Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Uyanık Sıçanlarda Intra-Oral tat yoğunluğu arttırıcı madde İdaresi Sırasında Hızlı Tarama Dönüşümlü Voltametri Rapid Dopamin Dynamics incelenmesi

Published: August 12, 2015 doi: 10.3791/52468
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,3,4
1Interdepartmental Neuroscience Program, Yale University, 2Department of Biotechnical and Clinical Laboratory Sciences, School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, 3Department of Psychiatry, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine

Protocol

Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık (NIH) Rehberi National Institutes göre yapılmıştır ve Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1) ameliyat öncesi Hazırlık

  1. Oral Çözelti Hazırlanması
    1. % 10 sakroz ve deiyonize su içinde% 0.005 L-mentol (pH 7.4) çözüm oluşturur. Oda sıcaklığında, kapalı kaplarda bu çözümleri saklayın ve bozulmasını önlemek için, her 2 haftada bir yeniden.
  2. Elektrot kalibrasyon çözümleri
    1. Kalibrasyon öncesinde herhangi bir zamanda Tris tamponu (pH 7.4) sağlayın. Çözelti 12.0 mM Tris-HCI, 140 mM NaCI, 3.25 mM KCI, 1.20 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1.20 mM MgCl2, 2.00 mM Na 2 SO 4 oluşmaktadır.
    2. 0.1 M perklorik asit içinde, 10 mM dopamin (dopamin hidroklorür DA) içindeki bir stok çözeltisi oluşturur. perklorik asit dopamin oksidasyonunu önlere. -20 ° C'de bu stok çözelti depolamak ve en fazla 6 ay için kullanımı. Sadece bir kez, her kısım kullanımı depolama için DA stok çözeltisi, birkaç seferde sağlayın.
    3. 10 mM DA bir stoğundan alınan, 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM, ve 31.25 nM konsantrasyonlarda Tris tamponu içinde seyreltik çözeltiler.
    4. PH kalibrasyonu için, Tris çözeltileri 7.2, 7.3, 7.5 ve 7.6 pH'a sahip tampon hazırlanması. Bu in vivo deney sırasında oluşabilecek pH değişimleri taklit çözümleri sunacak.
  3. Elektrot imalatı
    1. Vakum emiş ile, (çap 0.4 mm iç, uzunluğu 10 mm, dış çap: 0.6 mm) bir borosilikat cam boru içine, bir T-650 C-fiber (7 um çapında) aspire.
    2. Dikey elektrot çektirmesi içine karbon fiber ile dolu cam kapiller yerleştirin. İlk parametreler için, 55,0 ile ısıtıcı ayarlamak ve mıknatıs kapatın. Isıtıcı ve manyetik ayarları hem fr değişir Ancak, daha fazla optimizasyon gerekli olabilirlaboratuvara om laboratuarı.
      Not: Elektrot kolayca mikromanipülatör içine sığabilecek ve sıçan beyninde dura altında en az 6.9 mm eklenir, böylece (konik dahil olmak üzere), en az 5.5 cm uzunluğunda olmalıdır. Elektrot çok kısaysa, nukleus akkumbenlere ventral kısmından kayıtları elde olmayacaktır. Öte yandan, toplam elektrot uzunluğu mikromanipülatör sığmayacak kadar uzun olacak, aksi takdirde 6.5 cm'yi aşmamalıdır.
    3. Camın bitiminden sonra 75-100 mikron uzanır, böylece ışık mikroskobu kullanarak, maruz karbon fiber-kesti. Elektrot sonraki kayıt sırasında minimum gürültü üretecek cam elektrot ve karbon fiber, arasında çok sıkı, ancak ayırt, mühür olduğunu doğrulayın. Fakir mühür göstergesidir cam ya da mühür gevşek olup olmadığını herhangi bir fark çatlaklar, varsa elektrodu atın. Daha ayrıntılı talimatlar [12] ve [13] bakınız.
  4. Mikrofon içine elektrod Montajromanipulator
    1. Tel yarım uzunluğu boyunca izole edilmiş bir 3 üzere 30G tel elde edilir ve gümüş ince bir tabaka tel doğrudan boya uygulamak için küçük bir fırça kullanılır. Hemen gümüş boya uygulandıktan sonra, karbon fiber bir fiziksel ve elektriksel bağlantı sağlamak için elektrot üstündeki deliğe tel yerleştirin. Mikroskop altında, gümüş tel, karbon fiber ile temas edinceye emin olun.
    2. Isı shrink kullanarak mikromanipülatör gümüş tel ve elektrot sabitleyin.
    3. Elektrot yüzeyini temizlemek için ve dopamin sonraki duyarlılığını artırmak için en az 10 dakika süre ile arıtılmış, izopropil alkol (IPA) içinde hazırlanan, karbon lifi elektrot yerleştirin. IPA iliklerine sonra, IPA kaldırmak için musluk suyu ile karbon fiber durulayın.
  5. Referans elektrot imalat
    1. , Yaklaşık 6 mm Ag / Ag Cl örgü (yalnız 7 mm gümüş tel, 6 mm örgü, 0,4 mm çap) içeren 13 mm gümüş tel alınAşağı yaklaşık yarısı orijinal uzunluğunun gümüş kısmını kesip altın pin tel gümüş kısmını lehim.
    2. Pim üzerine lehim üzerine epoksi uygulayın.
    3. Ag Dip / Ag Cl% 5 politetrafluoroetilen ve bir kopolimere ucunu örgü perfloro-3,6-dioksa-4-metil-7octene-sülfonik, her daldırma arasında 30 dakika hava kurutma süreleri ile asit 5 kez.
    4. Kaplanmış Ag / Ag Cl hava kuru O / N örgü izin verin.
    5. 1 saat 120 ºC fırında Cure.

2) Kombine İntraoral Cerrahisi ve İntrakranial Kanülasyon Cerrahisi (yaklaşık 75 dk)

  1. Ağız kateter imalat
    1. Oral kateter yapın ve en az 10 gün önce ameliyat, etilen oksit sterilizasyon sterilize edilir.
    2. 6 cm uzunluğunda bölümler halinde PE 100 boru kesin.
    3. Lehim kullanılarak, PE hortumun bir ucunu eriyik hemen PE boru soğumaya katı bir yüzeye karşı baskı. Sonuç oluşturmanız gerekirküçük, düz PE boru, bir ucunda bir disk ve flanşlı olmamalıdır. Bir iğne (18 G) kullanın veya bu diskin ortasında bir delik oluşturmak için pin itin.
    4. PE boru diğer ucunda, rahatça tüp içine 18 G iğne künt ucunu.
    5. Standart kağıt delgeç kullanılarak, politetrafluoroetilen çamaşır oluşturmak için (3.18 mm kalınlığında, 6 mm çapında), bir politetrafluoroetilen tabakanın birkaç dairesel parça zımba.
    6. Yıkama merkezinde bir delik oluşturur. PE boru takılı iğne alın ve çamaşır makinesi ile tamamen itin. İğne geçer kez yıkayıcı aynı hizada olacak şekilde, PE boru altına rondela kaydırın.
  2. Ağız cerrahisi
    1. (Sterilizasyondan önce kaide altına 2.5 mm kesilmiş), cerrahi aletler, kanül ve referans elektrotu sterilizasyon sonra Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile sıçan anestezisi.
      1. After 5 dakika, anestezi seviyesini değerlendirmek için bir zararlı uyaran testi (ayak veya kuyruk tutam) uygulanır. Konu zararlı uyaran testine herhangi bir fiziksel bir tepki gösteriyorsa, (solunum veya kalp hızında yanıtı, artış korkmak) orijinal dozun% 15'e% 10 ketamin destek yönetmek ve yukarıdaki zararlı uyaran protokolünü tekrarlayın.
    2. Sıçan tamamen anestezi ve zararlı uyaran testi herhangi bir tepki gösterir sonra, kulakların arkasında yaklaşık 2 mm gözlerden sıçan kürk tıraş hayvan kılı makası kullanın. Daha sonra cerrahi sırasında vücut ısısını korumak için ince bir su devridaim ısıtma yastığı sıçan yerleştirin. Göz yağlayıcı. Önceden herhangi bir insizyon gerçekleştirmeden önceki ağız içi kanüllerin yerleştirilmesinden intraperitonal enjeksiyon ile steroidal olmayan anti-enflamatuvar (NSAID) bir ilaç, karprofen (5 mg / kg), uygulayın. Her zaman steril tekniği kullanın.
    3. Cildi temizlemek için% 70 etanol ile takip betadin uygulayın. 3 kez tekrarlayın.
    4. Plasırtında sıçan ce ve steril bir pamuklu çubuk kullanarak ağzını açın. İlk üst molar bulun.
    5. İğne hemen arkasında çıkana kadar yanak ve ilk üst azı arasındaki doku içine iğne takın ve kulaklara medial.
    6. Pierce PE boru kadar deri yoluyla iğne cildi çıkar ve erişilebilir.
    7. (Kanül kendisi değil iğne ile sürükleyici) kanül üzerinde yukarı çekin ve kateter yerinde kalır ve böylece azı dişleri içine politetrafluoroetilen pulu sabitleyin.
      Not: kolay bu adımı kılan bir yamuk şekline yıkayıcı Kesme ve yanak bakacak düz tarafı azı dişleri karşı güvence.
    8. Başka bir politetrafluoroetilen pulu alın ve plastik boru aşağı maruz iğne üzerine kaydırın ve kesi karşı Abut.
    9. Yıkayıcı yukarı kaydırın kalmaması üçgen "bayrak" oluşturmak için sterilize bandı kullanın, politetrafluoroetilen pulu güvenliğini sağlamak için. Yıkama GüvenliSıçan deri ve sterilize bant karşı er.
    10. Boru 2-4 cm sıçan başının üzerine maruz kalmasına izin maruz kateter kesilir.
    11. Tekrarlayın ağız diğer tarafında için 2.2.10 ile 2.2.1 adımları.
  3. Voltammetri intrakranial cerrahi
    1. (3 döngü tekrarı ile gerçekleştirmek,% 70 etanol fırçalayın ardından betadin fırçalayın) stereotaksik çerçeve içinde sıçan yerleştirin ve iki aşamalı fırçalayın kullanarak hayvanın derisini temizleyin.
    2. Kafa derisi doku 15 x 15 mm bölümünü kesip sterilize iğne burun cımbız ve cerrahi makas kullanın.
    3. Yavaşça steril pamuk uçlu aplikatörler kullanılarak kafatasının yüzeyini temizlemek. Bundan başka% 3 hidrojen peroksit 2-3 damla tatbik kafatası temizleyin.
    4. Referans Elektronik için vidaların sonraki girişi için kafatası içinde 3 küçük (1 mm çapında) delikler, kılavuz kanül 1 delik, uyarıcı elektrot için 1 delik ve 1 delik açmak için bir stereotaksik matkap kullanınbindi.
    5. NAC çekirdek kayıtları için, 1,2 mm anterior kılavuz kanül yerleştirin ve 1.4 mm bregma lateral. Plastik taban kafatası ile aynı hizaya gelinceye kadar kanül aparatı indirin.
    6. Kılavuz kanül yarımkürede Kontrlateral sterilize referans elektrot yerleştirin. Referansı dura altında yaklaşık 2 mm indirin.
    7. 5,2 mm posterior ve bregmaya 1,0 mm yanal uyarıcı elektrot yerleştirin ve ventral tegmental alanı (VTA) hedef dura altında 8.0 mm alçaltılmış.
    8. Kafatasına vidaları sabitlemek için steril bir küçük cerrahi bir tornavida kullanın. Ardından, elektrot uyarıcı, referans elektrot yerleştirin ve kanül kılavuz. Son olarak, cranioplastic çimento kullanarak tüm bileşenleri sabitleyin.
    9. Ameliyat sonrası bakım, ilk 48 saat için, deri altına enjeksiyon (5 mg / kg) ile steroidal olmayan anti-inflamatuar ilaç (NSAID), karprofen uygulayın. Önce voltam yapmadan tam cerrahi iyileşme için en az 1 hafta izin vermetry kaydı.
      1. Post-operatif bakım sırasında, günlük su ile yıkayın sözlü kateterler. Çiğneme ve yeme hayvan yardım etmek için 2 gün su içinde doymuş yiyecek sağlamak. (Nedeniyle hafif enfeksiyon ya da dehidratasyon) ağrı stres potansiyel belirtileri için günlük izleme sağlamak ve gerekli uygun müdahaleleri sağlamak (sıvı idaresi, antiseptikler topikal dahil ve ya NSAID Carprofen yönetiminin 5 mg / kg).

3) Awake içinde Voltametrik Kayıtlar Serbestçe Hareketli Fare

  1. Elektrot düşürülmesi ve DA eğitim seti elde.
    1. Deney günü, suyun 200 ul kaynaştırmak ve orofasyal yanıtları gözlemleyerek sözlü kanül açıklığını kontrol edin (sıçan su tatma doğrulamak için).
    2. Bipolar uyarıcı elektrot cannu içine (headstage üzerine) uyarıcı elektrot yerleştirerek sıçan FSCV headstage takınla (sıçan). Böylece, headstage (akım-to-gerilimine çevirici minyatürize) bipolar uyarıcı elektrot doğrudan bağlanır.
    3. Kanül cihazından kukla kanül kaldırın ve kanül içine% 50 heparin solüsyonu iki damla uygulayın. Sonra yavaşça sonradan deney sırasında eklenecektir karbon fiber elektrotları kıracak meydana gelmiş herhangi bir kan pıhtısı veya glial skar, temizlemek için (daha önce kaldırıldı kukla kanül o biraz daha uzun) bir kukla kanül yerleştirin. (En az 2 mm kayıt sitesi üzerinde) kafatası altındaki pıhtıları 3-4 mm temizlenmesi için kullanılan kanül uzatın.
    4. Kılavuz kanül içine elektrotla, mikromanipülatör yerleştirin ve bir "kilitli" konumuna omega halkasını yerleştirin.
    5. Uygun pin headstage referans elektrot teli bağlayın. Sonra headstage uygun kabloya mikromanipülatör çalışan elektrot teli bağlayın.
    6. ELEC indirinkafatası altında yaklaşık 4-4,5 mm Trode.
    7. Bir üçgen dalga formu (400 V / s, -0.4 ile +1.3 V) uygulamak için bir potansiyostatı kullanın. Daha sonraki deneysel kayıtları için 10 Hz dalga uygulaması sıklığını değiştirmek, en az 10 dakika süreyle 60 Hz elektroda dalga biçimini uygulayın.
      Not: 60 Hz dalga uygulaması adımı kararlı bir karbon fiber yüzeyi oluşturur ve elektrik sürüklenme önlemeye yardımcı olur
    8. DA serbest bırakılması ve pH farklı konsantrasyonlarda uyandırmak için, her 2 ms / fazının bir darbe genişliği VTA, çeşitli frekansların pulsları (10-30 darbe) ve akımların (50-150 uA) (10 60 Hz) ile elektrik uyarımı uygulanır vardiya. DA salınımı en az 5 farklı konsantrasyonları ve 5 farklı pH vardiya edinin. Veziküler dolumda [14] sağlamak için uyarılara arasında - (3 dakika minimum 2) bekleyin.
      Not: müteakip sırasında tahsil edilecektir bütün yelpazesinde DA konsantrasyonları uyarılmalara elde etmek önemlidirOnlar Temel Bileşenler Analizi (bakınız bölüm 5.1) için bir eğitim seti olarak kullanılacaktır beri deneme.
    9. NAC çekirdek (dura 6.3 mm ventral) içine elektrot indirin. Geçici DA salma etkinlik dakika başına en azından 1 frekanslarda görülen kadar sonra NAC çekirdek içinde 100 um adımlarla elektrot düşürmektedir.
    10. Bir şırınga pompası bağlanmış bir 20 ml şırınganın hortumu (iç çapı 1/32 ", dış çapı 3/32") bağlanır. Tüpün diğer ucunda, sıçan kanül tüp bağlamak için eğimli 23 G iğne kullanın. Boru istenilen tat yoğunluğu arttırıcı madde ile tamamen dolu olduğundan emin olun ve hiçbir kabarcıklar tüp bulunduğunu doğrulayın.
      Not: Genellikle, kayıttan önce ilk infüzyon tam infüzyon miktarı olup Boru içinde kalan herhangi su veya hava vermesini sağlamak için kayıt için sıçanın ağzına tat yoğunluğu arttırıcı madde bir miktar tatbik. Dahası, bu, bazı önceden deneyimi zekâ var hayvanı veriyorh yeni tat yoğunluğu arttırıcı beri tat yoğunluğu arttırıcı, hatta appetitive olanlar nedeniyle yenilik başlangıçta caydırıcı olabilir.
    11. Veri toplama için, tat yoğunluğu arttırıcı madde 200 ul (6.5 bir pompa kullanılarak sn ve daha önce açıklanan boru) demlenmeye. Tat yoğunluğu arttırıcı her 1-3 dakikada infüze. Tat yoğunluğu arttırıcı madde başına 25 kez toplam infüze. Her bir infüzyon çözeltisinin 200 ul sunar.
    12. Birden tat yoğunluğu arttırıcı tek bir deneyde teslim ediliyor ise, bir tat yoğunluğu arttırıcı madde için veri toplama sonra su ile ağız kateter yıkayın ve yeni tat yoğunluğu arttırıcı beslerken önce en az 20 dakika bekleyin.
    13. DA kayıt seansından sonra, kayıt yerinde küçük bir lezyon oluşturarak histolojik doğrulama için hazırlamak. Sonraki kalibrasyon için karbon fiber elektrot korumak için, ilk olarak elektrodu geri çekin ve mikromanipülatör çıkarın. Sonra orijinal karbon f olarak (dura altında) aynı derinlikte bir cam mikroelektrot ve (cam ucu ötesinde 100 mikron uzanan) tungsten tel ile yeni bir mikromanipülatör kullanıniber mikroelektrot.
    14. 10 V ayar elde edilinceye kadar histolojik doğrulama için, tungsten telinin 3 V uygulanması ve 1 V artışlarla gerilimi artırarak her 10 saniyede bir küçük lezyon oluşturur.
    15. Bir standart konsantrasyon eğrisi zaten birden fazla karbon fiber elektrotlar kullanılarak oluşturulmuş ise, doğrudan potansiyel karbon fiber elektrot uygulayarak (3.1.14) Yukarıdaki lezyon adımı gerçekleştirmek.
      Not: Bu lezyon yöntemi karbon fiber zarar ve bu özel elektrot ile sonraki kalibrasyon önleyecektir.
    16. Öldürücü püskürtme pentobarbital (150 mg / kg, ip) kullanılarak hayvan Euthanize.
    17. Başlık sistemi doğrudan yukarı çekerek pense ile kanül ile başlık sistemi yerinden. Bu beyne gereksiz hasara neden olabilir ve bu zorlu histoloji sırasında elektrodun konumunu belirlemek için yapacak çünkü başlık sistemi bükmeyin.
      1. % 30 su ve ardından 3 gün boyunca% 4 formalin beyin ve yer çıkarın1 hafta crose. Bir Kriyostat kullanarak 30 mikron dilim oluşturun karbon fiber veya tungsten lezyonun yerini belirlemek için bir ışık mikroskobu altında dilimleri kapak fişleri monte ve inceleyin.
        Not: Perfüzyon 3.1.17 için isteğe bağlıdır.

4) Elektrot Kalibrasyon

  1. Bir akım konsantrasyon dönüşüm faktörü oluşturmak için akış hücresi kullanılarak.
    1. Elektrot duyarlılığını tespit etmek için, bir akış "T-hücresi" aparatı kullanılarak, her deney sonrasında elektrotlar kalibre edin. Tris tamponu, pH çözeltiler ya da DA çözeltiler (2 ml / dk bir oranda) elektrod yüzeyi üzerinde yıkanır ise "T-hücresi" olarak elektrot indirin. Tamponu ve pH veya DA çözeltisi arasında ileri ve geri geçiş yapmak için altı pozisyon hava selenoid çalıştırıcıyı kullanın.
    2. Her bir kalibrasyon için, 20 sn, ardından pH DA çözeltisi 5 saniye uygulama, ardından Tris tamponu (taban çizgisi) ve 5 saniye uygulama sırasında voltametrik veri toplamakTris tamponu (30 sn toplam dosyası) pplication. Her standardın farklı konsantrasyonları arasındaki dengelemek, her kalibrasyon standart konsantrasyonu için her zamanında 3 kez tekrarlayın.
    3. Her örnek toplanması için, zirveye DA veya pH uyarılmış akım ölçer. Pik akım ilişki karşı bir konsantrasyon elde etmek için her deneme boyunca tepe akımını ortalama. Daha ayrıntılı talimatlar [12] ve [13] bakınız.

5) Veri Analizi

  1. Temel bileşenler analizinde belirlenen bir eğitim Kullanma (PCA)
    Not: voltametri deney sırasında, çıkış dopamin oksidasyon ve indirgeme, pH vardiya, ve elektrokimyasal gürültü sonucu olan, mevcut olarak üretilir. Biri istenen bileşenleri (DA ve pH) izole etmek ve istenen sinyalleri deforme olabilecek ek bileşenleri kaldırmak böylece PCA (daha ayrıntılı bilgi için, 15, 16 bakınız) Bu faktörlerin ayırımını sağlar.
    1. Inci bir kalibrasyon faktörü atamaE çıkış akımı PCA sonra (yaklaşık 5-10 nA / uM) analitlerin konsantrasyonu değerlerinin tespit edilmesi için izin vermek.
    2. "Tren" PCA modeli DA, pH ve diğer faktörleri ayırmak için bir deney sırasında elde eğitim setini kullanın. PCA halkalı voltamogramları set eğitim (bölüm 3.1.8 toplanan) alır ve voltogramda temel özellikleri in vivo voltametri kayıtları sırasında toplanan her analit tanımlamak için kullanılabilecek belirler.
    3. Tutmak için temel bileşen sayısını belirlemek için, bir Malinowski F-testi kullanın. Tipik olarak, normalde verilerde varyansın yaklaşık 95-99% açıklamak sadece 2 ya da 3 temel bileşenleri tutmak. Malinowski F-testi uygulanmasına ilişkin ayrıntılı bir tartışma için, bakınız 17.
      Not: bileşenlerin sayısı belirlendikten sonra, PCA analizi etkin bir DA ölçülen voltamogramları proje olacak ve pH eğitimi muhafaza edilmiştir temel bileşenler üzerine ayarlar.Sonuç (beklenen çıkış için Temsilcisi Sonuçları gör) Sadece DA (veya pH) verileri kalır ve DA benzer veya pH değil artık veriler kaldırılır böylece süzülmüş edilmiş bir veri kümesidir. Voltametrik analizler için PCA kullanarak adım öğretim daha ayrıntılı bir açıklama ve adım için Malzemeler levha ve 16, 17 bkz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intraoral kateter implantasyonu ile birlikte FSCV nasıl sakaroz, İştah açıcı tat yoğunluğu arttırıcı incelemek için kullanılan, NAC çekirdek fazik DA salınımını düzenler. Tat yoğunluğu arttırıcı madde infüzyon, elektriksel stimülasyon öncesinde., VTA (150 uA, 60 Hz, 24 bakliyat, kırmızı çubuk ile gösterilir) Şekil 1 NAC (Şekil 1) fazik DA sürümde sağlam artışlar üreten potansiyeli olan bir renk grafiğini göstermektedir z ekseni y-ekseni, x-ekseni üzerinde zaman ve geçerli (yanlış renk olarak ifade edilir). Renk arsa Aşağıda zaman iz karşı DA konsantrasyonu. Zamana karşı konsantrasyon dopamin oksidasyon potansiyeli akım zamana karşı izleme kullanılarak belirlenmiştir elektrot sonrası kalibrasyon, aşağıdaki konsantrasyonuna dönüştürüldü, (kesikli beyaz bir çizgi ile gösterilir). Zaman iz karşı bu DA konsantrasyonu PCA için belirlenen eğitimin bir parçası olarak kullanıldı.

Sakaroz eğitim seti satın alındı ​​sonra, 25 infüzyon(% 10, infüzyon başına 200 ul), her 1-3 dakikada verildi. Fazik DA Yayım sakaroz modülasyon örnekleri, Şekiller 2 ve 3'te gösterilmektedir. Şekil 2'de, (kırmızı çubuğu ile gösterilir) 6.5 sn infüzyon oksidasyon potansiyeli (beyaz, aşağı doğru bakan, ok ile gösterilen) geçerli bir artışa üretilen DA (beyaz kesik çizgi ile gösterilir). PCA tat yoğunluğu arttırıcı madde yanıtlarında yükseltilmiş akım DA konsantrasyonunda bir artışın bir sonucu olduğu belirlenmiş sonra zaman grafiği bir konsantrasyonda veri dönüştürme. Zaman örneği ya tat yoğunluğu arttırıcı madde infüzyonu sonrasında artmış DA konsantrasyonunu açığa içi ağız sukroz ve mentol için izleri karşı bir başka tat yoğunluğu arttırıcı, mentol (% 0.005, infüzyon başına 200 ul) de NAC çekirdeğindeki FSCV kayıtları sırasında infüze edildi. Şekil 3 DA konsantrasyonunu gösterir . Bir tat yoğunluğu arttırıcı karşı fazik DA sürümde deneme değişkenlik bazı deneme (Şekil 2 ve 3A) görmek için beklemek gerekir. Ancak, biz genellikle birden fazla çalışmalarda üzerinde fazik DA sürümde bir artış ya da azalma yönünde herhangi bir non-spesifik eğilimleri görmüyorum. 10-100 nM DA aralıkları tek bir hayvanda, tipik bir deneyde beklenebilir.

Figür 1
NAC çekirdek elektrikle uyarılmış DA salınımı zaman arsa (alt) karşı Şekil 1. Temsilcisi renk arsa (üstte) ve konsantrasyon. Kırmızı çubuk stimülasyon süresini gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Sakaroz, tek bir infüzyon sırasında zaman iz (altta) karşı Şekil 2. Temsilcisi renk arsa (üstte) ve DA konsantrasyonu. Kırmızı bar 6.5 sn infüzyon gösterir. Beyaz aşağı bakacak ok DA oksidasyon potansiyelinde (yanlış renkte gösterilen) akım yükseklik gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
(A)% 10 sakaroz ve (B) ağız içi yönetimi tarafından% 0,005 mentol sırasında zaman izleri karşı Şekil 3. Temsilcisi DA konsantrasyonu. Kırmızı çubuk 6.5 sn intraoral infüzyon gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FSCV ile birlikte intraoral tat yoğunluğu arttırıcı madde teslim sözlü çeşni verici maddeler için "gerçek zamanlı" DA yanıtları analiz edilmesini sağlar. Başarılı DA ölçümleri için gerekli olan protokolde üç kritik adımlar vardır. İlk olarak, diş kateterin uygun bir implantasyon çeşni verici maddeler verilmesi için kritik önem taşır. Kateter birinci molar arkasında takılı ve yerine sıkışmış sağlamak açıklığı kaybetme kateter önler ve hayvan tarafından yanlışlıkla kaldırılmasını önler. Iyileşme sonrası ilk birkaç gün içinde kateteri Yıkanması ilk 2 ya da 3 gün boyunca hayvana verilen yumuşak gıda ameliyat sonrası kateter tıkayabilecek beri de önemlidir. İkinci olarak, elektrot kalitesi serbestçe hareket eden bir sıçan sinyal-gürültü oranını artırmak için kritik önem taşır. Bazı durumlarda, görsel olarak görünür elektrotlar, yüksek kalite ve yine gürültülü sinyal verebilir iyi durumda olması için. Bu sorunu gidermek için bir yolu d başlangıç ​​kayıtları almaktırORSAL striatum (dura altında 4 mm). Elektrot çok fazla gürültü üreten, elektrot kaldırılır ve önceki NAC çekirdek kayıt sitesinde (dura altında 6-7 mm) deneyi gerçekleştirmek için yeni bir elektrot ile değiştirilebilir. Üçüncü kritik bir adım kendiliğinden DA bırakma olayları ("geçici") DA konsantrasyonu (en az 20 nM yeterli artış ile yeterli frekansta (min başına en az 1) gözlenir hedeflenen beyin bölgesi, uygun bir kayıt konumu bulma 40 nM). Bu optimizasyon kendiliğinden fazik DA bırakma olayları öncesinde aromalı uygulamadan belirli bir yerde, tespit edilebilir olmasını sağlayacaktır. Maruz kalan karbon fiber (50-100 mikron) büyüklüğüne eşdeğer artışlarla elektrot düşürülmesi saptanabilir geçici bir kayıt sitesi bulma şansını maksimize eder.

FSCV bir dif beri FSCV önemli bir uyarı, zaman içinde bir noktada mutlak analit konsantrasyonunu belirlemek için yetersizlikHer voltametri kayıt dosyası sırasında (istikrarlı bir başlangıca kıyasla) göreli konsantrasyon değişiklikleri ölçen ferential tekniği. Bununla birlikte, ayırıcı tekniği, aynı zamanda tatmin edici ve olumsuz tat yoğunluğu arttırıcı madde 5, her iki tepki olarak dopamin konsantrasyonu alt ikinci dalgalanmaların ölçümü sağlar. Nikotin bağımlılığı gibi mentol ve sözlü tatlandırıcılar gibi tütün ürünü katkı bağlamında, sigara içme davranışını etkilemek 18 gösterilmiştir ve son zamanlarda Önleme ve Tütün Kontrol Kanunu Sigara Ailesi tarafından (mentol hariç) sigara yasaklanmış oylandı. Böylece, FSCV ile birlikte ağız içi teslimat potansiyel nikotin takviye özelliklerini tütün ürünü aromalar DA sinyalini değiştirebilir nasıl incelemek için kullanılan ve olabilir önemli bir metodolojik bir araç sağlar.

Burada, biz fazik DA ölçmek amacıyla FSCV ile intraoral tat yoğunluğu arttırıcı madde infüzyon birleştirerek yöntem tanımlanmıştırBirincil tat yoğunluğu arttırıcı madde uyaranlara yanıt olarak bırakın. Bu bizim teknik eylemi veya seçimi bağımsız tat yoğunluğu arttırıcı ile fazik DA sürümü muayene izin verirken, bu tat yoğunluğu arttırıcı teslim beklenmedik doğa fazik DA salınımını 19 etkileyebilecek olması da mümkündür olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu durumda, örneğin, su ya da yapay tükürük gibi uygun bir kontrol solüsyonu, ilgi konusu tat yoğunluğu arttırıcı madde fazik DA salma bağımsız üzerinde beklenmedik bir ödül veya uyarıcı etkisini karşılaştırmak ve incelemektir kontrol deneylerinde kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknik DA serbest veya ödül iki ölçümleri ile sınırlı değildir. Örneğin, önceki çalışma ödül ve kaçınma 20 hem sırasında norepinefrin salınımını incelemiştir. Hayvanlar kolayca yok FSCV ile caydırıcı tat yoğunluğu arttırıcı ağız içi tat yoğunluğu arttırıcı madde infüzyonu tüketmek beri caydırıcı tat yoğunluğu arttırıcı için fazik DA salınımını ölçmek için kullanılabilen tek tekniktir. Bununla birlikte, bu teknik, bir tat yoğunluğu arttırıcı madde caydırıcı ya da bir olup olmadığını belirlemek etmezppetitive yerine, basitçe tat yoğunluğu arttırıcı madde tüketimi sırasında DA salınımını ölçer. (Başka yerde 5, 21 anlatıldığı gibi) bir tat yoğunluğu arttırıcı madde hedonik değerini belirlemek amacıyla, davranış testleri tat reaktivitesi sırasında oro-fasiyal yanıtları gözlemlemek için dahil edilebilir.

Ayrıca FSCV aynı zamanda serotonin 22 ve oksijen 23 gibi diğer önemli neurochemicals ölçmek için uygun olmakla birlikte, uyanık, serbest hareket eden hayvanlar, bu analitlerin kayıt için yöntemler henüz mevcut olmadığı not edilmelidir. Ayrıca, kombine voltametre ve ağız içi infüzyon yöntemi ile, tat yoğunluğu arttırıcı madde teslimat süresi kilitli dopamin yanıtları da DA salınımını etkileyebilecek bu tür bir yaklaşım davranışı veya gıda alma gibi diğer davranışlar, yokluğunda analiz edilebilir. Ek bir uygulama olarak, kombine intraoral tat yoğunluğu arttırıcı madde teslimat ve FSCV edimsel veya Pavlov conditioni sırasında ödüllendirme ya da caydırıcı olaylara DA sinyalizasyon ölçmek için ideal olabilirng. Nitekim Levy ve arkadaşları tarafından son vallahi yayını ağız içi tat yoğunluğu arttırıcı edinme ve edimsel öz-yönetim davranışı 24 korunmasına destek olup olmadığını belirlemek için edimsel davranışları ile-içi ağız tat yoğunluğu arttırıcı madde teslimatı birleştirir. Bu durumda, bu yöntemler de davranışı sırasında oral tat yoğunluğu arttırıcı madde için fazik DA tepkisini tespit etmek FSCV ile kombine edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stimulating electrode PlasticsOne MS303/2-A/SPC when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
Cannula for electrode BioAnalytical Systems MD-2251
Glass capillary A-M systems 624503
Carbon fiber Thornel T650
Electrode puller Narishige International PE-22
Neurolog stimulus isolator Digitimer Ltd. DS4
Heat shrink 3M FP-301
Insulated wires for electrodes Squires electronics Custom L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
Epoxy ITW Devcon 14250 "5 minute epoxy"
Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene Ion Power LQ-1105 i.e., Nafion
Silver paint GC Electronics 22-023
Power supply BK Precision 9110
Tubing for intra-oral catheters Intramedic 427426 PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
Tubing for intra-oral infusion Fischer Scientific 02-587-1A I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Syringe pump for flow cell Pump Systems Inc. NE 1000
Surgical cement Dentsply Caulk 675571 and 675572
Air actuator VICI A60 6 position digital valve interface
Digital valve interface VICI DVI 230 VAC
Quad headstage Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI power supply Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI breakout box Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Power supply for tastant syringe pump Med Associates SG-504
Tastant syringe pump Med Associates PHM-107
Tungsten microelectrode MicroProbes WE30030.5A3
Silver wire reference with AgCl InVivo Metric E255A
Sucrose Sigma 80497
Magnesium chloride Sigma M8266
Sodium chlroide Sigma S7653
Perchloric acid Sigma 244252
Hydrochloric acid (4 M) Sigma 54435
Soidum hydroxide Sigma 306576
Hydrogen peroxide Sigma H1009
Dopamine hydrochloride Sigma H8502
TarHeel HDCV Software University of North Carolina-Chapel Hill Must request software: click here for link to software request page

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
  2. Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
  3. Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
  4. Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
  5. Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
  6. Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
  7. Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
  8. Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
  9. Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
  10. Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
  11. Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
  12. Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  13. Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
  14. Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
  15. Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
  16. Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
  17. Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
  18. Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
  19. Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
  20. Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
  21. Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
  22. Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
  23. Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
  24. Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).

Tags

Davranış Sayı 102 Ödül dopamin voltametri nükleus akumbens tat ağız içi teslimat sukroz mentol serbestçe hareket eden
Uyanık Sıçanlarda Intra-Oral tat yoğunluğu arttırıcı madde İdaresi Sırasında Hızlı Tarama Dönüşümlü Voltametri Rapid Dopamin Dynamics incelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E.… More

Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J. Vis. Exp. (102), e52468, doi:10.3791/52468 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter