Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um kontinuierlich zu quantifizieren Zelladhäsion und de-Klebeprozesse mit hoher zeitlicher Auflösung in eine nicht-invasive Weise durch Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging analysiert. Diese Ansätze zeigen die Dynamik der Zelladhäsion / de-Klebeverfahren durch Matrixmodifikation und ihre zeitliche Beziehung, um die Haftung abhängige Signalereignisse ausgelöst.
Abstract
Zell-Matrix-Adhäsion spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Zellmorphologie und Signalisierung. Reize, Zellmatrixadhäsion (zB Myeloperoxidase und anderen Matrix modifizierende Oxidantien / Enzyme während der Entzündung freigesetzt) stören an der Auslösung pathologischen Veränderungen der zellulären Funktion, Phänotyp und Lebensfähigkeit in einer Reihe von Krankheiten in Verbindung gebracht. Hier beschreiben wir, wie Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging Ansätze kann leicht verwendet werden, um Echtzeit-Änderungen der Zelladhäsion und de-Haftung durch Matrixmodifikation induzierte genau zu quantifizieren (unter Verwendung von Endothelzellen und Myeloperoxidase als pathophysiologische Matrix-modifizierende Stimulus) mit hoher zeitlicher Auflösung und in einer nicht-invasiven Weise. Die xCELLigence Zell-Substrat-Impedanzsystem kontinuierlich quantifiziert den Bereich der Zell-Matrix-Adhäsion durch die Messung der elektrischen Impedanz bei der Zell-Substrat-Grenzfläche in den Zellen auf Goldmikroelektrodenarrays gezüchtet. Bildanalyse von Zeitraffer-differenTiAl-Interferenzkontrastfilme quantifiziert Veränderungen der projizierten Fläche der einzelnen Zellen über die Zeit, die Änderungen im Bereich der Zellenmatrix-Kontakt. Beide Techniken genau zu quantifizieren schnelle Änderungen an der Zelladhäsion und de-Klebeverfahren. Zell-Substrat-Impedanz auf Mikroelektroden-Biosensor-Arrays liefert eine robuste Plattform für Hochdurchsatz-Messungen. Live Cell Imaging Analysen liefern zusätzliche Details über die Art und Dynamik der morphologischen Veränderungen von Zell-Substrat-Impedanzmessungen quantifiziert. Diese komplementäre Ansätze liefern wertvolle neue Einblicke in die Myeloperoxidase oxidative Veränderung der subzellulären extrazelluläre Matrixkomponenten löst schnellen Veränderungen bei der Zelladhäsion, Morphologie und Signalübertragung in Endothelzellen. Diese Ansätze sind auch anwendbar für die Untersuchung der zellulären Adhäsion Dynamik in Abhängigkeit von einer anderen Matrix-modifizierenden Stimuli und den damit verbundenen anhaftenden Zellen (beispielsweise Epithelzellen).
Introduction
Für die Wartung der Gewebshomöostase sind stabile Klebe Kontakte zwischen Zellen und ihrer Umgebung extrazellulären Matrix erforderlich. Sie spielt beispielsweise endothelialen Zelladhäsion an der subendothelialen Matrix, in die Blutgefäße eine kritische Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der endothelialen Schicht und ihre homöostatischen Funktion als Regelungs semipermeable Gefäßschranke 1. Aktinzytoskeletts mechanisch gekoppelt Matrixmoleküle an Stellen von Zell-Matrix-Haftung und eine Kontakten an der Zellmatrix-Grenzflächenkleber spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Position der Zellmembran durch Widerstand zentral gerichteten Actomyosin Zugkräfte. Extrazelluläre Stimuli Zellmatrixadhäsion verändern das Gleichgewicht der Kräfte an der Zell-Matrix-Schnittstelle, ein Ereignis, das schnell ist notwendigerweise verändern '' erfaßt durch mechanosensitive Signalproteine, was bei der Übertragung von "außen nach innen Signalisieren". Das Übersprechen Wetteween Zellen und ihre umgebenden extrazellulären Matrix spielt eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Zellform, Motilität, Funktion, Proliferation und Überleben 2.
Diverse pathophysiologischen Prozessen (embryonalen Entwicklung, Entzündung, Wundheilung und Krebsmetastasen) durch dynamische Umgestaltung der Klebermatrix Substraten durch Matrix-abbauenden Oxidationsmittel und / oder Enzyme 3,4 gekennzeichnet. Zum Beispiel, Klebe subendothelialen Matrix Proteine in den Blutgefäßen (zB Fibronektin) werden als Hauptziele für eine Änderung oder Abbau im menschlichen entzündlichen Erkrankungen aufgrund der lokalisierten Produktion von reaktiven Oxidantien beteiligt (zB Hypochlorsäure, HOCl) durch die Leukozyten stammende Enzym Myeloperoxidase (MPO), das innerhalb des Subendothel bei entzündlichen Gefäßerkrankungen (Abbildung 1) 5-9 ansammelt. Veränderungen Zellmatrixadhäsion von MPO abgeleiteten Oxidationsmitteln und anderen Matrix modifizierende Stimuli induziert werden likEly wichtige Rollen in Ändern vaskulären Homöostase bei einer Vielzahl von pathologischen Prozessen spielen, zB durch Verändern endothelialen Zellsignalisierung, Morphologie und Lebensfähigkeit, was wiederum stört Endothelfunktion und Barrierenintegrität. Jedoch werden die morphologischen und Zellsignalantworten der adhärenten Zellen an extrazelluläre Matrix-Änderungen erst beginnt zu verstehen.
Um zu verstehen wie Matrix Änderungen treiben Veränderungen in Zelladhäsion Dynamik und Haftung abhängigen Zelle Signalwege, sind Techniken erforderlich, dass Veränderungen in der Zell-Matrix-Adhäsion in Echtzeit genau zu quantifizieren, mit hoher zeitlicher Auflösung. Hier beschreiben wir komplementären Zell-Substrat-Impedanz und lebenden Zellen Techniken, die diese Kriterien erfüllen, und eine Plattform, um die Zellhaftung und de-Adhäsionsvorgänge in einer nicht-invasiven Weise zu quantifizieren.
Wir zeigen, wie diese Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging approSchmerzen können leicht zu (i) verwendet werden, die Dynamik der Zellhaftung zu überwachen und zu verbreiten (dh De-novo-Zell-Adhäsion) auf native und modifizierte Matrix Substraten und (ii), die Dynamik der Zell-Matrix-Ablösung zu messen (dh de-Haftung ) von anhaftenden Zellen zu Matrix-modifizierende Reizen ausgesetzt. Das xCELLigence Zell-Substrat-Impedanz-Biosensor-System bietet eine kontinuierliche Messung der Bereich der Zell-Matrix-Kontakt durch die Quantifizierung der elektrischen Impedanz an der Oberfläche des 96-Loch-Gold-Mikroelektroden-Arrays und drückt diese elektrischen Impedanzmessungen als "Zell Index", ein dimensionsloser Wert, ist weitgehend proportional zu der Fläche der Zell-Substrat-Kontakt 10 (Figur 2), aber doch in der empfindlich gegenüber Änderungen in der durchschnittlichen Entfernung zwischen dem (isolierend) Zellmembran und der Elektrodenoberfläche 11. Ein weiterer Anstieg der Zellenindexwerte ist auch bei der Bildung des engen Zell-Zell-Kontakte erreicht That beschränken para Strom fließt, 11 Bedingungen, die nicht im Rahmen der in dieser Studie beschriebenen Experimente durchsetzen müssen. Messung der projizierten Fläche der einzelnen Zellen über die Zeit durch Bildanalyse von Zeitraffer Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Filme eine komplementäre Messung der Veränderungen im Bereich der Zell-Substrat-Kontakt und stellt zusätzliche Informationen über die genaue Art und Dynamik der morphologische Veränderungen durch die Zell-Substrat-Impedanz Ansatz quantifiziert.
Genauer gesagt, die Anwendung dieser Methoden zu überwachen, wie MPO-vermittelten Oxidation von Klebstoff subendothelialen Matrix Proteine (zB Fibronektin) (i) reduziert die de novo Adhäsion der suspendierten Endothelzellen auf gereinigtes Fibronectin und (ii) auslöst Zell-Matrix de beschreiben wir -adhesion in Endothelzellen mit etablierten Haftung auf Fibronektin. Durch die Ausführung parallel Zellsignalanalysen im Laufe der Zeit mit relevanten biochemchemischen Assays (zB Western-Blotting), der zeitlichen und kausalen Beziehungen zwischen Adhäsion / Enthaftung Verfahren und damit verbundenen Änderungen der Adhäsion abhängigen Zellsignalisierungsereignisse bestimmt werden.
Diese Ansätze wurden kürzlich verwendet, um zu zeigen, dass die extrazelluläre Matrix, die Oxidation durch subendotheliale Ablagerungen von MPO katalysierten löst einen schnellen Verlust in Zell-Matrix-Adhäsion von Endothelzellen, die von bereits existierenden Actomyosin Kontraktionskräfte 9 angetrieben wird. Wichtig ist, indem die zeitliche Beziehung zwischen den Veränderungen in beiden Zell-Adhäsion und Haftung abhängige Zell-Signal ermittelt werden, diese Ansätze identifiziert, die MPO-induzierte Matrixmodifikation und zellulären de-Haftung löst Veränderungen in wichtigen Haftung abhängigen Zelle Signalwege einschließlich Src-Kinase -abhängigen Paxillin-Phosphorylierung und Myosin Light Chain II-Phosphorylierung (Abbildung 1) 9. Diese Art der redox-abhängige Signal, involving die Aktivierung intrazellulärer Signalwege durch extrazelluläre oxidative Reaktionen, die Zell-Matrix-Adhäsion zu stören, stellt eine neue Art der Zellsignalisierung "outside-in Redox-Signalisierung" (Abbildung 1) bezeichnet 9.
In der Regel sollten diese komplementären Zell-Substrat-Impedanz-Biosensor-und Live Cell Imaging Ansätze wertvoll bei der Aufdeckung, wie verschiedene Matrix-modifizierende Reize oder Agenten fahren Veränderungen der Zelladhäsion Dynamik, Morphologie und Signal innerhalb verschiedener adhärenten Zelltypen unterliegen einer Vielzahl von sein Versuchsanordnungen.
Das folgende Protokoll beschreibt, wie die Auswirkungen der MPO-vermittelte Matrix Oxidation auf De-novo-Endothelzelladhäsion (Experiment 1) und Endothelzellen de-Haftung (Experiment 2) Prozesse zu quantifizieren. MPO bindet sich begierig an Fibronektin und andere Klebe subendothelialen extrazellulären Matrixproteinen und unses Wasserstoffperoxid (H 2 O 2), um Chloridionen (Cl -) umzuwandeln, um das hochreaktive chlorierenden Oxidationsmittel Hypochlorsäure (HOCl), welche lokal mit diesen Matrixproteinen reagiert und stört deren Zellhaftfähigkeit (1) 8,9, 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zell-Matrix-Adhäsion und de-Klebeprozesse genau und in Echtzeit mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging-Analysen quantifiziert werden. Diese Echtzeit-Ansätze bieten einen großen Vorteil gegenüber Endpunktanalysen der Zelladhäsion, die schlechte zeitliche Auflösung zur Verfügung. Durch die präzise Quantifizierung schnellen de-Haft Reaktionen mit hoher zeitlicher Auflösung kann diese Analysen kritische Einblicke in geben, wie morphologische Reaktionen auf …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
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