Protocol
모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 (NIH) 가이드의 국립 연구소에 따라 수행하고, 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1) 수술 전 준비
- 구강 솔루션 준비
- 10 % 자당과 탈 이온수에 0.005 %의 L - 멘톨 (PH 7.4)의 솔루션을 만듭니다. 실온에서, 밀폐 용기에이 솔루션을 저장하고 저하를 방지하기 위해 2 주마다 리메이크.
- 전극 보정 용액
- 교정하기 전 언제든지 트리스 완충액 (pH 7.4)을 확인. 이 솔루션은 12.0 mM 트리스 - 염산, 140 mM의 염화나트륨, 3.25 mM의 KCl을, 1.20 mM의 CaCl2를, 1.25 mM의 NaH2PO4, 1.20 mM의의 MgCl 2, 2.00 mM의 나 2 SO 4로 구성되어 있습니다.
- 0.1 M 과염소산에서 10 mM의 도파민 (도파민 염산염 DA)의 원액을 만듭니다. 과염소산은 dopamin의 산화를 방지하는 데 도움이전자. -20 ° C에서이 원액을 저장하고 최대 6 개월 동안 사용합니다. 한 번만 각 나누어지는을 사용하려면 저장을 위해 다 원액의 여러 분취 량을 확인합니다.
- 10 mM의 다 재고, 1 ㎛, 500 nm의, 250 nm의, 125 nm의, 62.5 nm의, 및 31.25 nM의 농도에 트리스 버퍼 솔루션을 희석.
- pH 보정을 위해, 트리스의 솔루션은 7.2, 7.3, 7.5, 7.6의 pH와 버퍼를 준비합니다. 이 생체 실험 중 발생할 수의 pH 변화를 모방 솔루션을 제공 할 것입니다.
- 전극 제조
- 진공 흡인 (직경 0.4 mm 내부에 길이 10mm, 외경 0.6 mm) 보로 실리케이트 유리 모세관에 T-650의 탄소 섬유 (7 μm의 직경) 대기음.
- 수직 전극 풀러에 탄소 섬유로 채워진 유리 모세관을 놓습니다. 초기 매개 변수의 경우, 55.0에 히터를 설정하고 자석을 끕니다. 히터 및 자기 설정 둘 다를 FR 그러나, 상기 최적화는 필요할 수도실험실에 옴 실험실.
참고 : 전극이 쉽게 미세 조작기에 적합하고 쥐의 뇌 경질보다 적어도 6.9 mm를 삽입 할 수 있도록 (테이퍼 포함) 적어도 5.5 ㎝ 길이이어야한다. 전극이 너무 짧으면, 중격 의지 핵의 복부 부분으로부터 기록은 달성되지 않을 것이다. 한편, 전체 전극 길이는 미세 조작기에 너무 길어 것이다 그렇지 6.5 cm를 초과하지 않아야한다. - 이 유리의 단부 너머 75-100 μm의 연장되도록 광학 현미경을 사용하여, 노출 된 탄소 섬유를 잘라. 전극이 연속 촬영시 최소한의 노이즈가 발생합니다 유리 전극과 탄소 섬유 사이의 아주 꽉, 겨우 식별, 인감을 가지고 있는지 확인합니다. 가난한 실 나타내는 유리 또는 실이 느슨하면 눈에 띄는 균열이있을 경우 전극을 폐기하십시오. 더 자세한 설명은 [12]과 [13]를 참조하십시오.
- 마이크에 전극을 조립romanipulator
- 와이어의 길이를 따라 절반으로 절연되어 3에 30G 와이어를 구하여 은의 얇은 층이 와이어에 직접 페인트 적용 작은 붓을 사용한다. 즉시 실버 페인트를 도포 한 후, 탄소 섬유의 물리적 및 전기적 접속을 제공하는 전극의 상단에 구멍에 와이어를 삽입한다. 현미경, 은선은 탄소 섬유와 접촉하는 것을 보장한다.
- 열 수축을 사용하여 미세 조작기에 실버 와이어 전극을 고정합니다.
- 전극 표면을 청소할 도파민 후의 감도를 증가시키기 위해, 적어도 10 분 동안 정제 된 이소 프로필 알코올 (IPA)로 제조 된 탄소 섬유 전극을 배치. IPA에 몸을 담근 후, IPA를 제거하기 위해 수돗물로 탄소 섬유 린스.
- 기준 전극 제조
- , 약 6mm AG / AG CL 메쉬 (단독 7mm 실버 와이어, 6mm 메쉬, 0.4 mm 직경)를 포함하는 13mm 실버 와이어를 타고아래쪽 절반 정도 원래 길이 실버 부를 잘라 골드 핀 와이어의 실버 부분 납땜.
- 핀에 납땜을 통해 에폭시를 적용합니다.
- AG을 담그고 / AG CL 5 % 폴리 테트라 플루오로 에틸렌과의 공중 합체로 최종 메쉬 퍼플 루오로 -3,6- 디 옥사 -4- 메틸 설 7octene 각 DIP간에 30 분간 공기 건조 기간을 가진 산 5 번.
- 코팅 AG / AG (CL)은 건조 공기의 O / N에 메쉬 허용합니다.
- 1 시간 동안 120 ºC에서 오븐에서 큐어.
2) 결합 구강 외과 및 두개 내 캐 뉼러 수술 (약 75 분)
- 구강 카테터 제조
- 경구 카테터를 확인하고, 적어도 10 일 전에 수술, 산화 에틸렌 멸균 소독.
- 6cm 길이 세그먼트로 PE (100) 튜브를 잘라.
- 납땜 인두를 사용하여 PE 튜브의 한쪽 끝을 녹여 즉시 PE 튜브를 냉각하기 위하여 고체 표면에 키를 누릅니다. 결과는 만들어야합니다작은 평면 PE 배관의 일단은 디스크 및 플랜지되어서는 안된다. 바늘 (18 G)를 사용하거나 디스크의 중앙에 구멍을 만드는 푸시 핀.
- PE 튜브의 다른 쪽 끝에서 꼭 튜브에 18 G 바늘의 뭉툭한 끝을 삽입합니다.
- 표준 용지 홀 펀칭기를 사용하여, 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 와셔를 만들 수 (3.18 mm 두께, 직경 6mm) 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 시트의 여러 원형 조각을 펀치.
- 세탁기의 중앙에 구멍을 만든다. PE 관에 부착 된 바늘을 가지고 세탁기를 완전히 밀어 넣습니다. 바늘이 통과되면 그것은 세탁기에 대하여 높이가되도록, PE 관의 바닥에 세탁기를 밀어 넣습니다.
- 구강 외과
- (멸균하기 전에 페데스탈 2.5 mm 이하로 트리밍) 수술 도구, 캐 뉼러, 및 참조 전극을 멸균 후 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사로 쥐를 마취.
- AF터 5 분간은 마취의 수준을 평가하는 유해 자극 시험 (발 또는 테일 핀치)를 적용한다. 피사체가 유해 자극 테스트에 물리적 인 반응을 표시하는 경우, (호흡이나 심장 박동에 반응 증가를 움찔) 원래 용량의 15 %에 10 %의 케타민 향상을 관리하고 위의 유해 자극 프로토콜을 반복합니다.
- 쥐가 완전히 마취하고 유해한 자극 테스트에 아무런 반응을 보이지 않는다 후, 귀 뒤에 약 2 mm로 눈에서 쥐의 털을 면도 동물 헤어 가위를 사용합니다. 이어서 수술 동안 체온을 유지하기 위해 얇은 물 재순환 가열 패드를 배치 쥐. 눈 윤활제를 적용합니다. 종래 어떤 절개 수행하기 전에 구강 캐 뉼러를 삽입에 복강 내 주사함으로써 비 스테로이드 항염증제 (NSAID) 약물, 카프로 펜 (5 ㎎ / ㎏)을 투여. 항상 무균 기술을 사용합니다.
- 피부를 청소하기 위해 70 % 에탄올 다음 betadine을 적용합니다. 3 번 반복합니다.
- 괞 찮아그 뒷면에있는 쥐를 CE 및 멸균 면봉을 사용하여 입을 엽니 다. 제 1 상부 몰을 찾아보십시오.
- 바늘이 바로 뒤에 종료 될 때까지 뺨과 제 1 상부 몰 사이의 조직에 바늘을 삽입하고 귀에 내측.
- 피어스 PE 튜브 때까지 피부를 통해 바늘이 피부를 종료하고 액세스 할 수 있습니다.
- (정맥 자체가 아니라 바늘 그립) 캐 뉼러를 위로 당기고 카테터가 제 위치에 유지되도록 어금니에 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 와셔를 고정합니다.
주의 :이 단계를 용이하게 사다리꼴 형상으로 절단 및 와셔 뺨 대향 평탄면 어금니에 대해 그것을 고정. - 다른 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 세탁기를 타고 플라스틱 튜브 아래, 노출 된 바늘에 그것을 밀어하고, 절개에 접촉.
- 세탁기가 미끄러지지 않도록 삼각형 "플래그"를 만들기 위해 멸균 테이프를 사용, 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 와셔를 고정합니다. 세척 보안쥐의 피부와 멸균 테이프에 대한 어.
- 튜빙 2-4 센티미터 쥐의 머리 위에 노출 될 수 있도록 노출 된 카테터를 잘라.
- 반복 입의 반대쪽 2.2.10를 통해 2.2.1 단계를 반복합니다.
- (멸균하기 전에 페데스탈 2.5 mm 이하로 트리밍) 수술 도구, 캐 뉼러, 및 참조 전극을 멸균 후 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사로 쥐를 마취.
- 전압 전류에 대한 두개 내 수술
- (3주기를 반복하여 수행, 70 % 에탄올 스크럽 다음 betadine 스크럽) 정위 프레임에서 쥐를 놓고 2 단계 스크럽을 사용하여 동물의 두피를 청소합니다.
- 두피 조직의 15 X 15mm 부분을 절단하기 위해 멸균 바늘 코 핀셋 및 수술 가위를 사용합니다.
- 부드럽게 멸균 면화 팁 어플리케이터를 이용하여 두개골의 표면을 청소. 또한 3 % 과산화수소 2 ~ 3 방울을인가함으로써 두개골을 청소.
- 참조 차기 나사의 후속 삽입을위한 두개골에 3 작은 (1 mm 직경) 구멍, 가이드 캐뉼라 1 구멍, 자극 전극 1 홀 1 홀을 만들기 위해 정위 드릴을 사용하여탔다.
- NAC의 핵심에서 녹음을 위해, 1.2 mm 전방에서 가이드 캐뉼라를 놓고 1.4 mm의 브레 그마 측 방향. 플라스틱베이스는 두개골과 같은 높이가 될 때까지 정맥 장치를 낮 춥니 다.
- 가이드 정맥에 반구의 반대편에 멸균 기준 전극을 배치합니다. 기준을 경질 아래 약 2mm를 낮 춥니 다.
- 5.2 mm의 후방과 브레 그마 1.0 mm의 측면에 자극 전극을 놓고 복부 피개 영역 (VTA)을 대상으로 경질 아래에 8.0 mm를 하향 조정했다.
- 두개골에 나사를 확보하기 위해 멸균 작은 수술 드라이버를 사용합니다. 이어서, 전극을 자극, 기준 전극을 삽입하고, 캐 뉼러 가이드. 마지막으로, cranioplastic 시멘트를 사용하여 모든 구성 요소를 고정합니다.
- 수술 후의 치료의 첫 48 시간, 피하 주사 (5 ㎎ / ㎏)에 의해 비 - 스테로이드 계 소염 약물 (NSAID) 카프로 펜을 투여. 이전 voltam을 수행하는 완전한 수술 복구를 위해 적어도 일주 허용metry 기록.
- 수술 후 치료하는 동안, 매일 물로 구강 카테터. 씹는 먹는에 동물을 돕기 위해 2 일 동안 물에 포화 음식을 제공합니다. (때문에 가벼운 감염이나 탈수에) 고통의 스트레스의 잠재적 징후를 매일 모니터링을 제공하고 필요에 따라 적절한 개입을 제공 (유체의 관리, 방부제의 국소 투여를 포함하고, 또는 NSAID 카프로 펜 관리 5 ㎎ / ㎏에서).
3) 깨어있는 순환 전류 전압 곡선 녹음, 자유롭게 이동 쥐
- 전극을 낮추고 DA 훈련 세트를 획득.
- 실험의 날, 물 200 μl를 주입하고 구강 안면 반응을 관찰하여 구강 정맥의 개통을 확인 (쥐가 물 시음되어 있는지 확인합니다).
- 바이폴라 자극 전극 cannu로 (headstage)에 자극 전극을 삽입하여 쥐에 FSCV의 headstage 첨부라 (쥐). 따라서 headstage (전류 전압 변환기를 소형화)는 양극성 자극 전극에 직접 접속한다.
- 캐 뉼러 장치로부터 더미 캐뉼라를 제거하고 캐 뉼러로 50 % 헤파린 용액 2 방울을 적용한다. 부드럽게 이후 실험 기간 동안 삽입됩니다 탄소 섬유 전극을 깰 것이다 발생할 수있는 혈전이나 아교 흉터, 취소 (이전에 제거 된 더미 정맥가 약간 이상) 더미 캐뉼라를 삽입합니다. (적어도 2mm 기록 사이트 위) 두개골 아래에 혈전에게 3-4mm를 삭제에 사용되는 정맥을 확장합니다.
- 가이드 정맥으로, 전극, 미세 조작기를 삽입하고 "잠금"위치에 오메가 링을 배치합니다.
- 해당 핀에 headstage에서 기준 전극 와이어를 연결합니다. 그런 다음 headstage에 해당 와이어 미세 조작기에서 작동 전극 와이어를 연결합니다.
- ELEC를 내립니다두개골 아래 약 4-4.5 mm의 trode.
- 삼각 파형 (400 V / S, -0.4로 1.3 V)를 적용 할 텐쇼를 사용합니다. 후속 실험 기록을 위해 10 Hz로 파형인가 빈도를 변경, 적어도 10 분 동안 60 Hz에서 전극의 파형을 적용한다.
참고 : 60 Hz의 파형 도포 공정이 안정된 탄소 섬유 표면을 생성 및 전기 드리프트를 방지 할 - DA 방출하여 pH 상이한 농도를 연상, 모든 2 MS / 위상의 펄스 폭 VTA 다양한 주파수 펄스 (10 내지 30 펄스)과 전류 (50 내지 150 μA) (10에서 60 Hz)를 사용하여 전기 자극을 가하기 변화. DA 릴리스의 적어도 5 가지 농도와 5 가지의 pH 변화를 취득. 소포 재로드 [14] 수 있도록 자극 사이 - (3 분 최소 2)를 기다립니다.
참고 : 다음 중 수집됩니다 전체 범위에 걸쳐 DA 농도를 생산 자극을 얻기 위해 중요하다그들이 주요 구성 요소 분석 (5.1 절 참조) 훈련 세트로 사용되기 때문에 실험. - NAC 코어 (DURA 6.3 밀리미터 복부)에 전극을 낮 춥니 다. 과도 DA 놓기 이벤트는 분 당 적어도 하나의 주파수에서 관찰 될 때까지 계속해서 NAC 코어 내에서 100 ㎛ 단위로 전극을 낮 춥니 다.
- 주사기 펌프에 부착 된 20 mL의 주사기에 튜브 (내경이 1/32 "외경 3/32")을 연결한다. 상기 튜브의 다른 쪽 끝에, 쥐의 정맥에 튜브를 연결하는 경 사진 23 G 바늘을 사용한다. 튜브가 원하는 tastant 완전히 충전되어 있는지 확인하고, 거품이 튜브에 없는지 확인합니다.
주 : 일반적으로, 이전에 기록 주입 제는 전체 투여 량 아니라 튜브의 잔류 물 또는 공기를 전달하도록 레코딩을 쥐의 입으로 tastant 소량을 관리. 또한,이 몇 가지 사전 경험 재치을 가지고 동물을 허용한다H 소설 tastants 이후 tastant, 심지어 appetitive 사람은, 인해 참신에 처음 혐오가 될 수 있습니다. - 데이터 수집, tastant 200 μL (6.5 펌프를 사용하여 초 이전에 설명 튜브)를 달이다. tastant마다 1-3 분 달이다. tastant 당 25 배의 총 달이다. 각 주입 용액 200 μl를 제공합니다.
- 여러 tastants은 하나의 실험에 전달되는 경우, 하나 tastant에 대한 데이터를 수집 한 후 물과 함께 경구 용 카테터를 세척하고 새 tastant를 주입하기 전에 적어도 20 분을 기다립니다.
- DA 기록 세션 후에, 상기 기록 위치에 작은 병소를 생성하여 조직 학적 확인을 위해 준비한다. 후속 캘리브레이션에 대한 탄소 섬유의 전극을 보존하기 위해, 먼저 전극을 후퇴 미세 조작기를 제거한다. 원래 탄소 F로 (경막 아래) 같은 깊이에 유리 미세과 (유리 팁을 넘어 100 μm의 연장) 텅스텐 와이어 새로운 미세 조작기를 사용IBER 미세.
- 10 V의 설정에 도달 할 때까지 조직 학적 확인을 위해, 상기 텅스텐 와이어에 3 V를인가하고, 1 단위 V의 전압을 증가시켜 매 10 초를 작은 병변을 생성한다.
- 표준 농도 곡선 이미 복수의 카본 파이버 전극을 이용하여 생성 된 경우, 직접 전위 탄소 섬유 전극을 적용하여 (3.1.14) 위 병변 단계를 수행한다.
주 :이 병변 방법은 탄소 섬유를 손상하고 특정 전극과 후속 캘리브레이션을 방지한다. - 치명적인 주입 펜토 바르 비탈 (150 ㎎ / ㎏, IP)을 사용하여 동물을 안락사.
- headcap에 직접 위로 당겨 플라이어를 사용하여 캐 뉼러와 headcap을 제거. 이 뇌에 불필요한 손상을 줄 수 있으며 그 도전 조직학 중에 전극의 위치를 식별 할 것이기 때문에 headcap 비틀 지 않는다.
- 30 % SU 다음 3 일간 4 % 포르말린에 뇌와 장소를 제거1 주간 crose. , 저온 유지 장치를 사용하여 30 μm의 조각 만들기 탄소 섬유 또는 텅스텐 병변의 위치를 식별하기 위해 광학 현미경 슬라이스를 커버 전표에 탑재하고 검사합니다.
참고 : 관류가 3.1.17에 대한 선택 사항입니다.
- 30 % SU 다음 3 일간 4 % 포르말린에 뇌와 장소를 제거1 주간 crose. , 저온 유지 장치를 사용하여 30 μm의 조각 만들기 탄소 섬유 또는 텅스텐 병변의 위치를 식별하기 위해 광학 현미경 슬라이스를 커버 전표에 탑재하고 검사합니다.
4) 전극 보정
- 전류 - 농도 변환 계수를 생성하는 플로우 셀을 사용.
- 전극의 감도를 결정하기 위해, 유동 "T- 세포"장치를 사용하여 각 실험 후에 전극을 교정. 트리스 완충액, pH가 솔루션 또는 솔루션은 DA (2 ml / 분의 속도로)의 전극 표면에 걸쳐 세정 중에 "t 셀"에 전극을 내린다. 버퍼의 pH 또는 DA 솔루션 사이에 앞뒤로 전환 할 여섯 위치 공기 솔레노이드 액추에이터를 사용합니다.
- 각 교정, 20 초,이어서 pH와 DA 용액 5 초 애플리케이션 이어 트리스 완충액 (기준선)의 5 초인가에 순환 전류 전압 곡선 데이터를 수집트리스 버퍼 (30 초 총 파일)의 pplication. 각 표준의 서로 다른 농도 사이의 상쇄, 각 교정 표준 농도에 대한 각각의 실행을 3 번 반복합니다.
- 각 샘플 수집, 피크 DA 또는 pH의 유발 전류를 측정한다. 피크 전류의 관계에 비해 농도를 얻기 위해 각각의 시험에 걸쳐 피크 전류를 평균. 더 자세한 설명은 [12]과 [13]를 참조하십시오.
5) 데이터 분석
- 주성분 분석에 설정된 트레이닝 사용 (PCA)
주 : 전압 전류 실험 기간 동안, 출력은 도파민 산화 및 환원, 산도 변화 및 전기 잡음의 결과 인 현재로서 생성된다. 하나의 바람직한 성분 (DA하여 pH)을 분리하고, 원하는 신호를 왜곡시킬 수있는 추가 성분 제거 할 수 있도록 PCA는 (보다 상세한 설명을 위해, 15, 16 참조)이 요인을 분리 할 수있다.- 토륨 교정 계수를 할당즉 출력 전류 PCA 후 (약 50-10 nA의 / μM)는 분석 물의 농도 값이 결정될 수 있도록한다.
- "기차"PCA 모델 (DA), 산도 및 기타 요인을 분리하는 실험 기간 동안 얻은 학습 집합을 사용합니다. PCA는 순환 전압 전류를 설정 교육 (섹션 3.1.8에서 수집)을 받아 볼타 모 그램의 본질적인 특성이 생체 내 전압 전류 녹음 동안 수집 된 각각의 분석을 식별하는 데 사용할 수있는 사용자를 결정합니다.
- 유지하는 주 성분들의 수를 결정하는, 말리노프스키 F 테스트를 사용한다. 일반적으로, 일반적으로 데이터를 분산의 약 95~99% 설명 만 2 ~ 3 주 구성 요소를 유지합니다. 말리노프스키 F 테스트를 구현하는 방법에 대한 자세한 설명은 17를 참조하십시오.
주 : 부품 개수가 결정되면, PCA 분석 효과적으로 DA로부터 측정 볼타 모 그램을 투영하며 pH가 훈련이 유지 된 주 성분에 설정한다.결과 (예상 출력 대표 결과 참조) 만 DA (또는 pH가) 데이터가 남아 있고 DA 유사 또는 산도 않는 잔차 데이터가 제거 될 수 있도록 필터링 된 데이터 세트이다. 순환 전류 전압 곡선 분석 (PCA)를 사용하는 단계 명령에 의해 더 자세한 설명과 단계 재료 시트와 16, 17을 참조하십시오.
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Representative Results
구강 내 카테터 삽입술과 결합 FSCV 방법 크로스, appetitive tastant을 검사하는 데 사용되었다 NAC 코어에 phasic DA 자료를 변조한다. tastant 주입, 전기 자극하기 전에.; VTA의 (150 μA, 60 Hz에서, 24 펄스 빨간색 막대로 표시)은 그림 1 NAC (그림 1)에서 phasic 다 릴리스의 강력한 증가를 생산 잠재력을 가진 컬러 플롯을 보여줍니다 Z 축의 Y 축, X 축에 시간 및 전류 (거짓 색으로 표시). 색상 플롯 아래 시간 추적 대 DA 농도이다. 시간에 대한 농도는 도파민의 산화 전위에서 전류 대 시간 추적을 사용하여 측정 하였다 전극의 교정 후 다음과 같은 농도로 전환시켰다 (점선 흰색 선으로 표시). 시간 추적이 DA 대 농도는 PCA에 설정된 훈련의 일부로서 사용되었다.
자당의 훈련 세트를 획득 한 후, 25 주입(10 %, 주입 당 200 μL)을 매 1-3 분으로 주어졌다. phasic DA 방출 크로스 변조의 예는도 2 및도 3에 도시되어있다.도 2에서, (빨간색 막대로 표시) 6.5 초간 주입이 산화 전위 (흰색 하향 화살표로 표시된) 전류의 상승 제조 DA의 (흰 점선으로 표시). PCA는 tastant에 대한 응답에서 증가 된 전류가 DA 농도 증가의 결과 인 것을 확인 후 시간 플롯 대 농도로 데이터를 변환하는 단계;를 포함한다. 시간의 예 중 하나를 tastant의 주입 후 증가 DA 농도를 공개, 내 구두 자당과 멘톨에 대한 추적 대 또 다른 tastant, 멘톨 (0.005 %, 주입 당 200 μL)도 NAC 코어에 FSCV 녹음 중에 주입 하였다. 그림 3 DA 농도를 보여줍니다 . 하나는 tastants에 phasic 다 릴리스의 시험 변화에 일부 시험 (그림 2, 3A)을 볼 것으로 예상한다. 그러나, 우리는 일반적으로 여러 실험을 통해 phasic DA 릴리스의 증가 또는 감소를 향해 비 특이 동향을 볼 수 없습니다. DA 10-100 nM의 범위는 단일 동물의 전형적인 실험에서 기대 될 수있다.
NAC의 핵심에 전기적으로 유발 DA 릴리스의 시간 그래프 (아래) 비교 그림 1. 대표 색상 플롯 (위)과 집중. 빨간색 막대 자극의 시간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
자당의 단일 주입하는 동안 시간 추적 (아래) 비교 그림 2. 대표 색상 플롯 (위)와 DA 농도. 레드 BAr은 6.5 초 주입을 나타냅니다. 화이트 아래 방향 화살표가 DA의 산화 전위 (거짓 색으로 표시) 현재에 권한 상승에 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(A) 10 % 자당 및 (B) 구강 관리 0.005 %의 멘톨 동안 시간 추적 대 그림 3. 대표 DA 농도. 빨간색 막대가 6.5 초 구강 내 주입을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
FSCV과 함께 구강 tastant 배달 구강 향미를 "실시간"다 응답의 분석을 허용한다. 성공적인 DA 측정에 필요한 프로토콜의 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 구강 카테터의 적절한 주입은 향미의 전달을 위해 중요하다. 카테터는 제 1 대구치 뒤에 삽입하고 제자리에 쐐기되는 것을 보장하는 것은 개통을 잃지 카테터를 방지하고 동물에 의해 실수로 삭제되는 것을 방지 할 수 있습니다. 복구 후 처음 며칠 동안 카테터를 플러싱하는 제 2 또는 3 일 동안 동물에게 주어진 소프트 음식 수술 후는 카테터를 방해 할 수 있기 때문에, 또한 중요하다. 둘째, 전극의 품질이 자유롭게 움직이는 랫트에서 신호 대 잡음비를 증가시키기 위해 중요하다. 어떤 경우에는, 시각적으로 표시 전극은 높은 품질과 여전히 잡음 신호를 제공 할 수 있습니다 좋은 조건이 될 수 있습니다. 이 문제를 해결하는 한 가지 방법은 D에서 기준 기록을하는 것입니다orsal의 선조체 (DURA 아래 4mm). 전극 너무 많은 소음이 발생하는 경우, 전극을 제거하고, 종래 NAC 코어 기록 사이트 (경막 아래 6-7mm)를 실험을 수행하는 새로운 전극으로 대체 될 수있다. 세 번째 중요한 단계는 자연 DA 출시 이벤트 ( "과도") DA 농도 (최소 20 nM의 충분한 증가와 충분한 주파수 (분 당 적어도 1)에서 관찰 대상 뇌 영역에 적합한 기록 위치를 찾는 것입니다 40 nM의에). 이 최적화는 자연 phasic 다 놓기 이벤트 전에 풍미 관리에 특정 위치에서 검출 할 수 있도록합니다. 노출 된 탄소 섬유 (50 ~ 100 μm의)의 크기에 상당하는 단위로 전극을 낮추면 검출 과도 기록 위치를 찾는 가능성을 최대화한다.
FSCV가 DIF이므로 FSCV의 한가지 중요한주의해야 할 점은, 특정 시점에서 절대 분석 물 농도를 측정 할 수 없다는 것이다각 전압 전류 녹음 파일 중 (안정 기준에 비해) 상대적으로 농도 변화를 측정 ferential 기술. 그러나, 차동 기술은 또한 보람과 혐오 tastants 5 모두에 응답하여 도파민 농도의 하위 두 번째 변동의 정량이 가능합니다. 니코틴 중독, 멘톨 및 구강 감미료 등 담배 제품 첨가제의 맥락에서 흡연 행위 (18)에 영향을 미치는 것으로 나타났다 최근 예방 및 담배 규제법 흡연 가족 (멘톨 제외) 담배에서 금지되어있다. 따라서 FSCV와 함께 구강 전달은 잠재적 니코틴 보강 특성을 담배 제품의 향미가 DA 시그널링을 변경할 수있는 방법을 검토하기 위해 사용 될 수있는 중요한 방법 적 도구를 제공한다.
여기서는 phasic DA를 측정 할 목적으로 구강 FSCV tastant 주입을 조합 한 방법을 설명했다차 tastant 자극에 반응하여 놓습니다. 그것은 우리의 기술은 행동이나 선택의 독립적 인 tastants에 phasic DA 릴리스의 시험을 수 있지만, 그것은 tastant 전달의 예상치 못한 자연 phasic DA 릴리스 (19)에 영향을 미칠 수도 가능하다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 따라서, 물 또는 인공 타액과 같은 적절한 제어 솔루션은 관심의 tastant phasic DA 분리 독립에 예기치 보상 혹은 자극의 효과를 비교 검토 대조 실험에 사용될 수있다. 그러나,이 기술은 릴리스 DA 또는 보상 중 측정에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이전의 작품은 보상과 혐오감 20 두 중 노르 에피네프린의 방출을 검토하고있다. 동물이 쉽게하지 FSCV와 혐오 tastants에게 구강 tastant 주입을 소비하기 때문에 혐오 tastants에 phasic 다 방출을 측정 할 수있는 유일한 기술이다. 그러나,이 기술은 혐오 tastant 또는인지의 여부를 결정하지 않는다ppetitive가 아니라, 단순히 tastant의 소비 동안 다 방출을 측정한다. (다른 곳에서 5, 21의 설명 참조) tastant 쾌락의 값을 결정하기 위해, 행동 검사는 맛 반응성 동안 오로 - 안면 반응을 관찰하기 위해 통합 될 수있다.
또한 FSCV 또한 세로토닌 (22) 및 산소 (23) 등의 다른 중요한 신경 화학 물질을 측정하기에 적합하지만, 어 웨이크, 자유롭게 움직이는 동물에서 이러한 분석을 기록하기위한 방법은 아직 제공되지 않는다는 점에주의해야한다. 또한, 결합 된 전압 전류 및 구강 내 주입 방법, tastant 배달 시간 동기 도파민 반응은 또한 DA 방출에 영향을 줄 수있는 이러한 접근 동작 또는 식품 검색과 같은 다른 행동의 부재하에 분석 할 수있다. 추가 응용 프로그램으로, 결합 구강 tastant 전달 및 FSCV은 조작 적 또는 파블로프 conditioni 동안 보람 또는 혐오 이벤트 다 신호를 측정하기에 적합 할 수있다NG. 실제로, 레비와 동료의 최근 조브 간행물 내 구두 tastants가 수집 및 조작 적 자기 관리 행동 (24)의 유지 보수를 지원 여부를 결정하기 위해 조작 적 행동 - 내 구두 tastant 전달을 결합한다. 따라서, 이러한 방법은 또한 동작시에 경구 tastants phasic DA 응답을 식별 FSCV와 결합 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| Cannula for electrode | BioAnalytical Systems | MD-2251 | |
| Glass capillary | A-M systems | 624503 | |
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
DS4 | |
| Heat shrink | 3M | FP-301 | |
| Insulated wires for electrodes | Squires electronics | Custom | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| Micromanipulator | Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop | ||
| Epoxy | ITW Devcon | 14250 | "5 minute epoxy" |
| Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene | Ion Power | LQ-1105 | i.e., Nafion |
| Silver paint | GC Electronics | 22-023 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Tubing for intra-oral catheters | Intramedic | 427426 | PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm |
| Tubing for intra-oral infusion | Fischer Scientific | 02-587-1A | I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| Syringe pump for flow cell | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| Surgical cement | Dentsply Caulk | 675571 and 675572 | |
| Air actuator | VICI | A60 | 6 position digital valve interface |
| Digital valve interface | VICI | DVI | 230 VAC |
| Quad headstage | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Power supply for tastant syringe pump | Med Associates | SG-504 | |
| Tastant syringe pump | Med Associates | PHM-107 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium chlroide | Sigma | S7653 | |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | |
| Hydrochloric acid (4 M) | Sigma | 54435 | |
| Soidum hydroxide | Sigma | 306576 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | H8502 | |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | Must request software: click here for link to software request page |
References
- Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
- Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
- Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
- Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
- Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
- Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
- Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
- Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
- Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
- Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
- Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
- Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
- Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
- Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
- Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
- Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
- Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
- Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
- Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).
