Abstract
Overflatepotensialet er en ofte oversett fysisk karakteristikk som spiller en dominerende rolle ved adhesjon av mikroorganismer til substratoverflater. Kelvin probe force mikroskopi (KPFM) er en modul av atomic force mikroskopi (AFM) som måler kontakt potensialforskjell mellom flater på nano-skala. Kombinasjonen av KPFM med AFM muliggjør den samtidige generering av overflatepotensial og topografiske kart av biologiske prøver slik som bakterieceller. Her benytter vi KPFM å undersøke effekten av overflatepotensial på mikrobiell vedheft til medisinsk relevante overflater som rustfritt stål og gull. Overflate kart over mulige avdekket forskjeller i overflatepotensial for mikrobiell membraner på ulike materielle underlag. En trinnhøyde graf ble generert for å vise forskjellen i overflatepotensialet ved et grenseområde mellom substratets overflate og mikroorganismer. Endringer i cellemembranen overflatepotensialet har blitt koblet med endrings i cellenes stoffskifte og motilitet. Derfor KPFM representerer et kraftig verktøy som kan benyttes for å undersøke endringene av mikrobiell membranoverflaten potensial ved adhesjon til forskjellige substrat-overflater. I denne studie demonstrerer vi at fremgangsmåten for å karakterisere overflatepotensial av individuelle meticillin-resistente Staphylococcus aureus-celler USA100 på rustfritt stål og gull ved hjelp KPFM.
Introduction
Biofilm produsert på utstyrsoverflater og i kutane sår presentere et problem for den medisinske industrien som biofilm er trassig til fjerning og kan føre til økt forekomst av smitteoverføring og antibiotikaresistens. Vedlegget er det første trinnet i biofilmdannelse og er den mest kritiske trinnet på grunn av sin reversibilitet 1-3. Substrat overflateegenskaper spiller en avgjørende rolle på mikrobiell vedlegg. Faktorer som overflatehardhet, porøsitet, ruhet, og hydrofobisitet er blitt vist å bevirke mikrobiell feste; imidlertid lite forskning å undersøke rollen til substratoverflaten potensial (SP) på mikrobiell adhesjon blitt gjort 4,5. Negativt ladede overflater hindre festing av Bacillus thuringiensis sporer til glimmer, silisium og gull 6. Endringer i cellemembranen potensial indikerer endringer i cellulær festing og motilitet 5,7. Det har blitt observert at elektrisk homogeneous flater lettere fremme mikrobiell vedheft 5. Karakterisere overflatepotensial av bakterier på nanoskala kan tilveiebringe en ny måte å forstå de adhesjons kinetikken av bakterier til overflater, og derved kan hjelpe til i utviklingen av anti-begroing strategier. I motsetning til andre metoder som brukes for å karakterisere de elektrokinetikken av bakterier, for eksempel elektro lysspredning, zeta-potensial, og isoelektrisk punkt bestemmelse, Kelvin probe mikroskopi (KPFM) gjør det mulig for undersøkelse av enkeltceller i stedet for hele kulturer 8-11. Dette er gunstig når du ønsker å sammenligne celle-celle eller biofilm elektriske egenskaper med høy nøyaktighet og presisjon.
KPFM er en modul av atomic force mikroskopi (AFM). AFM ble utviklet som et direkte resultat av scanning tunneling mikroskop (STM) 12. De første publiserte bilder med STM ble gjort av Gerd Binnig og Heinrich Rorhrer i 1982 12 12. STM kan også gjøres i væsker ved hjelp av spesialiserte probetupper 13. Dette ble vist av Lindsay et al., Som brukt STM og AFM til bilde DNA-molekyler i 10 mM HClO 4 og i vann, på gullelektroder 13. KPFM har blitt demonstrert i å bestemme Surface potensialene av DNA og protein analyse 25 og biomolekyler samspill med ligander 26.
KPFM opererer ved å måle kontaktpotensialforskjell (CPD) mellom en AFM ledende cantilever spiss og en ideelt ledende prøven (figur 1, i) 14,15. Prøver som ikke nødvendigvis trenger å være ledende (dvs. biologisk samples). Avbildning kan utføres på glimmer, glass og silisium overflater (ikke-ledende), så lenge den ikke-ledende overflate er tynn, og det er en underliggende ledende materiale 6,7. CPD tilsvarer overflatepotensialet spenning og kan beskrives som forskjellen i arbeidsfunksjonene mellom spissen (φ spissen) og prøven (φ prøven) dividert med den negative elektron ladning (- e). Når en ledende AFM spiss er brakt i nærheten av en prøveflate (atskilt med avstanden d), en elektrostatisk kraft (F-r) blir generert på grunn av forskjellen i Fermi energier (figur 1, ii, a) 15. På dette punktet, vakuum energier av spissen og prøven (E v) er i likevekt og innrettet. Ved å bringe den nærmere prøveoverflaten spissen, og spissen prøveoverflaten komme i elektrisk kontakt og virker som parallelle platekondensatorer (figur 1, ii, b 14,15. På det punkt, Fermi energier av spissen og prøven overflaten blir justert, og nådde en stabil tilstand likevekt (figur 1, ii, b). Tuppen og prøveoverflaten vil bli belastet, og en V CPD vil danne grunn av en forskjell i E v 's og arbeidsfunksjoner. A F es virker på den elektriske kontaktområdet på grunn av det dannede V CPD. Denne kraft blir deretter opphevet gjennom anvendelse av en ekstern V DC til spissen som har samme størrelsesorden som den dannede V CPD (figur 1, ii, c). Dette gjelder likespenning eliminerer overflateladning i området av elektrisk kontakt, og mengden av V DC nødvendig for å fjerne F-es av V CPD er lik forskjellen i arbeidsfunksjonene mellom sa-mple overflate og tips 15. Det skal bemerkes at arbeidsfunksjonen av spissen er kjent, og det er gitt av produsentene. I alle KPFM metoder, en vekselspenning (V AC, ca 100-500 mV) er også brukt til tuppen for å generere oscillerende elektriske krefter mellom spissen og prøven 14. Dette gir bedre oppløsning når måling av endringer i V CPD og / eller F es. I denne forbindelse, kan endringer i frekvensen eller amplituden av elektrisk oscillasjon korrigeres ved V DC, og overflate potensielle kartene kan genereres. Data fra bestemte områder av disse kartene kan bli ytterligere analysert for å gi elektrisk informasjon om spesifikke topografiske egenskaper.
KPFM kan brukes i tre modi: (1) Lift funksjon, (2) amplitudemodulasjon (AM) modus, og (3) frekvensmodulasjon (FM) modus 14,16. Løft modus var den første incarnation av KPFM. Lift-modus avhengig av en to-pass metode der en oscillated tips er dratt over overflaten for å få et topografisk bilde. For det andre passet spissen er hevet en forhåndsinnstilt distanse over prøven (10-100 nm) og skannet tilbake over samme område. På grunn av denne to-pass-metoden, heis modus, sammenlignet med AM og FM-KPFM, tar lengst tid for bildeopptak. Heve spissen bort fra overflaten sikrer at bare lang F es måles. Dessuten er krysstale mellom topografi og overflatepotensialmålinger dekoblet på bekostning av øket lateral oppløsning og følsomhet.
AM-KPFM forbedrer lateral oppløsning og følsomhet ved hjelp av dual-frekvenser å samtidig måle prøven topografi og overflatepotensial (ett-pass skanning) 14. I AM modus er cantilever mekanisk oscillert vanligvis 5% under sin første resonansfrekvens (f 0), og elektrisk oscillated (through en V AC) ved sin andre resonansfrekvens (f 1). Endringer i amplitude av f 0 ledelse til generering av topografiske data, mens endring i amplitude av f 1, som skyldes endringer i F es og V CPD, gi overflate potensielle måledata. f 0 og f en av cantilever er atskilt med betydelige frekvenser og energier som signaliserer krysstale er minimert 14. Den hodeelektronikkboks (HEB) av AFM skiller ut de to signaler for å gi både topografiske og overflate potensielle data samtidig i en skanning. FM-KPFM forbedrer oppløsning enda lenger enn AM-KPFM på biologiske overflater 14. FM-KPFM fungerer annerledes enn AM-KPFM i at den måler endringer i elektrostatisk kraft gradienter i stedet for elektrostatisk kraft (F es) 15. Som AM-modus, utnytter dual-frekvenser og en singl FM-moduse-pass skanning mekanisme for å få topografiske og overflate potensielle data samtidig 14. I FM-modus, blir braket mekanisk oscillert ved f 0 og elektrisk oscilleres ved en lav modifisert frekvens (f mod, typisk 1-5 kHz). Ved elektrostatiske interaksjoner, til f 0 og f mod mix produsere sidebånd f 0 ± f mod. Disse sidebånd er svært følsomme for endringer i elektrostatisk kraft, og kan skilles fra f 0 gjennom AFM er HEB. Siden FM-KPFM måler endringer i elektrostatisk kraft gradienter, det tips apex form og vedlikehold / integritet spille en avgjørende rolle i den samlede overflaten potensiell oppløsning 14, 15. Surface potensiell oppløsning ved hjelp av AM og FM-modi er i området 1 nm lateralt 14 -16. Det bør bemerkes at KPFM avbildning kan utføres i ikke-polare væsker, og mer nylig, har vist seg å skje på lavt-ionisk (<10 mm) polare væsker (iåpen sløyfe KPFM moduser som ikke krever en forspenning tilbakemelding, unngår anvendelsen av en DC-forspenning) som MilliQ vann; Men KPFM bildebehandling har ennå ikke gjort på levende celler i polare løsninger 17-20. Ytterligere utfordringer forbundet med SP avbildning i flytende løsninger, er at vanligvis brukes for å opprettholde celler (dvs. fosfatbufret saltvann) har høye konsentrasjoner av mobile ioner, noe som ville føre til Faraday-reaksjoner, skjevhet-induserte ladnings dynamikk, og ion-diffusjon / omfordeling 20. Således kan for dette eksperimentet, ble målinger tatt fra tørkede og døde celler MRSA på poly-L-lysin-funksjonaliserte rustfritt stål og gull overflater under omgivelsesbetingelser. Avbildning kan utføres i luft eller i vakuum på biologiske prøver som er blitt tørket eller immobilisert på overflater 20. Fuktige forhold har også vist seg å påvirke KPFM avbildning av overflater 6.
I denne studien benyttet vi FM-KPFMog AFM å undersøke rollen til SP på feste av meticillin-resistente Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) til poly-L-lysin-funksjonaliserte rustfritt stål og gull overflater. MRSA har nylig fått status som et multimedikamentresistent (MDR) "super" på grunn av sin naturlige valgt resistens mot mange β-laktam-antibiotika og cefalosporiner 21. MRSA-infeksjoner er nå mer utfordrende, vanskelig, og utmerket til behandling, som fører til anvendelse av strengere antimikrobielle midler slik som vancomycin eller oksazolidinoner som har høyere toksisitetsnivåer hos mennesker, og kan derfor ikke brukes som langtidsbehandlinger 22. Rustfritt stål ble valgt på grunn av sin medisinske relevans og felles bruk som materiale i sprøyte nåler, bekken, dørhåndtak, vask, osv Gull ble brukt som en sammenlignende metall. FM-KPFM ble anvendt for å undersøke om mikrobiell membran SP endres ved festing til substrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Glass og kulturer
- Før du fortsetter med dette eksperimentet, forberede 5% saueblod agar (SBA) plater for voksende MRSA. Inkuber SBA plater i 24 timer ved 37 ° C. Etter denne tid, bør enkelt-, godt isolerte kolonier være tilstede som skal brukes for etterfølgende inokulasjoner i flytende medier. Butikken stripete SBA plater med enkeltkolonier ved 4 ° C i 1 - 2 måneder.
MERK: saueblod agarplater kommer i pre-laget pakker som inneholder mellom 20 - 25 plater basert på produsenten, og består typisk av en tryptisk soya-agar base med tilsetning av 5% w / v saueblod. - Gjør 500 ml tryptisk soyamedium (TSB) supplementert med 1% glukose og 0,1% NaCl. Etter dette, samle og rense to glass reagensglass. Hvis autoklaver lokkene er utilgjengelige for prøverør, bruke aluminiumsfolie som en cap. Autoklav TSB og reagensrør sammen med en boks av en ml pipetter.
- Under en biosikkerhet skap eller i nærheten av en Bunsen brenner, pipette 5 ml tidligere autoclaved TSB inn autoklaveres reagensglass. Vær forsiktig for å sikre at nok tid er gitt for å la TSB og reagensrør avkjøles til romtemperatur. Fra en tidligere stripete 5% SBA plate, vaksinere en enkelt koloni i 6 ml TSB buljong. Man vil inneholde MRSA, og det andre prøverør vil bli brukt som en negativ kontroll for å sikre sterilitet.
- Ta inokulerte TSB reagensrør og plassere dem i en gjensidig inkubator i 24 timer ved 37 ° C og ved 200 rpm. Etter denne tid mikrobiell vekst skal bli synlig i MRSA prøverør mens ingen vekst skulle ha forekommet i styre reagensrør.
- Ta en ml fra 24-timers kultur og pipette inn i 6 ml fersk TSB. Inkuber ved 37 ° C i 6 timer ved 200 rpm.
- Pipetter 1 ml av 6 timers sub-kultur i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuger i 3 minutter ved 850 x g. Fjern supernatant og re-suspendere pelleten i 1 ml avionisert H 2 O. Sentrifuge, gjentar, og re-suspendere.
- Ta rustfritt stål og gull AFM prøveskiver (20 mm og 10 mm diameter henholdsvis) og rens hver side med 5 ml avionisert H 2 O. Holder prøveskiver i den dominerende hånd med pinsett og bruke subdominant hånden å pipettere 5 ml på hver side av prøven disk. Etter vasking begge sider sted prøveskiver i et beger inneholdende 20 ml avionisert H2O, etterfulgt av ultralydbehandling i 1 minutt.
- Etter ultralyd bruke pinsett for å fjerne prøve disker fra begeret. Plassere skivene slik at de lean ved en 60 ° vinkel mot kanten av en åpen Petri-plate på et papirhåndkle. Bruk av lokket av petrisplaten for å dekke tørke disker. La disker tørke helt før du fortsetter. Tørketiden kan variere mellom 4 - 8 timer.
- Når den er tørr, bruker pinsett til å plassere prøve disker i en petri plate.
- Eventuelt funksjonalisere overflaten av prøveskiver med en hvilken som helst materiale (for eksempel kollagen, hyaluronan, sølv nanopartikler, etc.).
- For dette eksperimentet ved å bruke poly-L-lysin for å belegge substratet overflate. For poly-L-lysin-funksjonalisering, pipette 200-400 ul 0,1% poly-L-lysin (i H2O) på prøveskiver, og la inkuberes i 1 time ved romtemperatur i en petriskål.
- Etter en time, bruker pinsett til å holde prøven disk, og vask med en ml avionisert H 2 O. La tørke på tørkepapir som beskrevet i trinn 2.2.
- Ta 2x vasket re-suspendert celler og plate 200-400 mikroliter over på prøve disker inne en biosikkerhet kabinett. Hvis prøve plater er belagt med poly-L-lysin, inkuberes i 0,5 timer ved romtemperatur.
- Etter inkubasjon av celler på eksempel disker, vaske prøve disker forsiktig med 1 ml avionisert H 2 O. La disker tørke over natten før bildebehandling.
3. KPFM Imaging
MERK: For dette eksperimentet,bruke en Agilent 5500-serien ILM-AFM.
- Å starte AFM, slå på datamaskinen enhet sammen med AFM er HEB og MAC III kontrolleren. Åpen AFM bildebehandlingsprogrammer (f.eks Agilent PicoView). Pass på at du i utgangspunktet velge ACAFM eller hvilken korrekt betegnelse er på AFM for bildebehandling i periodisk-kontakt modus.
- Ved hjelp av AFM pinsett i den dominerende hånd, og holder den fjærbelastet klips holder åpent med subdominant hånd, plasserer en KPFM cantilever inn til head-brikke. Vær forsiktig når du håndterer og overføre AFM head-brikke til AFM som denne enheten (i hvert fall på 5500 ILM-AFM) inneholder den skjøre piezo krystall enhet som styrer X, Y og Z skanning directionalities.
MERK: KPFM bommene som brukes i dette tilfellet var Mikromasch ledende DPE (støysvake) bommer med gjennomsnittlig resonansfrekvens på 80 kHz og fjærkonstanter på 2,7 N / m. Bommer med disse resonansfrekvensene og fjærkonstanter ble valgt på grunn av deres letthet i bruk.Bommer med større fjærkonstant og høyere resonansfrekvenser kan også brukes til avbildning. - Laste nøye head-stykke inn i AFM og koble de riktige ledningene (i dette tilfellet to ledninger må være plugget i: laserlys og sceneheis motor).
- Rett laseren på tuppen av cantilever. Noen enheter inneholde kamera funksjonalitet som gjør det mulig for lettere justering. Hvis kamerafunksjonalitet er ikke til stede på AFM, justere på cantilever spissen som beskrevet neste:
- Rotere front-to-back knotten med klokken for å flytte laseren overtop cantilever chip. Når laseren når brikken vil det bli blokkert, og vil ikke lenger være synlig. Slår bare knotten et par ganger.
- Rotere front-to-back rattet mot klokken til laserpunktet vises på nytt. Laseren er nå på brikken kanten.
- Roter venstre-til-høyre knapp for å plassere laseren på cantilever. Som laseren passerer over cantilever vil det forsvinne og dukke opp igjen jegn rask rekkefølge. Laserpunktet skal være synlig i frostet glassdekselet hvor fotodioden enheten vil senere sitte.
- Vri front-to-back mot klokken for å flytte sted nedover cantilever mot spissen til det stedet på frostet glass forsvinner.
- Vri front-to-back knotten med klokken bare litt for å posisjonere laseren slik at den bare sitter på cantilever spissen. Laserpunktet vil dukke opp igjen på frostet glass.
MERK: Dette er laser posisjoneringsmetoden for dykking pensjon bom. For trekantbommer, skiller justeringsprosessen litt.
- Når laseren er justert, hold scenen løftemotor i "åpen" stilling i 10 sek for å sikre nok plass mellom cantilever og prøve når du fester prøven til AFM.
- Plasser prøven på KPFM prøvetrinnet. Jorde prøven med en kobbertråd. Koble de aktuelle ledninger fra AFM til prøvetrinnet. Koble STage til AFM. I de fleste tilfeller trinnet holdes på plass ved hjelp av magneter.
- I AFM programvare, tune cantilever og deretter begynne tilnærming av cantilever tips til prøven. Sørg for at innsovningstid er satt til ikke mer enn 10 millisekunder, og at tilnærmingen hastigheter ikke overstige 2,0 mikrometer / sek for å unngå tips skade.
- Når cantilever spissen er på prøveoverflaten, velg en bildevindusstørrelse og ideell bildeområdet. Optimal I- og P gevinster sammen med braketsettpunktet slik at topografiske avbildning er optimalisert.
- Når topografisk bildebehandling er optimalisert, slå på KPFM modul (enten FM eller AM-modus, her bruker FM-modus). Det bør bemerkes at KPFM avbildning er svært utfordrende utsiden av 5 um x 5 um avbildning vinduet. Også, for optimal KPFM bildebehandling, bruker en 512 x 512 oppløsning med langsomme skannehastigheter (0,02 til 0,05 linjer / sek).
- For FM-KPFM innstillinger (ikke ACAFM innstillinger), sette driv prosent mellom 5 - 10%. Still cantilever frfrembringe frekvensskiftnøklede mellom 1-5 kHz med en båndbredde på 2 kHz. Satt jeg og P gevinster for FM-KPFM innstillinger til 0,3%.
- Variere signal båndbredde og jeg og P gevinster mellom prøveflater. For å optimalisere SP imaging, ytterligere justere signal båndbredde og jeg og P gevinster å få optimale bilder. Det anbefalte området av I og P gevinster er 0,22 til 0,35%.
- Bearbeide og analysere innsamlet KPFM bilder ved hjelp av post-bildebehandlingsprogram for å samle SP data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen til å måle SP ved KPFM bygger på prinsippet at både prøveoverflaten og cantilever spissen er ledende til en viss grad. Rustfritt stål og gull fungerte som ledende overflater som MRSA var festet. KPFM bildene ble tatt av 15 MRSA-celler på begge overflater med 512 x 512 oppløsning, og med skanne områder som spenner fra 5 x 5 mikrometer til 10 x 10 mm. Skanning ble gjennomført med linjehastigheter fra 0,02 linjer / sek til 0,05 linjer / sek. Derfor, med 512 datapunkter innsamlet per linje og 512 linjer som skal skannes, skanne ganger varierte fra 2,84 hr til 7.11 hr. De typer av bilder fanget kan sees i figur 2. KPFM opererer ved hjelp av to frekvenser, og som sådan, er topografiske bilder samtidig oppsamlet sammen med data om de elektriske egenskapene til overflaten. Termiske filtere ble anvendt til SP kart for å lettere å skjelne små endringer i overflatepotensialet (figur 2). Data fra SP maps wsom analyseres post-bildebehandlingsprogram for å bestemme gjennomsnittlig overflatespenninger og standardavvik. Statistisk analyse ble utført med R Open Source Statistiske programmering. Student t-tester ble utført for å sammenligne grupper med P <0,05 blir betraktet som signifikant.
SP bilder ble analysert for å bestemme mikrobiell membranoverflaten potensial. Disse ble så sammenlignet med veksten av de forskjellige substrat-overflater. Dette ble gjort for å bestemme hvis overflatetypen hadde en effekt på mikrobiell membranoverflaten potensial. Til å begynne med forsøkte vi å inkubere cellene MRSA statisk i 3 timer på substratoverflater. Men ingen tilknyttede mikrober var synlige under AFM. SP-data for ren og poly-L-lysin-funksjonaliserte overflater ble bestemt fra 5 x 5 um skannede områder. SP undersøkelser av nakne rustfritt stål og bart gull underlag viste samlede negative overflatespenninger (-0,045 ± 0,057 V og -0,126 ± 0,052 V, henholdsvis, P = 0,047, figur 3). Poly-L-lysin ble anvendt for å funksjonalisere overflaten for å gjøre dem mer gunstig for cellebinding. Funksjon overflater viste et skifte til positive overflatespenninger for rustfritt stål og gull overflater (0,133 ± 0,063 V og 0,126 ± 0,030 V, henholdsvis Figur 3). Vi undersøkte deretter membranpotensialer av MRSA på poly-L-lysin-funksjonaliserte rustfritt stål og gull overflater. Det ble funnet at MRSA cellemembranpotensialer varierte mellom rustfritt stål og gull overflater. Overflater i rustfritt stål ført til betydelig større positive membran SPs for celler i forhold til sitt gull motstykke. For eksempel, SP av MRSA-celler byttet fra positive til negative SPs. MRSA viste positiv SP på overflater av rustfritt stål med SP av 0,160 ± 0,022 V og SP på -0,025 ± 0,016 V på gulloverflater (P <0,001).
For å vise alle funksjoner på KPFM, et eksempelav en trinnhøyde graf av MRSA på rustfritt stål er anordnet (figur 4). Dette viser forskjellen i overflatepotensialet mellom substratoverflaten og den mikrobielle membran.
Figur 1. Arbeids prinsipper for atommikroskop (i) og Kelvin sonde force mikroskop (ii) Gjengitt med tillatelse fra (15). Den grunnleggende konfigurasjon av AFM er vist i (i). I AFM, er en skjerpet spiss festet til en utligger gjennom elektroavsetning. Mikromasch platina-belagt ledende DPE (støysvake) bommer ble brukt i dette forsøket hadde dimensjoner på 210 x 30 mikrometer, 80 kHz resonansfrekvens, og fjærkonstanter på 2,7 N / m. Bommer ble festet til et større chip for å tillate enkel håndtering. Når samlet i AFM, er en laser rettet mot cantilever spissen. Nedbøyninger i Cantilstadig tips blir oppdaget gjennom en fotodiode. Nedbøyninger brukes til å generere topografiske bilder. (Ii, a, b, c) viser arbeidsprinsippet KPFM. Cantilever bringes nær nok til overflaten for å tillate elektrisk kontakt oppstår. Forskjeller i overflatespenninger mellom spissen og overflaten forårsake at spissen for å avbøye. En likespenning tilføres for å korrigere for denne bøyning. Denne DC-spenningen er lik overflatepotensialet på substratoverflaten. Avhengig av hvilken type bildemodus brukes (heis, AM, FM), skiller denne arbeidsprinsipp litt. Figur 1 (ii) er blitt endret fra 15.
Figur 2. Representative topografi og overflate potensielle kartene over MRSA på poly-L-lysin-funksjonaliserte rustfritt stål og gull substrater. Bilder (I og III) viser representative topografi bilder av MRSA-celler på rustfritt stål og gull flater, hhv. Bildedimensjonene kan sees i X- og Y-aksen av disse bildene sammen med en motsvarende farget høydeprofil. (II og IV) viser de tilsvarende SP-kart av MRSA på de respektive overflater. Standard 'gull' fargefiltre ble brukt til topografi bilder mens termiske filtre ble brukt til SP bilder til lettere skjelne små endringer i SP. Det bør bemerkes at SP av substratoverflater var ikke homogen. SP ble funnet å være heterogent distribuert med tilsynelatende positive og negative områder på begge substrat-overflater. Dette kan sees rundt MRSA-cellene der heterogene SPs er observert på rustfritt stål og gull underlag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
52327 / 52327fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Overflate potensialet av substratoverflater og MRSA cellulære membraner. Figur 3 viser de tilsvarende KPFM data fra rustfritt stål (merket her som SS) og gull overflater, samt data fra 15 celler. Stjernene representerer signifikante forskjeller mellom prøver med antall stjerner som tilsvarer de sammenlignede prøver. MRSA-data ble oppsamlet fra cellene som var festet til funksjonaliserte overflater etter 30 min inkubering. Dette ble gjort på grunn av det faktum at ingen celler ble funnet å feste til de nakne substratoverflater etter 3 timer.
Figur 4. Trinn høyde overflatepotensial bilde av MRSA på poly-L-lysin-funksjonalisert rustfritt stål. Ved hjelp av post-bildebehandling, ble en step-høyde graf generert for å vise capabilibånd av programvare, så vel som, i merkbar forskjell i SP mellom substratets overflate og cellemembran. Tverrsnitts område valgt er representert på den tilsvarende SP kartet med den grå linjen. En omlegging fra 0,15 V på celleoverflaten til 0,21 V på underlaget overflaten er klart synlig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Selskap | Probe Type | Spring Constant (N / m) | Resonansfrekvens (kHz) | Cantilever Dimensjoner | Tips Apex Diameter |
| Asyl Forskning | AC240TM-R3 | 2 | 70 | Lengde = 240 mikrometer Width = 40 mikrometer </ Td> | 28 nm |
| Bruker AFM prober | SCM-PIT | 2.8 | 75 | Lengde = 225 mikrometer Width = 28 mikrometer | 20 nm |
| Mikromasch | Ledende DPE (Low-Noise) Utkragninger | 2.7 | 80 | Lengde = 210 pm Width = 30 mikrometer | 40 nm |
| Nano og mer USA | PtSi-NCH | 42 | 330 | Lengde = 125 mikrometer Width = 30 mikrometer | > 25 nm |
| Nanovitenskap Instruments | AppNano Ledende Tapping Mode AFM sonder. | 40 | 300 | Lengde = 125 mikrometer Width = 35 mikrometer | 30 nm |
| Nanovitenskap Instruments | AppNano Ledende Tapping Mode AFM sonder. | 40 | 300 | Lengde = 125 mikrometer Width = 35 mikrometer |
Tabell 1. Selskaper som tilbyr et bredt spekter av KPFM sonder. En rekke selskaper tilbyr nå KPFM spissen med varierende tippe apex diametre, fjærkonstanter og resonans frekvenser. Tips tilpasning er nær ubegrensede, med selskaper ofte tilbyr å bygge bommer med tilpassede spesifikasjoner for en tiltenkte eksperiment. De fleste KPFM sonder er platina belagt siliciumnitrid. Platinum gir ledende funksjonalitet til cantilever. Andre vanlige overtrekksmaterialer omfatter iridium, platina + iridium og gull. De fleste KPFM tips kan også alternativt brukes for elektrisk kraft mikroskopi (EFM). Tips apex er viktig for KPFM bom. Større diameter tips ofre høyere oppløsning topografi bildebehandling for mindre elektrisk støy. Omvendt, med mindre diameter tips (<25 nm) har forbedret topografi bildeoppløsning, men er mer utsatt for elektrisk støy. For denne studien, forskerne brukte Mikromasch oppførselive DPE (støysvake) bom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KPFM ble benyttet som en ny teknikk for å fremskaffe overflate elektriske data. Det har ofte blitt brukt som en metode for å undersøke distribusjon kostnad i kjemi og har bare nylig begynt å bli brukt for å studere biologiske systemer på mikro- og nanoskala. Fra de innsamlede dataene fant vi at mikrober ikke synes å lett feste å rengjøre rustfritt stål og gull overflater, selv etter tre timers statisk inkubasjon. Poly-L-lysin funksjon overflater viste rask mikrobiell vedlegg etter 30 min. Lengre inkubasjonstider av mikrober på funksjon overflater førte til celle befolkning på eksempel overflater, og fattige topografi bilder. Overflaten funksjon førte til et skifte fra negativ SP til positiv SP for rustfritt stål og gull overflater. Tidligere studier har vist at mikroorganismer har vanligvis negative SP grunn av sekvestrerende av negativt ladede ioner rundt cellene for å opprettholde det osmotiske og ioniske balanse 23. Det er også kjentat tilstedeværelsen av fosfatgrupper i Gram negative mikroorganismer og teichoic syrer i gram-positive mikroorganismer, videre fører til dannelse av negative SP 24. Kunnskap om grunnleggende kjemi av Gram positive og negative cellemembraner ledet oss til å anta at positive substrat SPs ville føre til rask mikrobiell vedlegg. Imidlertid, som det kan ses i figurene 2 - 4, at det var en stor forskyvning fra positiv til negativ MRSA celle SP på rustfritt stål og gull substrater, respektivt. Mikrobiell vedlegg kunne ha utgangspunktet skjedd fra beslaglegging av negative ioner rundt membranen. Ved vasking av cellene og la dem tørke på substratoverflatene, vi kunne ha blitt vasket bort denne ioniske medier. I tillegg bør det bemerkes at KPFM data er kun inkludert for de ytre cellevegg områder av Gram-positive (MRSA) celler. Det har vist seg i noen tilfeller at en mikroorganismer cellemembranpotensialet kan endres ved nærværet av Catiónic antimikrobielle peptider eller andre stressfaktorer 8.
Den ene største ulempen med KPFM sammenlignet med standard zetapotensial målinger på mikrobielle cellekulturer er at i KPFM innsamlede data er gjort på døde og tørkede celler. KPFM ble brukt til å undersøke generelle trender i celleoverflaten potensielle skift med hensyn til ulike vedlegg substratoverflatene. Anvendelsen av DC spenning til cantilever spissen (for å motvirke F es), sammen med kravet om en ledende prøveoverflaten, begrense standard KPFM til open-air bildebehandling. Imaging in polar væske er foreløpig ikke mulig med standard KPFM, og dermed avbildning av levende celler ved hjelp KPFM er ikke som foreløpig mulig. Utviklingen av ny åpen-sløyfe og dobbelfrekvens KPFM moduser har vist lovende i deres evne til bildeflater i lav-ioniske løsninger 18-20. Det er vårt håp at i fremtiden denne teknologien er videreutviklet slik at bildebehandling kan gjøres på live cellekulturer. Avbildning av celler i et mer naturlig miljø vil utvilsomt føre til generering av mer nøyaktige og realistiske cellemembran SP data. For denne studien ønsket vi å bruke denne teknologien på en ny måte å måle mikrobielle cellemembranpotensialer, samt studere vedheft karakteristikk av MRSA på en medisinsk relevant underlag. Ble observert endringer i mikrobielle membran SPs på inkubasjon på de ulike substratoverflatene. Dette kan bety at underlaget typen kan påvirke cellenes stoffskifte. Vårt håp er at denne foreløpige data kan føre til generering av nano-belegg med iboende elektriske ladninger som kan brukes til medisinske overflater eller utstyr (herunder andre materialer som bandasjer og trådnett) for å hindre mikrobiell vedlegg. Protokollen er beskrevet i denne artikkelen er ment å hjelpe forskerne å forstå prinsippene for KPFM og viser hvordan det kan brukes til å måle og lage SP maps.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D.
- Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
- Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
- Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
- Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
- Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
- Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
- Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
- Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
- Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
- Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
- Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
- Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
- Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
- Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
- Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
- Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
- Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
- Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).
