Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

בחינת המהירה דופמין Dynamics עם הסריקה מהירה Voltammetry המחזורי במהלך פנים הפה Tastant מנהל בחולדות ערה

Published: August 12, 2015 doi: 10.3791/52468
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,3,4
1Interdepartmental Neuroscience Program, Yale University, 2Department of Biotechnical and Clinical Laboratory Sciences, School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, 3Department of Psychiatry, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine

Protocol

כל הניסויים שנערכו על פי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת אוניברסיטת ייל מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC).

הכנות 1) טרום-ניתוחיות

  1. הכנת פתרון אוראלית
    1. ליצור פתרונות של סוכרוז 10% ו0.005% L-מנטול במים ללא יונים (pH 7.4). אחסן את הפתרונים הללו במיכלים סגורים, ב RT, ולעצב מחדש כל 2 שבועות, כדי למנוע השפלה.
  2. פתרונות כיול אלקטרודה
    1. הפוך חיץ טריס (pH 7.4) בכל עת לפני הכיול. הפתרון מורכב מ12.0 מ"מ טריס HCl, 140 מ"מ NaCl, 3.25 מ"מ KCl, 1.20 מ"מ CaCl2, 1.25 מ"מ NaH2PO4, 1.20 מ"מ MgCl 2, ו2.00 מ"מ Na 2 SO 4.
    2. צור פתרון מניות של דופמין 10 מ"מ (DA; hydrochloride דופאמין) ב0.1 חומצת perchloric M. חומצת perchloric מסייעת במניעת חמצון של dopaminדואר. אחסן פתרון מניות זה ב -20 ° C ולהשתמש עד 6 חודשים. הפוך כמה aliquots של פתרון מניות DA לאחסון לשימוש כל aliquot רק פעם אחת.
    3. ממניות 10 מ"מ DA, לדלל פתרונות במאגר טריס לריכוזים של 1 מיקרומטר, 500 ננומטר, 250 ננומטר, 125 ננומטר, 62.5 ננומטר, ו31.25 ננומטר.
    4. לכיול pH, להכין פתרונות של טריס חיץ עם pH של 7.2, 7.3, 7.5, 7.6 ו. זה יספק פתרונות המחקים משמרות pH שעלול להתרחש במהלך ניסוי in vivo.
  3. ייצור אלקטרודה
    1. על ידי שאיבת אבק, לשאוב סיבי פחמן T-650 (7 מיקרומטר קוטר) לנימי זכוכית בורוסיליקט (אורך 10 מ"מ, קוטר 0.6 מ"מ חיצוני, קוטר פנימי 0.4 מ"מ).
    2. הנח נימי זכוכית מלאות בסיבי פחמן לחולץ אלקטרודה אנכי. לפרמטרים ראשוניים, הגדר את התנור ל55.0 ולכבות את המגנט. עם זאת, אופטימיזציה נוספת שתהיה דרושה כשני דוד והגדרות מגנטיות להשתנות frמעבדה אום למעבדה.
      הערה: אלקטרודה צריכה להיות לפחות 5.5 סנטימטר (כולל להתחדד), כך שהוא יכול להתאים בקלות לmicromanipulator ולהיות מוכנס לפחות 6.9 מ"מ מתחת דורה במוח החולדה. אם האלקטרודה הוא קצר מדי, הקלטות מחלק הגחוני של הגרעין נסמך לא תהיינה ברות השגה. מצד השני, הכולל את אורך אלקטרודה לא יעלה על 6.5 סנטימטר אחר זה יהיה יותר מדי זמן כדי להתאים את micromanipulator.
    3. באמצעות מיקרוסקופ אור, לחתוך החשוף סיבי פחמן, כך שהוא מרחיב 75-100 מיקרומטר מעבר לקצה של הזכוכית. ודא שיש לו את האלקטרודה חזק מאוד, בקושי אפשר להבחין, חותם בין אלקטרודת הזכוכית והסיבית פחמן, אשר תפיק רעש מינימאלי במהלך הקלטה שלאחר מכן. מחק את האלקטרודה אם יש סדקים בולטים בזכוכית או אם החותם הוא רופף, אשר מעיד על חותם עני. לקבלת הוראות מפורטות יותר ראו [12] ו [13].
  4. הרכבת אלקטרודה לתוך המיקרופוןromanipulator
    1. להשיג 3 ב, חוט 30G כי הוא מבודד לאורך מחצית אורכו של החוט ולהשתמש במברשת קטנה ללמרוח שכבה דקה של כסף לצבוע ישירות לחוט. מייד לאחר החלת צבע כסף, להכניס את החוט לתוך החור בחלק העליון של האלקטרודה לספק חיבור פיזי וחשמלי לסיב פחמן. תחת מיקרוסקופ, להבטיח כי חוט הכסף יוצר קשר עם סיבי פחמן.
    2. אבטח את חוט הכסף ואלקטרודה לmicromanipulator באמצעות חום להתכווץ.
    3. מניחים את האלקטרודה סיבי פחמן מוכן לאלכוהול איזופרופיל מטוהר (IPA) במשך לפחות 10 דקות כדי לנקות את שטח האלקטרודה וכדי להגביר את הרגישות לאחר דופמין. לאחר השרייה בIPA, לשטוף את סיבי פחמן במים ברז כדי להסיר את IPA.
  5. ייצור אלקטרודה התייחסות
    1. קח חוט 13 מ"מ כסף המכיל כ 6 מ"מ רשת Ag / Ag Cl (חוט כסף 7 מ"מ בלבד, 6 רשת מ"מ, קוטר 0.4 מ"מ),לחתוך את חלק הכסף עד כלמחצית אורכו המקורי ולרתך את החלק מכסף של החוט לסיכת זהב.
    2. החל אפוקסי על ההלחמה על הפין.
    3. טובלים את Ag / Ag Cl רשת הסוף לקופולימר של polytetrafluroethylene 5% וperfluoro-3,6-dioxa-4-מתיל-7octene-sulfonic חומצה 5 פעמים, לתקופות ייבוש אוויר 30 דקות בין כל טבילה.
    4. לאפשר Ag / Ag Cl המצופה רשת לO אוויר היבש / N.
    5. לרפא בתנור על 120 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.

2) ניתוח המשולב intraoral וניתוח תוך גולגולת Cannulation (כ -75 דקות)

  1. ייצור קטטר שבעל פה
    1. הפוך את הצנתר דרך הפה, ולעקר על ידי עיקור אתילן אוקסיד, לפחות 10 ימים לפני הניתוח.
    2. חותך צינורות PE 100 ל6 סנטימטר מגזרים ארוכים.
    3. באמצעות מלחם, להמס קצה אחד של צינור PE וקש מייד על משטח מוצק כדי לקרר את צינורות PE. התוצאה צריכה ליצורדיסק קטן, שטוח בקצה אחד של צינור PE ולא צריך להיות טבלת מנגנון. שימוש במחט (18 G) או לדחוף סיכה כדי ליצור חור במרכז של הדיסק הזה.
    4. בצד השני של צינור PE, בנוחות להכניס את הקצה הקהה של מחט G 18 לתוך הצינור.
    5. באמצעות אגרופן חור נייר סטנדרטי, אגרוף כמה חתיכות עגולות של גיליון polytetrafluroethylene (3.18 מ"מ עובי, 6 מ"מ קוטר) כדי ליצור מנקי polytetrafluroethylene.
    6. ליצור חור במרכז של מכונת הכביסה. קח את המחט מחוברת לצינורות PE ולדחוף אותו לחלוטין באמצעות מכונת הכביסה. ברגע שהמחט היא דרך, להחליק את מכונת הכביסה לתחתית צינורות PE, כך שהוא סומק נגד מכונת הכביסה.
  2. אוראלי ניתוח
    1. לאחר חיטוי כלים כירורגיים, הצינורית (גזוזות עד 2.5 מ"מ מתחת הכן לפני העיקור), והאלקטרודה התייחסות, להרדים את העכברוש עם זריקת intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם).
      1. אפter 5 דקות, להחיל מבחן גירוי מזיק (רגל או קמצוץ זנב) כדי להעריך את הרמה של הרדמה. אם הנושא מראה כל תגובה פיזית למבחן הגירוי המזיק (נרתע תגובה, עלייה בקצב נשימה או לב), לנהל דחיפה קטמין של 10% עד 15% מהמינון המקורי ולחזור על פרוטוקול הגירוי המזיק לעיל.
    2. לאחר העכברוש הוא בהרדמה מלאה ולא מראה תגובה למבחן הגירוי המזיק, להשתמש קוצץ שיער בעלי חיים לגלח הפרווה של החולדה מהעיניים כ 2 מ"מ מאחורי האוזניים. לאחר מכן מניח את החולדה על כרית חימום הסירקולציה המחודשת מים דקה כדי לשמור על טמפרטורת גוף במהלך ניתוח. החל סיכה עין. לנהל את התרופה אנטי דלקתי שאינם סטרואידים (NSAID), carprofen (5 מ"ג / קילוגרם), על ידי הזרקת intraperitoneal לפני ביצוע כל חתכים ולפני החדרת קנולות intraoral. השתמש בטכניקת ספטית בכל העת.
    3. החל בטאדין ואחריו אתנול 70% כדי לנקות את העור. חזור 3 פעמים.
    4. Plaהספירה החולדה על הגב שלה, ולפתוח את הפה באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי. מצא טוחנת העליון הראשונה.
    5. הכנס את המחט לתוך הרקמה בין הלחי וטוחן העליונים הראשונה עד המחט יוצאת ממש מאחורי והמדיאלי לאוזניים.
    6. פירס המחט דרך העור עד צינורות PE יוצא העור ונגיש.
    7. משוך על הצינורית (מרתקת על ידי הצינורית עצמו ולא את המחט) ולאבטח את מכונת הכביסה polytetrafluroethylene לטוחנות כך שהצנתר נשאר במקום.
      הערה: חיתוך מכונת הכביסה לצורת טרפז ומאבטח אותו נגד הטוחנות עם הצד השטוח מול הלחי עושה צעד זה קל יותר.
    8. קח מכונת כביסה polytetrafluroethylene אחרת והחלק אותו על המחט החשופה, את צינורות הפלסטיק, וניגש נגד החתך.
    9. כדי לאבטח את מכונת הכביסה polytetrafluroethylene, להשתמש בקלטת מעוקרת ליצור "דגל" משולש כך שמכונת הכביסה לא להחליק למעלה. Secure לשטוףאה נגד העור של החולדה והקלטת מעוקרת.
    10. חותך את הקטטר החשוף כדי לאפשר 2-4 סנטימטר של צינורות להיחשף מעל הראש של החולדה.
    11. חזור על השלבים 2.2.1 באמצעות 2.2.10 לצד של הפה האחר.
  3. ניתוח תוך-גולגולתי לvoltammetry
    1. מניחים את החולדה במסגרת stereotaxic ולנקות את הקרקפת של החיה באמצעות שני לשפשף שלב (לשפשף בבטאדין ואחריו לשפשף אתנול 70%, לבצע עם חזרת 3 מחזור).
    2. השתמש פינצטה מעוקרת מחט האף ומספריים כירורגיות כדי לחתוך קטע 15 x 15 מ"מ של רקמת קרקפת.
    3. נקה בעדינויות את פני השטח של הגולגולת באמצעות החלת קצה כותנה מעוקרת. נוסף לנקות את הגולגולת על ידי יישום 2-3 טיפות של מי חמצן 3%.
    4. השתמש תרגיל stereotaxic לעשות 3 חורים קטנים (בקוטר 1 מ"מ) בגולגולת להכנסה הבאה של ברגים, חור 1 לצינורית המדריך, חור 1 להאלקטרודה מגרה, וחור 1 לנבחר ההתייחסותרכב.
    5. להקלטות בליבת NAC, מקמו את צינורית המדריך ב1.2 מ"מ קדמי ו -1.4 מ"מ לרוחב גבחת. מנמיכים את מנגנון הצינורית עד בסיס הפלסטיק הוא מיושר עם הגולגולת.
    6. מניחים את האלקטרודה ההתייחסות מעוקרת בחצי הכדור הנגדי לצינורית המדריך. מנמיכים את ההתייחסות כ 2 מ"מ מתחת הדורה.
    7. מקם את האלקטרודה מגרה על 5.2 מ"מ אחורי ו1.0 מ"מ לרוחב גבחת והוריד 8.0 מ"מ מתחת דורה למקד אזור הגחון tegmental (VTA).
    8. השתמש במברג כירורגית קטן מעוקר כדי לאבטח ברגים לגולגולת. לאחר מכן, הכנס את האלקטרודה ההתייחסות, גירוי אלקטרודה, ולהנחות את הצינורית. לבסוף, לאבטח את כל הרכיבים באמצעות מלט cranioplastic.
    9. במשך 48 השעות הראשונות של טיפול שלאחר ניתוח, לנהל את התרופה אנטי דלקתית (NSAID) carprofen שאינו סטרואידים בהזרקה תת עורית (5 מ"ג / קילוגרם). לאפשר לפחות השבוע 1 להתאוששות כירורגית מלאה לפני ביצוע voltamהקלטת "חג.
      1. במהלך טיפול שלאחר ניתוח, צנתרים אוראליים סומק יומי עם מים. לספק מזון רווי במים במשך 2 ימים כדי לסייע לבעלי החיים בלעיסה ואכילה. לספק ניטור יומי לסימנים אפשריים של לחץ של כאב (עקב זיהום או התייבשות קל) ולספק התערבויות מתאימות במידת צורך (כולל ניהול של נוזלים, ממשל מקומי של חיטוי, וממשל או NSAID carprofen בשעה 5 מ"ג / קילוגרם).

3) הקלטות Voltammetric בערים, עכברוש באופן חופשי על העברה

  1. הורדת האלקטרודה ורכישת סט אימון DA.
    1. ביום של הניסוי, לבדוק את הפתיחות של הצינורית דרך הפה על ידי יציקת 200 μl מים והתבוננות תגובות orofacial (כדי לוודא שהעכברוש הוא טועם את המים).
    2. צרף את headstage FSCV לחולדה על ידי החדרת אלקטרודה המגרה (על headstage) לcannu האלקטרודה מגרה דו קוטבילה (בחולדה). לפיכך, headstage (מיניאטורי ממיר נוכחי למתח) מתחברת ישירות לאלקטרודה דו קוטבי גירוי.
    3. הסר את צינורית הדמה ממנגנון הצינורית ולהחיל שתי טיפות של 50% פתרון הפרין לצינורית. ואז בעדינות להכניס צינורית דמה (מעט יותר שצינורית הדמה שהוסרה בעבר) כדי לנקות כל קרישי דם או צלקות גליה אשר ייתכן שאירעו, שישברו אלקטרודות סיבי פחמן שיהיה בהמשך להיות מוכנס במהלך הניסוי. להאריך את הצינורית המשמשת לניקוי קרישים 3-4 מ"מ מתחת לגולגולת (לפחות 2 מ"מ מעל אתר ההקלטה).
    4. הכנס את micromanipulator, עם אלקטרודה, לצינורית המדריך ולמקם את טבעת האומגה במצב "נעול".
    5. חבר את חוט האלקטרודה ההתייחסות מheadstage לסיכה המתאימה. אז לחבר את חוט האלקטרודה העבודה מmicromanipulator לחוט המתאים בheadstage.
    6. מנמיכים את ELECtrode כ 4-4.5 מ"מ מתחת גולגולת.
    7. השתמש potentiostat ליישם צורת גל משולשת (400 V / s, ל-0.4 1.3 V). החל הגל לאלקטרודה בתדר 60 הרץ לפחות 10 דקות, ולאחר מכן לשנות את תדר יישום צורת גל עד 10 הרץ להקלטות ניסיוניות שלאחר מכן.
      הערה: צעד יישום גל 60 הרץ מייצר משטח סיבי פחמן יציב ויסייע למנוע סחיפה חשמלית
    8. החל גירוי חשמלי לVTA באמצעות תדרים שונים (10 עד 60 הרץ) קטניות (10 עד 30 פעימות) וזרמים (50 עד 150 מיקרו-אמפר) כל עם רוחב פולס של 2 MS / שלב, לעורר ריכוזים שונים של שחרור DA ו- pH משמרות. לרכוש לפחות 5 ריכוזים שונים של שחרור DA ו -5 משמרות pH שונות. חכה (2 - מינימום 3 דקות) בין גירויים כדי לאפשר העמסת לפוחי [14].
      הערה: חשוב לקבל גירויים המייצרים ריכוזי DA על פני כל הטווח שייאסף במהלך שלאחר מכןניסוי שכן הם ישמשו כמערכת הכשרה לקרן רכיב ניתוח (ראה סעיף 5.1).
    9. מנמיכים את האלקטרודה לתוך ליבת NAC (הגחון 6.3 מ"מ לדורה). לאחר מכן מנמיך את האלקטרודה בבתוך ליבת NAC 100 מיקרומטר מרווחים עד אירועי שחרור DA חולפים הם נצפו בתדרים של לפחות 1 לדקה.
    10. חבר את צינורות (הקוטר פנימי 1/32 ", קוטר חיצוני 3/32") למזרק 20 מיליליטר, מחובר למשאבת מזרק. בצד השני של הצינור, להשתמש במחט 23 G משופע להתחבר צינורות לצינורית של החולדה. ודא שהצינור מלא לחלוטין עם tastant הרצוי ולוודא שאין בועות קיימות בצינור.
      הערה: בדרך כלל, לנהל כמות קטנה של tastant לתוך הפה של העכברוש לפני ההקלטה על מנת להבטיח כי העירוי הראשון להקלטה מספק את מלוא סכום עירוי ולא כל מים או אוויר שיורית בצינור. יתר על כן, זה מאפשר לבעלי החיים כדי לקבל קצת שנינות ניסיון קודמתh tastant מאז tastants רומן, גם תיאבון אלה, יכול להיות מרתיע בתחילה בשל החידוש שלה.
    11. לאיסוף נתונים, להחדיר 200 μl של tastant (6.5 שניות באמצעות משאבה וצינורות שתוארו לעיל). להשרות tastant כל דקות 1-3. להשרות כולל של 25 פעמים בtastant. כל עירוי מספק 200 μl של פתרון.
    12. אם tastants מרובים מועבר בניסוי אחד, לשטוף את הפה עם מים קטטר לאחר איסוף נתונים לtastant אחד ולחכות לפחות 20 דקות לפני יציקת tastant החדש.
    13. לאחר הקלטת DA, להתכונן לאימות היסטולוגית על ידי יצירת נגע קטן באתר ההקלטה. כדי לשמר את האלקטרודה סיבי פחמן לכיול הבא, לחזור בי ראשון האלקטרודה ולהסיר את micromanipulator. לאחר מכן השתמשתי micromanipulator חדש עם microelectrode זכוכית ותיל טונגסטן (הארכת 100 מיקרומטר מעבר לקצה של הכוס) לאותו עומק (להלן דורה) כF פחמן המקוריmicroelectrode iber.
    14. לאימות היסטולוגית, ליצור נגע קטן על ידי יישום 3 V בחוט טונגסטן והגדלת המתח במרווחים 1 V, כל 10 שניות, עד שתגיע ל- 10 V ההגדרה.
    15. אם עקומת ריכוז סטנדרטית כבר נוצרה באמצעות אלקטרודות פחמן סיבים מרובות, לבצע את צעד הנגע לעיל (3.1.14) על ידי יישום הפוטנציאל ישירות האלקטרודה סיבי פחמן.
      הערה: שיטת נגע זה יגרום ניזק לסיבי פחמן ולמנוע הכיול הבא עם שאלקטרודה הספציפית.
    16. להרדים את החיה באמצעות pentobarbital קטלנית הזרקה (150 מ"ג / קילוגרם, IP).
    17. לעקור את headcap עם cannulae באמצעות צבת ידי משיכת ישירות כלפי מעלה על headcap. אל תסובב headcap מאז זה יגרום נזק מיותר למוח ולגרום לזה מאתגר כדי לזהות את המיקום של האלקטרודה בהיסטולוגיה.
      1. הסר את המוח ואת המקום בפורמלין 4% במשך 3 ימים ואחריו 30% sucrose לשבוע 1. צור 30 מיקרומטר פרוסות באמצעות cryostat, לעלות על מכסה מחליק ולבחון פרוסות תחת מיקרוסקופ אור כדי לזהות את המיקום של סיבי פחמן או נגע טונגסטן.
        הערה: זלוף הוא אופציונאלי עבור 3.1.17.

4) אלקטרודה כיול

  1. שימוש בתא הזרימה כדי ליצור גורם המרה נוכחי-ריכוז.
    1. על מנת לקבוע את רגישות אלקטרודה, לכייל אלקטרודות לאחר כל ניסוי באמצעות מנגנון "T-cell" זרימה. מנמיכים את האלקטרודה לתוך "T-cell" בעוד חיץ טריס, פתרונות pH, או פתרונות DA נשטפים על פני האלקטרודה (בשיעור של 2 מיליליטר / דקה). השתמש מפעיל סולנואיד האוויר שש-עמדה כדי לעבור קדימה ואחורה בין החיץ וpH או פתרון DA.
    2. לכל כיול, לאסוף נתונים voltammetric במהלך 5 שניות יישום של חיץ טריס (בסיס) ואחרי 5 שניות של יישום ה- pH או פתרון DA, ואחרי 20 שניותpplication של חיץ טריס (קובץ כולל של 30 שניות). חזור על כל ריצה 3 פעמים עבור כל ריכוז סטנדרטי כיול, כמשקל נגד בין ריכוזים השונים של כל תקן.
    3. לכל אוסף מדגם, למדוד את השיא DA או נוכחי עורר pH. ממוצע נוכחי השיא פני כל ניסוי כדי להשיג ריכוז לעומת מערכת יחסים הנוכחיות לשיא. לקבלת הוראות מפורטות יותר ראו [12] ו [13].

5) ניתוח נתונים

  1. באמצעות אימון שנקבע בניתוח מרכיבים עיקרי (PCA)
    הערה: במהלך ניסוי voltammetry, פלט מופק כנוכחי, שהוא התוצאה של חמצון דופאמין והפחתה, משמרות pH, ורעש אלקטרוכימיים. PCA מאפשרת הפרדה של גורמים אלה, כך שניתן לבודד את המרכיבים הרצויים (DA ו- pH) ולהסיר רכיבים נוספים שעשויים לעוות את האותות הרצויים (לתיאור מפורט יותר, ראה 15, 16).
    1. הקצאת גורם כיול התפוקה נוכחית דואר (כ 5-10 Na / מיקרומטר) לאחר PCA כדי לאפשר ערכי ריכוז של analytes שייקבעו.
    2. השתמש בערכת ההדרכה שהושגה במהלך ניסוי ל" רכבת "מודל PCA להפריד את התובע, pH, וגורמים אחרים. PCA לוקחת אימון להגדיר voltammograms המחזורית (שנאסף בסעיף 3.1.8) וקובעת שמאפיינים מהותיים של voltammogram יכולים לשמש כדי לזהות כל אנליטי שנאסף במהלך הקלטות voltammetry in vivo.
    3. כדי לקבוע את מספר המרכיבים העיקריים כדי לשמור, להשתמש מלינובסקי F-מבחן. בדרך כלל, לשמור רק 2 או 3 מרכיבים עיקריים אשר בדרך כלל להסביר על 95-99% מהשונות בנתונים. לדיון נוסף ביישום מלינובסקי F-הבדיקה, לראות 17.
      הערה: לאחר מספר הרכיבים נקבעים, ניתוח PCA יעילות יהיה פרויקט voltammograms נמדדה מהתובע והכשרת pH קובעת על המרכיבים העיקריים שנשמרו.התוצאה היא סדרת הנתונים שסונן כך שהנתונים רק DA (או pH) נשאר ונתונים השייר שאינו דומה DA או pH מוסר (ראה תוצאות נציג לתוצר צפוי). להסבר מפורט יותר וצעד צעד לפי הוראות לשימוש בPCA עבור ניתוח voltammetric לראות גיליון חומרים ו -16, 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FSCV בשילוב עם השתלת צנתר intraoral שימש לבחון כיצד סוכרוז, tastant תיאבון, מודולציה שחרור DA phasic בליבת NAC. לפני עירוי tastant, גירוי חשמלי (150 מיקרו-אמפר, 60 הרץ, 24 פעימות; שצוין על ידי בר האדום) של VTA מייצר עליות חזקות בשחרור DA phasic בNAC (איור 1) איור 1 מציג עלילת צבע עם פוטנציאל ב. ציר y, זמן על ציר x, ונוכחי (מיוצג כצבע שווא) על ציר z. מתחת לעלילת הצבע הוא ריכוז DA לעומת עקבות זמן. ריכוז לעומת הזמן נקבע באמצעות העקבות הנוכחיות לעומת זמן בפוטנציאל החמצון של דופמין (מסומן בקו מקווקו לבן) שהוסב לריכוז, הבא לאחר כיול של האלקטרודה. ריכוז DA זה לעומת עקבות זמן שימש כחלק מההכשרה שנקבעה לPCA.

לאחר סדרת האימונים נרכשה, 25 חליטות של סוכרוז(10%, 200 μl לעירוי) ניתנו כל דקות 1-3. דוגמאות לאפנון סוכרוז של שחרור DA phasic מוצגים באיורים 2 ו -3. באיור 2, עירוי 6.5 שניות (מסומן בפס האדום) המיוצר על העלאה בנוכחית (מסומן בחץ הלבן, כלפי מטה מול) בפוטנציאל החמצון של התובע (מסומן בקו המקווקו הלבן). הפיכת הנתונים לריכוז לעומת עלילת פעם אחר PCA וידאה ששוטף עלו בתגובות לtastant היא התוצאה של עלייה בריכוז DA. נוסף tastant, מנתול (0.005%, 200 μl לעירוי) היה גם חדור בהקלטות FSCV בליבת NAC. איור 3 מראה ריכוז DA לעומת דוגמא הזמן עוקבת לתוך אוראלי-סוכרוז ומנטול, חושפת ריכוז DA עלה לאחר העירוי של שני tastant . אחד צריך לצפות לראות קצת ניסוי לשונות משפט בשחרור DA phasic לtastants (איור 2 ו3A). עם זאת, אנחנו לא רואים בדרך כלל כל מגמות שאינן ספציפיות לגידול או קיטון בשחרור DA phasic על ניסויים מרובים. ניתן לצפות טווחים 10-100 ננומטר DA בניסוי טיפוסי בחיה אחת.

איור 1
1. עלילת איור נציג צבע (למעלה) וריכוז לעומת עלילת זמן (תחתון) של שחרור DA עורר חשמלי בליבת NAC. בר אדום מציין זמן גירוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
2. עלילת איור נציג צבע (למעלה) וריכוז DA לעומת עקבות זמן (למטה) במהלך עירוי יחיד של סוכרוז. ב אדוםar מציין 6.5 שניות עירוי. חץ פונה כלפי מטה לבן מציין בגובה בנוכחי (מיוצג בצבע שקר) בפוטנציאל החמצון של התובע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. ריכוז הנציג DA לעומת עקבות זמן ב() סוכרוז 10% ומנטול 0.005% על ידי ממשל intraoral (B). בר אדום מציין 6.5 עירוי תוך-פומי שניות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

משלוח tastant intraoral בשילוב עם FSCV מאפשר ניתוח של תגובות DA "בזמן אמת" לflavorants האוראלי. ישנם שלושה שלבים קריטיים בפרוטוקול הנדרשים למדידות DA מוצלחות. ראשית, השתלה תקינה של הצנתר דרך הפה היא קריטית לאספקת flavorants. על מנת להבטיח כי קטטר מוכנס מאחורי טוחנת הראשונה ותקוע במקום מונע את הקטטר מלאבד פתיחות ומונע הסרת בשוגג על ידי בעלי החיים. שטיפת הצנתר בימים הראשונים שלאחר ההתאוששות היא גם חשובה, שכן המזון הרך הניתן לבעלי החיים במהלך 2 או 3 הימים הראשונים שלאחר ניתוח יכול לסתום את הקטטר. שנית, האיכות של האלקטרודה היא קריטית להגדלת יחס אות לרעש בחולדה לנוע בחופשיות. במקרים מסוימים, אלקטרודות המופיעות חזותי להיות באיכות גבוהה ומצב טוב, עדיין עשוי לתת אותות רועשים. דרך אחת לפתור בעיה זו היא לקחת הקלטות בסיסיות בדסטריאטום orsal (4 מ"מ מתחת דורה). אם את האלקטרודה מייצרת יותר מדי רעש, האלקטרודה ניתן להסיר ולהחליף עם אלקטרודה חדשה קודם לביצוע הניסוי באתר הקלטת ליבת NAC (6-7 מ"מ מתחת דורה). שלב קריטי שלישי הוא מציאת מיקום הקלטה מתאימה באזור המוח הממוקד, שבו אירועי שחרור ספונטניים DA ("ארעיים") הם נצפו בתדירות מספקת (לפחות 1 לדקה) עם עליות מספיק בריכוז DA (לפחות 20 ננומטר 40 ננומטר). אופטימיזציה זו תבטיח כי ניתן לאתר אירועי שחרור DA phasic ספונטניים במיקום ספציפי, לפני ממשל flavorant. הורדת האלקטרודה במרווחים שווה ערך לגודל של סיבי פחמן נחשפו (50-100 מיקרומטר) מגדילה את הסיכוי למציאת אתר הקלטה עם ארעיים לזיהוי.

אזהרה חשובה אחד FSCV היא חוסר היכולת לקבוע את ריכוז אנליטי מוחלט בנקודה בזמן, מאז FSCV הוא DIFטכניקת ferential המודדת שינויי ריכוז יחסי (בהשוואה לתחילת מחקר יציבה) במהלך כל קובץ הקלטת voltammetry. עם זאת, טכניקת ההפרש גם מאפשרת כימות של תנודות תת-שנייה בריכוז הדופאמין בתגובה לשני tastants המתגמל והמרתיעה 5. בהקשר של התמכרות לניקוטין, תוספי מוצר טבק, כגון ממתיקים מנטול ובעל פה, הוכח להשפיע התנהגות עישון 18 ולאחרונה כבר נאסר בסיגריות (למעט מנטול) על ידי משפחת עישון מניעה ופיקוח על טבק חוק. לפיכך, משלוח intraoral בשילוב עם FSCV מספק כלי המתודולוגי חשוב שיכול לשמש כדי לבחון כיצד flavorants מוצר הטבק יכול לשנות איתות DA, ובאופן פוטנציאלי את מאפייני חיזוק של ניקוטין.

הנה, יש לנו תיארנו את השיטה של ​​שילוב עירוי tastant intraoral עם FSCV לצורך מדידת DA phasicלשחרר בתגובה לגירויי tastant העיקריים. חשוב לציין כי בעוד שהטכניקה שלנו מאפשרת הבחינה של שחרור DA phasic לtastants העצמאי של פעולה או בחירה, אפשר גם שהאופי הבלתי צפוי של משלוח tastant יכול להשפיע על שחרור DA phasic 19. לפיכך, פתרון בקרה נאות, כגון מים או רוק מלאכותי, יכול לשמש בניסויי שליטה להשוות ולבחון את ההשפעות של גמול בלתי צפוי או גירוי על שחרור עצמאי phasic DA של tastant של עניין. עם זאת, הטכניקה אינה מוגבלת לשתי מדידות של שחרור DA או גמול. לדוגמא, העבודה קודמת בחנה שחרור נוראפינפרין במהלך שני גמול והסלידה 20. מאז חיות לא בקלות לצרוך tastants מרתיע עירוי tastant intraoral עם FSCV הוא הטכניקה זמינה רק למדידת שחרור DA phasic לtastants מרתיע. עם זאת, טכניקה זו אינה לקבוע אם או לא tastant היא מרתיע אוppetitive, ולא, פשוט מודד שחרור DA בצריכה של tastant. כדי לקבוע את הערך הנהנתנית של tastant, ניתן לשלב בדיקות התנהגותיות להתבונן תגובות oro-פנים בתגובתיות טעם (כמתואר במקום אחר 5, 21).

צריך גם לציין כי FSCV מתאים גם למדידת neurochemicals החשובה אחרת, כגון סרוטונין 22 וחמצן 23, אבל שיטות להקלטת analytes אלה בבעלי חיים ער, נעו בחופשיות עדיין אינן זמינות. יתר על כן, עם voltammetry המשולב ושיטת עירוי תוך-שבעל-פה, תגובות דופמין זמן נעול למסירת tastant ניתן לנתח בהעדר התנהגויות אחרות, כגון גישת התנהגות או שליפת מזון, שעשוי להשפיע גם על שחרור DA. כיישום נוסף, משלוח בשילוב intraoral tastant וFSCV עשוי להיות אידיאליים למדידת איתות DA לאירועים מתגמלים או מרתיעה במהלך conditioni אופרנטית או הפבלוביתng. ואכן, פרסום יופיטר האחרון על ידי לוי ועמיתים משלב משלוח tastant פנים הפה עם התנהגות אופרנטית כדי לקבוע אם tastants פנים הפה לתמוך ברכישה והתחזוקה של ממשל עצמי אופרנטית התנהגות 24. כך, יכולות גם להיות משולבות עם שיטות כגון FSCV לזהות תגובת DA phasic לtastants האוראלי בהתנהגות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stimulating electrode PlasticsOne MS303/2-A/SPC when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
Cannula for electrode BioAnalytical Systems MD-2251
Glass capillary A-M systems 624503
Carbon fiber Thornel T650
Electrode puller Narishige International PE-22
Neurolog stimulus isolator Digitimer Ltd. DS4
Heat shrink 3M FP-301
Insulated wires for electrodes Squires electronics Custom L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
Epoxy ITW Devcon 14250 "5 minute epoxy"
Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene Ion Power LQ-1105 i.e., Nafion
Silver paint GC Electronics 22-023
Power supply BK Precision 9110
Tubing for intra-oral catheters Intramedic 427426 PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
Tubing for intra-oral infusion Fischer Scientific 02-587-1A I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Syringe pump for flow cell Pump Systems Inc. NE 1000
Surgical cement Dentsply Caulk 675571 and 675572
Air actuator VICI A60 6 position digital valve interface
Digital valve interface VICI DVI 230 VAC
Quad headstage Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI power supply Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI breakout box Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Power supply for tastant syringe pump Med Associates SG-504
Tastant syringe pump Med Associates PHM-107
Tungsten microelectrode MicroProbes WE30030.5A3
Silver wire reference with AgCl InVivo Metric E255A
Sucrose Sigma 80497
Magnesium chloride Sigma M8266
Sodium chlroide Sigma S7653
Perchloric acid Sigma 244252
Hydrochloric acid (4 M) Sigma 54435
Soidum hydroxide Sigma 306576
Hydrogen peroxide Sigma H1009
Dopamine hydrochloride Sigma H8502
TarHeel HDCV Software University of North Carolina-Chapel Hill Must request software: click here for link to software request page

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
  2. Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
  3. Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
  4. Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
  5. Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
  6. Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
  7. Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
  8. Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
  9. Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
  10. Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
  11. Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
  12. Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  13. Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
  14. Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
  15. Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
  16. Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
  17. Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
  18. Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
  19. Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
  20. Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
  21. Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
  22. Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
  23. Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
  24. Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).

Tags

התנהגות גיליון 102 זכתה דופמין voltammetry גרעין נסמך טעם פנים הפה משלוח סוכרוז מנטול לנוע בחופשיות
בחינת המהירה דופמין Dynamics עם הסריקה מהירה Voltammetry המחזורי במהלך פנים הפה Tastant מנהל בחולדות ערה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E.… More

Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J. Vis. Exp. (102), e52468, doi:10.3791/52468 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter