligere udfordringer forbundet med SP billeddannelse i væske er, at løsninger der almindeligvis anvendes til at opretholde celler (dvs. phosphatpufret saltvand) har høje koncentrationer af mobile ioner, hvilket vil føre til Faradaic reaktioner, bias-induceret charge dynamik og iondiffusion / omfordeling 20. Således for dette eksperiment blev målinger taget fra tørrede og døde MRSA celler på poly-L-lysin funktionaliserede rustfrit stål og guld overflader under omgivelsesbetingelser. Imaging kan udføres i luft eller vakuum på biologiske prøver, der tidligere er blevet tørret eller immobiliseret på overflader 20. Fugtige forhold har også vist sig at påvirke KPFM billeddannelse af overflader 6.
I denne undersøgelse anvendte vi FM-KPFMog AFM at undersøge, hvilken rolle SP om udlæg i methicillin-resistente Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) til poly-L-lysin funktionaliserede rustfrit stål og guld overflader. MRSA har for nylig vundet status som en multi-lægemiddelresistente (MDR) "superbug" på grund af dets naturligt valgt resistens over for mange β-lactam-antibiotika og cephalosporiner 21. MRSA infektioner er nu mere udfordrende, vanskelig og formidable til behandling, hvilket fører til anvendelse af hårdere antimikrobielle såsom vancomycin eller oxazolidinoner, der har højere toksicitet i mennesker, og kan derfor ikke anvendes som langsigtede behandlinger 22. Rustfrit stål blev valgt på grund af sin medicinsk relevans og fælles brug som materiale i kanyler, bækkener, dørhåndtag, dræn osv Guld blev anvendt som en sammenlignende metal. FM-KPFM blev anvendt til at undersøge, om mikrobiel membran SP ændringer efter binding til substraterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af glas og kulturer
- Før du fortsætter med dette forsøg, forberede 5% får blod agar (SBA) plader til dyrkning MRSA. Inkuber SBA plader i 24 timer ved 37 ° C. Efter dette tidspunkt bør enkelt, godt isolerede kolonier være til stede for at blive anvendt til efterfølgende inokulationer i flydende medier. Store stribede SBA plader med enkelt kolonier ved 4 ° C i 1 - 2 måneder.
BEMÆRK: fåreuld blodagarplader kommer i pre-made pakker med mellem 20-25 plader på grundlag af producentens, og består typisk af en tryptisk soja-agar base med tilsætning af 5% w / v får blod. - Lav 500 ml tryptisk soja-bouillon (TSB) suppleret med 1% glucose og 0,1% NaCl. Efter dette, indsamle og rense 2 reagensglas. Hvis autoklaverbare låg er utilgængelige for reagensglas, brug alufolie som en hætte. Autoklave TSB og reagensglas sammen med en kasse med 1 ml pipettespidser.
- Under en biosikkerhed kabinet eller i nærheden af en Bunsen brænder, pipette 5 ml tidligere autoklaveret TSB i autoklaverede reagensglas. Vær omhyggelig med at sikre, at tilstrækkelig tid er blevet givet til lade TSB og reagensglas afkøle til stuetemperatur. Fra en tidligere udstrøget 5% SBA plade, pode en enkelt koloni i 6 ml TSB-medium. Man vil indeholde MRSA, og det andet reagensglas vil blive anvendt som en negativ kontrol for at sikre sterilitet.
- Tag inokulerede TSB reagensglas og placere dem i et gensidigt inkubator i 24 timer ved 37 ° C og ved 200 omdrejninger i minuttet. Efter denne tid mikrobiel vækst skal være synlige i MRSA reagensglas mens ingen vækst skulle have fundet sted i kontrollen reagensglas.
- Tag 1 ml fra 24 hr kultur og pipette i 6 ml frisk TSB. Der inkuberes ved 37 ° C i 6 timer ved 200 rpm.
- 1 ml af 6 timer subkultur i et 1,5 ml mikrofugerør. Centrifugeres i 3 minutter ved 850 x g. Fjern supernatanten og re-suspendere pellet i 1 ml deioniseret H 2 O. Centrifuge, gentag, og re-suspendere.
- Tag rustfrit stål og guld AFM prøve diske (20 mm og 10 mm diameter henholdsvis), og rengør hver side med 5 ml deioniseret H2O Hold prøve diske i den dominerende hånd med pincet og bruge subdominant hånd til afpipetteres 5 ml på hver side af prøven disk. Efter vask begge sider, skiver sted prøve i et bægerglas indeholdende 20 ml deioniseret H2O, efterfulgt af sonikering i 1 min.
- Efter lydbehandling brug pincet til at fjerne prøve diske fra bægeret. Placer diske, således at de læner ved en 60 ° vinkel mod kanten af en åben petriskål på en papirserviet. Brug låget af petriskålen for at dække tørring diske. Lad diske tørre helt, før du fortsætter. Tørretiden kan variere mellem 4-8 timer.
- Når tør, brug pincet til at placere prøve diske i en Petri plade.
- Eventuelt funktionalisere overfladerne af prøve diske med andet materiale (fx collagen, hyaluronan, sølv nanopartikler, etc.).
- Til dette forsøg anvender poly-L-lysin til at coate substratoverfladen. For poly-L-lysin funktionalisering, pipette 200-400 pi 0,1% poly-L-lysin (i H 2 O) på prøve diske, og lad inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i en petriskål.
- Efter 1 time, brug pincet til at holde prøven disk, og vask med 1 ml deioniseret H 2 O. Lad tørre på papirservietter som beskrevet i trin 2.2.
- Tag 2x vaskede resuspenderede celler og pladen 200-400 pi onto prøve diske inde i et biosikkerhed kabinet. Hvis prøven diske er belagt med poly-L-lysin, inkuberes i 0,5 timer ved stuetemperatur.
- Efter inkubation af celler på prøve diske, vask prøve diske forsigtigt med 1 ml deioniseret H 2 O. Lad diske tørre natten over før billeddannelse.
3. KPFM Imaging
BEMÆRK: Til dette eksperiment,bruge en Agilent 5500 serien ILM-AFM.
- For at starte AFM, tænde computerenhed sammen med AFM s HEB og MAC III controller. Open AFM imaging software (f.eks Agilents PicoView). Vær sikker på at i første omgang vælge ACAFM eller alt efter hvad den korrekte betegnelse er på AFM til billeddannelse i intermitterende kontakt mode.
- Brug af AFM pincet i den dominerende hånd, og holde fjederbelastet clips holder åbent med subdominant hånd, placere en KPFM cantilever i hovedet stykke. Vær forsigtig ved håndtering og overførsel AFM head-brik til AFM som denne enhed (i hvert fald på 5500 ILM-AFM) indeholder den skrøbelige piezo krystal enhed, der styrer X, Y og Z scanning directionalities.
BEMÆRK: KPFM cantilevere anvendt i denne sag var Mikromasch ledende DPE (støjsvag) støtteben med gennemsnitlige resonansfrekvenser på 80 kHz og foråret konstanter 2,7 N / m. Støtteben med disse resonansfrekvenser og fjederkonstanter blev valgt på grund af deres brugervenlighed.Støtteben med større fjederkonstanter og højere resonansfrekvenser kan også anvendes til billeddannelse. - Indlæse forsigtigt head-brik i AFM og tilslut de nødvendige ledninger (i dette tilfælde to ledninger skal sættes på: laserlys og scene lift motor).
- Juster laseren på spidsen af udliggeren. Nogle enheder indeholder et kamera funktionalitet, som giver mulighed for lettere justering. Hvis kameraet funktionalitet ikke er til stede på AFM, tilslutter på cantilever spids som beskrevet næste:
- Drej front-to-back med uret for at flytte laseren ovenpå cantilever chip. Når laseren når chippen vil blive blokeret og ikke længere vil være synlige. Kun dreje knappen et par gange.
- Drej front-to-back mod uret, indtil laserpunktet igen. Laseren er nu på chippen kant.
- Drej til venstre mod højre knappen for at placere laseren på cantilever. Da laseren passerer over cantilever det vil forsvinde og dukke op igen in hurtigt efter hinanden. Laseren stedet bør være synlig i matteret glas låg, hvor fotodiode enheden senere sidde.
- Drej front-to-back mod uret for at flytte stedet ned cantilever mod spidsen, indtil stedet på matteret glas forsvinder.
- Drej front-to-back uret kun lidt for at positionere laseren, så den kun sidder på cantilever spids. Laseren spot vises igen på matteret glas.
BEMÆRK: Dette er den laser positionering metode til dykning-bord cantilevere. For støtteben, tilpasningen er lidt forskellig.
- Når laseren er justeret, skal du holde scenen lift motor i stillingen "åben" i 10 sek for at sikre tilstrækkelig plads mellem cantilever og prøve, når du monterer prøven til AFM.
- Anbring prøven på KPFM prøven scenen. Ground prøven ved hjælp af en kobbertråd. Forbind de relevante ledninger fra AFM til prøven fase. Tilslut STage AFM. I de fleste tilfælde stadium holdes på plads ved hjælp af magneter.
- I AFM software tune udliggeren og derefter begynde tilgang af cantilever spids til prøven. Sørg for, at afvikling tid er fastsat til højst 10 ms, og denne tilgang hastigheder ikke overstiger 2,0 um / sek for at undgå tip skader.
- Når cantilever tip er på overfladen af prøveeksemplaret, skal du vælge et billeddannende vindue størrelse og ideel imaging område. Optimer I og P gevinster sammen med cantilever setpunkt så topografiske billeddannelse optimeres.
- Når topografisk billeddannelse er optimeret, tænd KPFM modul (enten FM eller AM-tilstand, her skal du bruge FM-tilstand). Det skal bemærkes, at KPFM billeddannelse er meget udfordrende uden for 5 um x 5 um imaging vindue. Også for optimal KPFM billeddannelse, bruge en 512 x 512 opløsning med langsomme scan hastigheder (0,02-0,05 linier / sek).
- For FM-KPFM indstillinger (ikke ACAFM indstillinger), indstille drevet procent mellem 5 - 10%. Indstil cantilever frequency mellem 1-5 kHz med en båndbredde på 2 kHz. Sæt I og P gevinster for FM-KPFM indstillinger til 0,3%.
- Varier signal båndbredde og jeg og P gevinster mellem prøve overflader. For at optimere SP billedbehandling, yderligere justere signal båndbredde og jeg og P gevinster at opnå optimale billeder. Det anbefalede udvalg af I og P gevinster er fra 0,22 til 0,35%.
- Bearbejde og analysere indsamlede KPFM billeder med post-billedbehandling software til at indsamle SP data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen til at måle SP hjælp KPFM bygger på princippet om, at både prøvens overflade og cantilever spids er ledende til en vis grad. Rustfrit stål og guld fungerede som ledende overflader, som MRSA til igen. KPFM billeder blev taget af 15 MRSA-celler på begge flader med 512 x 512 resolutioner, og med scan områder lige fra 5 x 5 um til 10 x 10 um. Scanning blev udført med line hastigheder fra 0,02 linjer / sek til 0,05 linjer / sek. Derfor, med 512 datapunkter indsamlet pr linje og 512 linjer til at scanne, scan gange varierede fra 2,84 timer til 7,11 timer. De typer af billeder indsamlet kan ses i figur 2. KPFM fungerer ved hjælp af dobbelt frekvenser, og som sådan er topografiske billeder samtidigt indsamles sammen med data om de elektriske egenskaber af overfladen. Termiske filtre blev anvendt til SP kort for at lettere skelne små ændringer i overfladen potentiale (figur 2). Data fra SP kort wsom analyseret post-billedbehandling software til at bestemme den gennemsnitlige overflade potentialer og standardafvigelser. Statistisk analyse blev udført under anvendelse R Open Source Statistiske Program. Student t-tests blev udført for at sammenligne grupper med P <0,05 blive betragtet som signifikant.
SP billeder blev analyseret for at bestemme mikrobiel membranoverflade potentiale. Disse blev derefter sammenlignet med væksten af de forskellige substratoverflader. Dette blev gjort for at bestemme, om overfladen typen havde en virkning på den mikrobielle membranoverflade potentiale. Oprindeligt vi forsøgte at inkubere MRSA celler statisk i 3 timer på underlaget overflader. Men nogen tilknyttede mikrober var synlige under AFM. SP data for ren og poly-L-lysin funktionaliserede overflader blev bestemt ud fra 5 x 5 um scannede områder. SP scanninger af de nøgne rustfrit stål og bare guld substrater viste samlede negative overflade potentialer (-0,045 ± 0,057 V og -0,126 ± 0,052 V, henholdsvis, P = 0,047, figur 3). Poly-L-lysin blev anvendt til at funktionalisere overfladen for at gøre dem mere gunstige for cellevedhæftning. Funktionaliserede overflader viste et skift til positive overflade potentialer for rustfrit stål og guld overflader (0,133 ± 0,063 V og 0,126 ± 0,030 V, henholdsvis figur 3). Vi undersøgte derefter de membranpotentialer af MRSA på poly-L-lysin funktionaliserede rustfrit stål og guld overflader. Det konstateredes, at MRSA celle membranpotentialer varierede mellem rustfrit stål og guld overflader. Overflader af rustfrit stål medførte signifikant større positive membran SP'er for celler i forhold til deres guld modstykke. For eksempel SP MRSA celler skiftede fra positiv til negativ SP'er. MRSA viste positiv SP på rustfrit stål overflader med SP'er på 0,160 ± 0,022 V og SP af -0,025 ± 0,016 V på guld overflader (P <0,001).
For at vise den fulde kapacitet af KPFM, et eksempelet led højde graf af MRSA på rustfrit stål er tilvejebragt (figur 4). Dette viser forskellen i potentiale overflade mellem substratoverfladen og den mikrobielle membran.
Figur 1. Arbejdsvilkårene principper for atomic force mikroskop (i) og Kelvin sonde force mikroskop (ii) Genoptrykt med tilladelse fra (15). Den grundlæggende konfiguration af AFM er vist i (I). I AFM er en skærpet spids fæstnet til en cantilever gennem elektrokemisk aflejring. Mikromasch platin-belagte ledende DPE (støjsvag) cantilevere blev anvendt i dette forsøg havde dimensioner på 210 x 30 um, 80 kHz resonansfrekvens, og foråret konstanter 2,7 N / m. Cantilevere blev fastgjort til en større chip for at give mulighed for nem håndtering. Når samlet i AFM, er en laser linje på cantilever spids. Nedbøjninger i Cantilnogensinde spids detekteres gennem en fotodiode. Nedbøjninger anvendes til at frembringe topografiske billeder. (Ii, a, b, c) viser funktionsprincip af KPFM. Cantilever bringes tæt nok på overfladen for at muliggøre elektrisk kontakt forekommer. Forskelle i potentialerne overflade mellem spidsen og overfladen forårsage spidsen til at aflede. En DC-spænding anvendes til at korrigere for denne deformation. Denne DC påførte spænding er lig med potentialet af substratoverfladen overflade. Afhængigt af typen af anvendte billedbehandlingstype (elevator, AM, FM), dette funktionsprincip afviger lidt. Figur 1 (ii) er ændret fra 15.
Figur 2. repræsentant topografi og overflade potentielle kort over MRSA på poly-L-lysin funktionaliserede rustfrit stål og guld substrater. Billeder (I og III) viser repræsentative topografi billeder af MRSA celler på rustfrit stål og guld overflader hhv. Billede dimensioner kan ses i X- og Y-aksen i disse billeder sammen med en tilsvarende farvet højdeprofil. (II og IV) viser de tilsvarende SP kort over MRSA på deres respektive overflader. Standard »guld« farve filtre blev anvendt på topografi billeder, mens termiske filtre blev anvendt til SP billeder til lettere skelne små ændringer i SP. Det skal bemærkes, at SP af substratoverflader var ikke homogen. SP blev fundet at være uensartet fordelt med åbenbare positive og negative områder på begge substratoverflader. Dette kan ses omkring MRSA celler, hvor heterogene SP'er er observeret på rustfrit stål og guld substrater. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
52.327 / 52327fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Overflade potentiale substratoverflader og MRSA cellemembraner. Figur 3 viser de tilsvarende KPFM data fra guld overflader i rustfrit stål (mærket her som SS) og samt data fra 15 celler. Stjerner repræsenterer signifikante forskelle mellem prøver med antallet af stjerner, der svarer til de sammenlignede prøver. MRSA blev indsamlet oplysninger fra celler, der er knyttet til funktionaliserede overflader efter 30 minutters inkubation. Dette blev gjort på grund af det faktum, at ingen celler blev fundet at binde sig til de nøgne substratoverflader efter 3 timer.
Figur 4. Trin højde overflade potentielle billede af MRSA på poly-L-lysin funktionaliseret rustfrit stål. Brug af post-billedbehandling software, var et skridt-højde graf genereret for at vise capabilibånd af softwaren, samt, den mærkbare forskel i SP mellem substratoverfladen og cellemembranen. Det tværsnitsareal valgt er repræsenteret på det tilsvarende kort SP med den grå linje. Et skift fra 0,15 V på celleoverfladen til 0,21 V på underlaget overfladen er klart. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Firma | Probe Type | Fjederkonstant (N / m) | Resonansfrekvens (kHz) | Cantilever Dimensioner | Tip Apex Diameter |
| Asyl Forskning | AC240TM-R3 | 2 | 70 | Længde = 240 um Bredde = 40 um </ Td> | 28 nm |
| Bruker AFM Probes | SCM-PIT | 2.8 | 75 | Længde = 225 um Bredde = 28 um | 20 nm |
| Mikromasch | Ledende DPE (støjsvag) cantilevere | 2.7 | 80 | Længde = 210 um Width = 30 um | 40 nm |
| Nano og mere USA | PTSI-NCH | 42 | 330 | Længde = 125 um Width = 30 um | > 25 nm |
| Nanovidenskab Instruments | AppNano Ledende Tapping mode AFM prober. | 40 | 300 | Længde = 125 um Bredde = 35 um | 30 nm |
| Nanovidenskab Instruments | AppNano Ledende Tapping mode AFM prober. | 40 | 300 | Længde = 125 um Bredde = 35 um |
Tabel 1. Virksomheder, der tilbyder en bred vifte af KPFM sonder. En række virksomheder tilbyder nu KPFM spids med varierende tip apex diametre, forår konstanter og resonansfrekvenser. Tip tilpasning er nær grænseløs, med virksomheder typisk med at bygge støtteben med tilpassede specifikationer for en tilsigtet eksperiment. De fleste KPFM prober er platin belagt siliciumnitrid. Platinum giver ledende funktionalitet til cantilever. Andre almindelige coatingmaterialer indbefatter iridium, platin + iridium og guld. De fleste KPFM tips kan også alternativt anvendes til elektriske kraft mikroskopi (EFM). Tip spids er vigtigt for KPFM cantilevere. Tips større diameter ofre højere opløsning topografi billeddannelse til mindre elektrisk støj. Omvendt tips mindre diameter (<25 nm) tilbyder forbedret topografi billedopløsning men er mere tilbøjelige til elektrisk støj. Til denne undersøgelse brugte forskerne Mikromasch adfærdive DPE (støjsvag) støtteben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KPFM var ansat som ny teknik til at opnå overflade elektriske data. Det har været almindeligt anvendt som en metode til at undersøge ladningsfordeling i kemi og er først for nylig begyndt at blive anvendt til studiet af biologiske systemer på mikro- og nano-skalaer. Fra de indsamlede data, vi fandt, at mikrober ikke synes at let vedhæfte at rengøre rustfrit stål og guld overflader, selv efter 3 timer af statisk inkubation. Poly-L-lysin funktionaliserede overflader viste hurtig mikrobiel vedhæftning efter 30 min. Længere inkuberingstider af mikrober på funktionaliserede overflader førte til celle overbelægning på prøve overflader, og dårlige topografi billeder. Surface funktionalisering førte til et skift fra negativ til positiv SP SP for rustfrit stål og guld overflader. Tidligere undersøgelser har vist, at mikroorganismer har typisk negativt SP'er grund til sekvestrering af negativt ladede ioner omkring celler at opretholde osmotiske og ioniske balance 23. Det er også kendtat tilstedeværelsen af phosphatgrupper i Gram negative mikroorganismer og teichoic syrer i grampositive mikroorganismer fører yderligere til dannelse af negative SP'er 24. Kendskab til de grundlæggende kemi Gram positive og negative cellemembraner førte os til at antage, at positive substrat SP'er ville føre til hurtig mikrobiel vedhæftning. Imidlertid kan som ses i figur 2 - 4, at der var en stor skift fra positive til negative MRSA celle SP'er på rustfrit stål og guld substrater henholdsvis. Mikrobiel vedhæftede fil kunne have oprindeligt opstået fra beslaglæggelse af negative ioner rundt membranen. Efter vask af cellerne og lade dem tørre på substratet overflader, kunne vi have været vasket væk denne ioniske medier. Desuden bør det bemærkes, at KPFM data kun inklusive de ydre cellevæg områder af Gram positive (MRSA) celler. Det er blevet vist i nogle tilfælde, at en potentiel mikroorganismer cellemembranen kan ændres ved nærvær af cationic antimikrobielle peptider eller andre stressfaktorer 8.
Den ene største ulempe ved KPFM forhold til standard zeta potentielle målinger på mikrobielle cellekulturer er, at de indsamlede data i KPFM sker på døde og tørrede celler. KPFM blev brugt til at undersøge generelle tendenser i celleoverflade potentielle skift med hensyn til forskellige vedhæftede substratoverflader. Anvendelsen af DC spændinger til cantilever spids (til at modvirke F es), sammen med kravet om en ledende prøve overflade, begrænser standard KPFM til open-air billeddannelse. Imaging i polær væske er i øjeblikket ikke muligt med standard KPFM og dermed billeddannelse af levende celler ved hjælp af KPFM er ikke som i endnu muligt. Udviklingen af ny åben sløjfe og dual frekvens KPFM tilstande har vist lovende i deres evne til at afbilde overflader i lav-ioniske opløsninger 18-20. Det er vores håb, at der i fremtiden teknologien videreudvikles, så billeddannelse kan gøres på live cellekulturer. Den billeddannelse af celler i et mere naturligt miljø ville utvivlsomt føre til dannelse af mere nøjagtige og realistiske SP data cellemembran. Til denne undersøgelse ønskede vi at anvende denne teknologi på en ny måde at måle mikrobielle celle membran potentialer, samt studere vedhæftning egenskaber ved MRSA på en medicinsk relevant overflade. Ændringer i mikrobielle membran SP'er blev observeret efter inkubation på forskellige substratoverflader. Dette kan indebære, substrattype kan påvirke cellulær metabolisme. Vores håb er, at denne foreløbige data kan føre til dannelsen af nano-belægninger med iboende elektriske ladninger, som kan anvendes til medicinske overflader eller udstyr (herunder andre materialer, såsom bandager og gaze) for at forhindre mikrobiel vedhæftning. Beskrevet i denne artikel protokol er beregnet til at hjælpe forskerne med at forstå principperne i KPFM og vise, hvordan den kan anvendes til at måle og skabe SP kort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
- Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
- Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
- Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
- Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
- Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
- Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
- Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
- Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
- Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
- Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
- Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
- Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
- Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
- Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
- Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
- Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
- Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
- Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).
