Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.
Hücre-matris yapışma hücre morfolojisini kontrol ve sinyalizasyon önemli bir rol oynar. Hücre-matris yapışma (örneğin, miyeloperoksidaz ve diğer matris düzenleyici oksidanlar / iltihap sırasında ortaya çıkan enzimler) bozan etmenler de hastalıkların bir dizi hücresel fonksiyonu, fenotip ve canlılığı patolojik değişiklikleri tetikleyerek söz konusu olmaktadır. Burada, (a patofizyolojik matris düzenleyici uyarıcı olarak endotel hücreleri ve myeloperoksidaz ile), hücre-alt-tabaka empedans ve canlı hücre görüntüleme teknikleri kolayca doğru hücre yapışmasının ve matris modifikasyonu ile indüklenen de yapışma gerçek zamanlı değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir açıklanmıştır Yüksek zamansal çözünürlüğe sahip ve non-invaziv bir şekilde. XCELLigence hücre alt-tabaka empedans sistemi sürekli altın mikroelektrot diziler üzerinde yetiştirilen hücreler, hücre-alt-tabaka ara yüzeyinde elektrik empedansı ölçmek suretiyle hücre-matris yapışma alanını ifade etmektedir. Resim analizi zaman atlamalı ayırıcısıcaklık üzerindeki girişim zıtlık filmler hücre-matris temas alanında değişiklikleri temsil eden zaman içinde, tek tek hücrelerin öngörülen alan değişiklikleri ifade etmektedir. Her iki teknik doğru hücresel yapışma ve de-yapışma süreçlerine hızlı değişiklikler ölçmek. Mikroelektrot biyosensör dizileri Hücre-substrat empedans sağlam, yüksek hacimli ölçümler için bir platform sağlar. Canlı hücre görüntüleme hücre-substrat empedans ölçümleri ile sayısal morfolojik değişikliklerin doğası ve dinamikleri ile ilgili ek detay sağlamak analizleri. Bu tamamlayıcı yaklaşımlar hücre içi hücre dışı matris bileşenleri miyeloperoksidaz-katalize oksidatif modifikasyonu hızlı hücre yapışması, morfolojisi değişiklikler ve endotel hücreleri sinyal tetikler nasıl değerli yeni anlayışlar sağlar. Bu yaklaşımlar, diğer matris-modifiye uyarılara ve ilgili diğer yapışıcı hücreler (örneğin, epitelyal hücreleri) yanıt olarak hücre yapışma dinamiğini çalışmak için de geçerlidir.
Hücreler ve kendi çevre hücre dışı matris arasındaki kararlı yapışkan temas doku homeostazının muhafaza için gereklidir. Örneğin, kan damarlarında endotel altı matris endotelyal hücre yapışma endotelyal tabakanın bütünlüğünü ve düzenleme, yarı geçirgen bir bariyer vasküler 1 olarak homeostatik fonksiyonunu korumada bir rol oynar. aktin hücre iskeleti mekanik merkezi yönlendirilmiş aktomizin çekme güçlerine karşı hücre zarı konumunu belirlemede önemli bir rol oynadığı hücre-matris arayüz de hücre-matris yapışma ve yapışkan temas bölgelerinde matris moleküllerini yapışkan ile birleştirilir. Mutlaka hücre-matriks arayüzünde güçler dengesini, hızla bir olay alter hücre-matriks yapışmasını değiştiren Ekstrasellüler uyaranlara "dış-iç sinyal" transdüksiyonunda sonuçlanan, mekano duyarlı sinyal proteinleri tarafından 'algılanan'. Bu çapraz-konuşma bahisrinde hücreleri ve kendi çevre hücre dışı matris hücre şekli, motilite, işlev proliferasyonu ve hayatta kalma 2 kontrol edilmesinde anahtar bir rol oynar.
Çeşitli pato-fizyolojik süreçler (embriyonik gelişme, iltihaplanma, yara iyileşmesi, kanser metastazı) matris derecelendirme oksidanlar ve / veya enzimler 3,4 yapışkan matris maddeleri dinamik yeniden ile karakterize edilir. Örneğin, kan damarlarında endotel altı matris proteinleri yapışkan (örneğin, fibronektin) bağlı reaktif oksidanlar lokal üretimi için insan iltihaplı hastalıklarda değiştirilmesi veya bozulması için önemli bir hedef olarak implike edilmiştir (örneğin, hipokloröz asit, HOCl) lökositten türetilmiş bir enzimle inflamatuar damar hastalığı (Şekil 1) 5-9 esnasında subendotelyuma içinde birikir miyeloperoksidaz (MPO),. MPO türetilmiş oksidanlar ve diğer matris-modifiye, uyarıcıya tepki olarak hücre-matris yapışma değişiklikler lik olanda endotel fonksiyonu ve bariyer bütünlüğünü bozarak endotel hücre sinyal, morfolojisi ve canlılığı, değiştirerek, örneğin; ely patolojik süreçlerin çeşitli sırasında vasküler homeostazı değiştirerek önemli roller oynamaya. Ancak, hücre dışı matriks değişiklikler yapışık hücrelerin morfolojik ve hücre sinyal tepkiler sadece anlaşılmaya başlıyor.
Matris değişiklikler hücre yapışması dinamikleri ve yapışma-bağımlı hücre sinyal yolları değişiklikleri sürücü anlamak için, teknikler doğru yüksek zamansal çözünürlüğe sahip, gerçek zamanlı hücre-matriks yapışma değişiklikleri ölçmek olduğunu gereklidir. Burada, biz tamamlayıcı hücre-substrat empedansını ve bu kriterleri yerine getirmek ve non-invaziv bir şekilde hücre yapışmasını ve de-yapışma süreçleri ölçmek için bir platform sağlamak canlı hücre görüntüleme teknikleri tarif.
Biz göstermek nasıl bu hücre-substrat empedans ve canlı hücre görüntüleme beğenmeağrıları hali hazırda hücre eki dinamiklerini izlemek ve doğal ve modifiye matris substratlar üzerine (örneğin, de novo hücre yapışması) yayılma ve (ii) (örneğin, de-yapışma hücre-matris ayrılma dinamiklerini ölçmek için (i) için kullanılabilir ) matris-modifiye uyaranlara maruz yapışık hücreler tarafından. XCELLigence hücre alt-tabaka empedans biyosensör sistemi 96 oyuklu altın mikroelektrot dizileri yüzeyinde elektrik empedansı ölçmek suretiyle hücre-matris temas alanının bir sürekli ölçme, "hücre dizini ', boyutsuz bir değerdir ve bu elektrik empedans ölçümleri ifade eden Ayrıca (yalıtım) hücre zarı ve elektrot yüzeyi 11 arasındaki ortalama mesafe değişikliklere duyarlı varlık iken, hücre-substrat teması 10 (Şekil 2) alanına büyük ölçüde orantılıdır. Hücre indeksi değerleri bakımından bir başka artış da sıkı hücre-hücre temas tha oluşması ile elde edilirt, bu çalışmada açıklanan deneyler içinde geçerli değil 11 koşullarını paraselüler akım akar kısıtlamak. Hızlandırılmış diferansiyel girişim kontrast resim analizi ile, zaman içinde hücre çıkıntı yapan alanının ölçümü (DIC), filmler hücre alt-tabaka temas alanında değişiklik tamamlayıcı ölçümünü sağlar ve kesin yapısı ve dinamikleri ile ilgili ek bilgiler sağlar Hücre-substrat empedans yaklaşımı ile ölçülebilir morfolojik değişimler.
Özellikle, (örneğin, fibronektin): (i) yapıştırıcı, alt endotelial matris proteinlerinin oksidasyon MPO aracılı nasıl kullanıldığını izlemek arıtıldı fibronektin ve (ii) tetikler hücre-matris de üzerine süspansiyon endotel hücreleri de novo yapışmasını azaltır, bu yaklaşımların bir uygulama tarif fibronektin kurulan yapışması ile endotel hücreleri -yapışma. Paralel hücre sinyal gerçekleştiren ilgili Biochem kullanarak zamanla analizleri ilenik deneyler (örneğin, Western blot), yapışma bağımlı hücre sinyal olayları adezyon / de-yapışma süreçleri ve ilgili değişiklikleri arasındaki zamansal ve nedensel ilişki belirlenebilir.
Bu yaklaşımlar en son MPO subendotelyal yatakları ile katalize hücre dışı matris oksidasyon önceden var olan aktomizin kasılma güçleri 9 tarafından tahrik edilen endotel hücrelerinin hücre-matris yapışma hızlı kayıp tetikler olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Önemlisi, hem hücre yapışması değişiklikler ve tespit edilecek sinyal yapışma bağımlı hücre arasındaki zamansal ilişki sağlayarak, bu yaklaşımlar MPO kaynaklı matris modifikasyonu ve hücresel de-yapışma Src kinaz gibi önemli yapışma-bağımlı hücre sinyal yolları değişiklikleri tetikler olduğu tespit bağımlı paxillin fosforilasyon ve miyosin hafif zincir II fosforilleme (Şekil 1) 9. Redoks-bağımlı sinyal, inv Bu modhücre-matris yapışmasını bozan hücre dışı oksidatif reaksiyonları ile hücre içi sinyal olaylarının aktivasyonu SORUN hücrenin yeni bir şekli "dışarıdan içeriye redoks sinyal" (Şekil 1) olarak adlandırılan sinyalizasyon temsil 9.
Genel olarak, bu tamamlayıcı hücre alt-tabaka empedans biyosensör ve canlı hücre görüntüleme teknikleri matris düzenleyici uyarı ya da maddeler, hücre yapışması dinamiği, morfoloji değişiklikleri sürücü kadar farklı ifşa ve çeşitli tabi olan farklı yapışık hücre türleri içinde sinyalizasyon değerli olmalıdır Deneysel ayarları.
Aşağıdaki protokol de novo endotel hücre yapışması (Deney 1) ve endotel hücre de-yapışma (Deney 2) süreçleri üzerinde MPO-aracılı matris oksidasyon etkisini ölçmek açıklamaktadır. MPO fibronektin ve diğer yapıştırıcı subendotelyal hücre dışı matriks proteinleri ve bize heyecanla bağlanıres (H2O 2) klorid iyonu (Cı -) dönüştürmek için hidrojen peroksit, bu matris proteinleri ile lokal olarak reaksiyona girer ve hücre yapışma özelliklerini (Şekil 1) 8,9 bozan yüksek reaktif bir klorlama oksitleyici hipokloröz asit (HOCI) 'e, 12.
Cell-matrix adhesion and de-adhesion processes can be quantified accurately in real time with high temporal resolution using cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These real-time approaches provide a major advantage over end-point analyses of cell adhesion, which provide poor temporal resolution. By accurately quantifying rapid de-adhesion responses with high temporal resolution, these analyses can provide critical insights into how morphological responses to matrix modifications are regulated and how …
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |