Protocol
Alla experiment utfördes enligt National Institutes of Health (NIH) Guide för skötsel och användning av försöksdjur och godkändes av Yale University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1) Pre-kirurgiska preparat
- Oral lösningsberedning
- Skapa lösningar av 10% sukros och 0,005% L-mentol i avjoniserat vatten (pH 7,4). Förvara dessa lösningar i slutna behållare vid RT, och remake var 2 veckor, för att förhindra nedbrytning.
- Elektrodkalibreringslösningar
- Gör Trisbuffert (pH 7,4) när som helst före kalibrering. Lösningen består av 12,0 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,20 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM MgCl2, och 2,00 mM Na 2 SO 4.
- Skapa en stamlösning av 10 mM dopamin (DA; dopaminhydroklorid) i 0,1 M perklorsyra. Den perklorsyra hjälper till att förhindra oxidation av dopamine. Lagra denna förrådslösning vid -20 ° C och använd i upp till 6 månader. Gör flera portioner av DA stamlösning för lagring att använda varje portion endast en gång.
- Från 10 mM DA lager, utspädda lösningar i Tris-buffert till koncentrationer av 1 | iM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, och 31,25 nM.
- För pH-kalibrering, bereda lösningar av TRIS-buffert med pH-värdet på 7,2, 7,3, 7,5, och 7,6. Detta kommer att ge lösningar som efterliknar pH förändringar som kan uppstå under in vivo experiment.
- Elektrod tillverkning
- Genom vakuumsug, aspirera en T-650 kolfiber (7 pm i diameter) i en borosilikatglas kapillär (längd 10 mm, ytterdiameter 0,6 mm, innerdiameter 0,4 mm).
- Placera glaskapillär fylld med kolfiber i en vertikal elektrod avdragare. För första parametrar, ställer värmaren till 55,0 och stänga av magneten. Emellertid kan ytterligare optimering vara nödvändig eftersom både värmare och magnetiska inställningar varierar frOm labb till labb.
Anmärkning: Elektroden bör vara minst 5,5 cm lång (inklusive avsmalning), så att det lätt kan passa in i mikromanipulator och införas åtminstone 6,9 mm under dura i råtthjärnan. Om elektroden är för kort, kommer inspelningar från ventrala delen av nucleus accumbens inte kunna uppnås. Å andra sidan bör den totala elektrodlängden inte överstiga 6,5 cm annars blir det för lång tid att passa in i mikromanipulator. - Med hjälp av en ljusmikroskop, skär den exponerade kolfiber så att den sträcker sig 75-100 pm efter utgången av glaset. Verifiera att elektroden har en mycket snäv, knappt urskiljbar, tätning mellan glaselektroden och kolfiber, som kommer att producera minimalt brus under efterföljande inspelning. Kassera elektroden om det finns några märkbara sprickor i glaset eller om förseglingen är lös, vilket är indikativt för en dålig tätning. För mer detaljerade instruktioner se [12] och [13].
- Montering av elektroden i mikrofonenromanipulator
- Skaffa en 3 i, 30G tråd som är isolerad längs halva längden av tråden och använda en liten borste för att applicera ett tunt lager av silver måla direkt till ledningen. Omedelbart efter applicering av silverfärg, föra in kabeln i hålet på toppen av elektroden för att åstadkomma en fysisk och elektrisk anslutning till kolfiber. Under ett mikroskop, säkerställa att silvertråd i kontakt med kolfiber.
- Säkra silvertråd och elektroden till mikromanipulator med hjälp av krymps.
- Placera beredd kolfiber elektroden i renat isopropylalkohol (IPA) under minst 10 minuter för att rengöra elektrodytan och för att öka efterföljande känslighet för dopamin. Efter blötläggning i IPA, skölj kolfiber med kranvatten för att avlägsna IPA.
- Referens elektrodtillverkning
- Ta en 13 mm silvertråd innehållande en ungefärligen 6 mm Ag / Cl mesh (7 mm silver ensam tråd, 6 mm mask, 0,4 mm i diameter),skär silverdelen ned till ungefär hälften av sin ursprungliga längd och löda silver del av tråden till en guldstift.
- Applicera epoxi över lodet på stiftet.
- Doppa Ag / Ag Cl mesh änden till en sampolymer av 5% polytetrafluoretylen och perfluor-3,6-dioxa-4-metyl-7octene-sulfonsyra 5 gånger, med 30 min lufttorkningsperioder mellan varje dopp.
- Låt belagda Ag / Ag Cl mesh lufttorka O / N.
- Härda i ugn vid 120 ° C i 1 timme.
2) Kombinerad Intraoral kirurgi och Intracranial Kanyle Surgery (cirka 75 minuter)
- Oral katetertillverkning
- Gör det muntliga katetern, och sterilisera etylenoxidsterilisering, åtminstone 10 dagar före operation.
- Klipp PE 100 slang till 6 cm långa segment.
- Med hjälp av en lödkolv, smälta ena änden av PE-rör och omedelbart pressa mot en fast yta för att kyla PE-slang. Resultatet bör skapaen liten, plan skiva vid ena änden av PE-slang och bör inte flänsas. Använd en nål (18 G) eller tryck stift för att skapa ett hål i mitten av denna skiva.
- På den andra änden av PE-rör, tätt sätter den trubbiga änden av en 18 G nål i röret.
- Med en vanlig pappershålslaget, punsch flera cirkulära bitar av en polytetrafluoretylen ark (3,18 mm tjock, 6 mm i diameter) för att skapa polytetrafluoretylen brickor.
- Skapa ett hål i mitten av brickan. Ta nålen ansluten till PE rör och tryck in det helt genom brickan. När nålen är genom att skjuta brickan till botten av PE slangen så att den ligger an mot brickan.
- Munkirurgi
- Efter sterilisering av kirurgiska verktyg, kanyl (trimmas till 2,5 mm under sockeln före sterilisering), och referenselektrod, söva råttan med en intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg).
- After 5 minuter, tillämpa en skadlig stimulans test (fot eller svans nypa) för att bedöma graden av anestesi. Om motivet visar någon fysisk reaktion på skadlig stimulans testet (haja respons, ökade andnings- eller hjärtfrekvens), administrera en ketamin boost av 10% till 15% av den ursprungliga dosen och upprepa skadlig stimulans protokollet ovan.
- Efter råttan är helt bedövad och visar ingen reaktion på skadliga stimulans testet använder djur hårklippningsmaskiner rakning råtta päls från ögonen till ca 2 mm bakom öronen. Placera sedan råttan på en tunn vattencirkulationsvärmedyna för att hålla kroppstemperaturen under operation. Applicera ögon smörjmedel. Administrera den icke-steroidala antiinflammatoriska (NSAID) läkemedel, Karprofen (5 mg / kg), genom intraperitoneal injektion före utför några snitt och före införande intraorala kanyler. Använd aseptisk teknik vid alla tidpunkter.
- Applicera Betadine följt av 70% etanol för att rengöra huden. Upprepa 3 gånger.
- Place råttan på rygg, och öppna munnen med användning av en steril bomullstopp. Hitta den första övre molar.
- Stick in nålen i vävnaden mellan kinden och den första övre molar tills nålen lämnar precis bakom och mediala till öronen.
- Pierce nålen genom huden tills PE slangen lämnar huden och är tillgänglig.
- Dra upp kanylen (gripande av kanylen självt och inte nålen) och säkra polytetrafluoretylen bricka i kindtänderna så att katetern kvar på plats.
Obs: Skär brickan i en trapetsform och säkra den mot kindtänderna med den platta sidan är vänd mot kinden gör detta steg enklare. - Ta en annan polytetrafluoretylen bricka och skjut den över den exponerade nålen ner plastslang, och ligger an mot snittet.
- För att säkra polytetrafluoretylen bricka, använd steriliseras tejp för att skapa en triangulär "flagga", så att brickan inte glider upp. Säkra tvätter mot råttans hud och steriliserade bandet.
- Skär den exponerade katetern att tillåta 2-4 cm slang att exponeras över råttans huvudet.
- Upprepa steg 2.2.1 till 2.2.10 för den andra sidan av munnen.
- Efter sterilisering av kirurgiska verktyg, kanyl (trimmas till 2,5 mm under sockeln före sterilisering), och referenselektrod, söva råttan med en intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg).
- Intrakraniell kirurgi för voltametri
- Placera råttan i stereotaxic ramen och rengör djurets hårbotten med hjälp av en tvåstegs scrub (en Betadine scrub följt av en 70% etanol skrubba, utför med en 3 cykel upprepning).
- Använd steriliserade nål näsa pincett och kirurgisk sax för att klippa bort en 15 x 15 mm del av hårbotten vävnad.
- Rengör försiktigt ytan av skallen med hjälp av steriliserade bomull spets applikatorer. Ytterligare rensa skallen genom applicering 2 till 3 droppar av 3% väteperoxid.
- Använd en stereotaktisk borr för att göra 3 små hål (1 mm diameter) i skallen för efterföljande införande av skruvar, 1 hål för styr kanylen, 1 hål för stimulerande elektroden och 1 hål för referens utvaldared.
- För inspelningar i NAC kärna, placera guiden kanylen på 1,2 mm främre och 1,4 mm lateralt bregma. Sänk kanylen apparaten tills plast basen är i jämnhöjd med skallen.
- Placera den steriliserade referenselektroden i hemisfären kontralateralt till styr kanylen. Sänk referens ca 2 mm under dura.
- Placera stimulerande elektroden vid 5,2 mm posteriort och 1,0 mm lateralt till bregma och sänktes 8,0 mm under dura att rikta den ventrala tegmentala området (VTA).
- Använd en steriliserad liten kirurgisk skruvmejsel för att säkra skruvarna till skallen. Sedan sätter referenselektrod, stimulerande elektrod, guide kanyl. Slutligen, fast alla komponenter använder cranioplastic cement.
- Under de första 48 timmarna av postoperativ vård, administrera den icke-steroidala antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) Karprofen genom subkutan injektion (5 mg / kg). Låt åtminstone 1 vecka för fullständig kirurgisk återhämtning innan du utför voltamMetry inspelning.
- Under postoperativ vård, skölj orala katetrar dagligen med vatten. Ge mat mättad i vatten i 2 dagar att hjälpa djuret att tugga och äta. Ge daglig övervakning för potentiella tecken på stress av smärta (på grund av lindrig infektion eller uttorkning) och ge lämpliga åtgärder vid behov (inklusive administration av vätskor, topisk administrering av antiseptiska medel, och eller NSAID Karprofen administration på 5 mg / kg).
3) voltammetriska Recordings i Vakna, fritt rörliga Rat
- Sänkning elektroden och skaffa en DA träningsuppsättning.
- På dagen för experimentet, kontrollera öppenhet av det muntliga kanylen genom infusion 200 pl vatten och observera orofaciala svar (för att kontrollera att råttan smaka på vattnet).
- Fäst FSCV huvudsteg till råttan genom att sätta stimulerande elektroden (på huvudsteg) i den bipolära stimulerande elektrod cannula (på råtta). Sålunda förbinder huvudsteg (miniatyriserad ström-till-spänningsomvandlare) direkt till den bipolära stimulerande elektrod.
- Ta bort blind kanylen från kanylen apparaten och applicera två droppar 50% heparinlösning in i kanylen. Sedan försiktigt in en dummy kanyl (något längre att blind kanyl som tidigare togs bort) för att rensa eventuella blodproppar eller glia ärrbildning som kan ha inträffat, vilket kommer att bryta kolfiberelektroder som sedan kommer att införas under experimentet. Förläng kanyl som används för att rensa proppar 3-4 mm under skallen (åtminstone 2 mm ovanför inspelningsplatsen).
- Sätt i mikromanipulator, med elektroden, in i styrkanylen och placera omega ringen i en "låst" läge.
- Anslut referenselektrodtråden från huvudsteg till rätt stift. Anslut sedan arbetselektrodtråden från mikromanipulator till rätt tråd på huvudsteg.
- Sänk eltrampade till ungefär 4-4,5 mm under skallen.
- Använd en potentiostat att tillämpa en triangulär vågform (400 V / s, -0,4 till +1,3 V). Applicera vågform till elektroden vid 60 Hz för åtminstone 10 minuter, sedan ändra ansökan vågformen frekvensen till 10 Hz för efterföljande experimentella inspelningar.
Obs! 60 Hz ansökan vågform steg alstrar en stabil kolfiber yta och kommer att bidra till att förhindra elektrisk drift - Applicera elektrisk stimulering till VTA med olika frekvenser (10 till 60 Hz) pulser (10 till 30 pulser) och strömmar (50 till 150 iA) alla med en pulsbredd på 2 ms / fas, att framkalla olika koncentrationer av DA utsläpp och pH skift. Skaffa minst 5 olika koncentrationer av DA frisättning och 5 olika pH-skift. Vänta (2-3 minuter minimum) mellan stimuleringar för att möjliggöra för vesikulär omlastning [14].
OBS: Det är viktigt att få stimuli som producerar DA koncentrationer över hela området som kommer att samlas in under den efterföljandeexperiment eftersom de kommer att användas som en övningsuppsättning för Principal Component Analysis (se avsnitt 5.1). - Sänk elektroden i NAC kärna (6,3 mm ventrala att dura). Därefter sänka elektroden i steg 100 um inom NAC kärna tills gående DA släpp händelser observeras vid frekvenser på minst 1 per minut.
- Anslut slang (innerdiameter 1/32 ", ytterdiameter 3/32") till en 20 ml spruta, ansluten till en sprutpump. På andra änden av röret, använd en avfasad 23 G nål för att ansluta slangen till råttans kanylen. Se till att slangen är helt fylld med den önskade tastant och kontrollera att inga bubblor finns i slangen.
Notera: Typiskt administrerar en liten mängd tastant in i munnen hos råttan före inspelning för att se till att den första infusionen för inspelning levererar den fulla infusions beloppet och inte eventuellt kvarvarande vatten eller luft i slangen. Dessutom tillåter detta djuret att ha tränat tidigare intelligensh tastant sedan nya tastants, även appetitive sådana, kan vara obehaglig initialt på grund av sin nyhet. - För datainsamling, ingjuta 200 pl tastant (6,5 sek med hjälp av en pump och tidigare beskrivna slangar). Ingjuta tastant varje 1-3 min. Ingjuta totalt 25 gånger per tastant. Varje infusion levererar 200 pl lösning.
- Om flera tastants är levereras i ett enda experiment, spola muntliga katetern med vatten efter att samla in uppgifter för en tastant och vänta minst 20 minuter innan infusion den nya tastant.
- Efter DA inspelningen, förbereda för histologisk kontroll genom att skapa en liten skada på inspelningsplatsen. För att bevara kolfiber elektroden för efterföljande kalibrering, först dra tillbaka elektroden och ta mikromanipulator. Använd sedan en ny mikromanipulator med ett glas mikroelektrod och en volframtråd (som sträcker sig 100 pm utanför glaset spets) till samma djup (under dura) som den ursprungliga kolfiberIber mikroelektrod.
- För histologisk kontroll, skapa en liten lesion genom att applicera tre V på volframtråd och öka spänningen vid steg om 1 V, varje 10 sekund, tills inställningen 10 V har uppnåtts.
- Om en koncentrationskurva standard redan har skapats med hjälp av flera kolfiberelektroder, utföra lesionen steg över (3.1.14) genom att applicera potentialen direkt kolfiberelektrod.
Obs: Denna skada metod skadar kolfiber och förhindra efterföljande kalibrering med den specifika elektroden. - Euthanize djuret med användning av en dödlig injektion pentobarbital (150 mg / kg, ip).
- Lösgöra headcap med kanyler med en tång genom att dra direkt uppåt på headcap. Vrid inte headcap eftersom detta kommer att orsaka onödiga skador på hjärnan och gör det svårt att identifiera var elektroden under histologi.
- Ta bort hjärnan och placera i 4% formalin i 3 dagar, följt av 30% suCrose för 1 vecka. Skapa 30 | im skivor med användning av en kryostat, montera på täckglas och undersöka skivor under ett ljusmikroskop för att identifiera placeringen av kolfiber eller volfram lesionen.
Obs: Perfusion är frivilligt för 3.1.17.
- Ta bort hjärnan och placera i 4% formalin i 3 dagar, följt av 30% suCrose för 1 vecka. Skapa 30 | im skivor med användning av en kryostat, montera på täckglas och undersöka skivor under ett ljusmikroskop för att identifiera placeringen av kolfiber eller volfram lesionen.
4) Elektrod Kalibrering
- Använda flödescellen för att skapa en ström-koncentration omvandlingsfaktor.
- För att bestämma elektrodkänslighet, kalibrera elektroderna efter varje experiment med hjälp av ett flöde "t-cell" apparaten. Sänk elektroden i det "T-cell", medan Tris-buffert, pH-lösningar, eller DA-lösningarna tvättas över elektrodytan (vid en hastighet av 2 ml / min). Använd en sex-läge luft solenoidmanöverdon att växla fram och tillbaka mellan buffert och pH eller DA-lösning.
- För varje kalibrering, samla voltammetriska data under 5 sek tillämpning av Tris-buffert (baseline), följt av 5 sek tillämpning av pH eller DA-lösning, följt av 20 sek enillämpningen av Tris-buffert (30 sek totala filen). Upprepa varje körning 3 gånger för varje kalibreringsstandardkoncentration, motvikt mellan olika koncentrationer av varje standard.
- För varje provsamling, mäta topp DA eller pH-framkallade strömmen. Genomsnitt toppströmmen över varje försök att få en koncentration kontra topp nuvarande förhållande. För mer detaljerade instruktioner se [12] och [13].
5) Data Analysis
- Med hjälp av en utbildning som i principalkomponentanalys (PCA)
Obs: Under ett voltametri experiment, är utgångs produceras så aktuell, vilket är ett resultat av dopamin oxidation och reduktion, pH skift, och elektro buller. PCA tillåter separation av dessa faktorer så att man kan isolera de önskade komponenterna (DA och pH) och ta bort ytterligare komponenter som kan snedvrida de önskade signalerna (för en mer detaljerad beskrivning, se 15, 16).- Tilldela en kalibreringsfaktor till the utström (ca 5-10 nA / | iM) efter PCA att medge koncentrationsvärdena för de analyter som skall bestämmas.
- Använd övningsuppsättningen som erhållits under ett experiment för att "träna" PCA-modellen för att separera ut DA, pH och andra faktorer. PCA tar utbildning som cykliska voltammogram (samlas i avsnitt 3.1.8) och bestämmer vilka väsentliga egenskaper hos voltammogrammet kan användas för att identifiera varje insamlad under in vivo voltammetri inspelningar analyt.
- För att bestämma antalet huvudkomponenter för att hålla, använda en Malinowski F-test. Typiskt håller endast två eller tre huvudsakliga komponenter som normalt förklara ca 95-99% av variansen i dessa data. För ytterligare diskussion om genomförandet av Malinowski F-testet, se 17.
Obs! När antalet komponenter bestäms, PCA-analys på ett effektivt sätt kommer att projicera de uppmätta voltammogram från DA och pH utbildning sätter in de viktigaste komponenter som kommer att behållas.Resultatet är en datamängd som har filtrerats så att endast uppgifter DA (eller pH) kvarstår och den återstående data som inte liknar DA eller pH avlägsnas (se Representativa resultat för förväntad produktion). För en mer detaljerad förklaring och steg för steg instruktioner för att använda PCA för voltametrisk analys se Material ark och 16, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FSCV kombinerat med intraoral kateter implantation användes för att undersöka hur sackaros, en appetitive tastant, modulerar phasic DA release i NAC kärna. Före tastant infusion, elektrisk stimulering (150 iA, 60 Hz, 24 pulser, som indikeras av den röda stapeln) i VTA ger robusta ökningar i phasic DA release i NAC (Figur 1) Figur 1 visar en färg tomt med potential på. y-axeln, tid på x-axeln, och ström (representerade som falsk färg) på z-axeln. Nedanför färg tomten är DA koncentration kontra tidskurva. Koncentration mot tid bestämdes med användning av nuvarande kontra tidskurva vid oxidationspotentialen för dopamin (anges med streckad vit linje), som omvandlades till koncentration, efter efter kalibrering av elektroden. Detta DA koncentration kontra tidskurva användes som en del av utbildningen som fastställts för partnerskaps- och samarbetsavtalet.
Efter träningsmängden förvärvades, 25 infusioner av sackaros(10%, 200 pl per infusion) gavs varje 1-3 min. Exempel på sackaros modulering av phasic DA frisättning visas i figurerna 2 och 3. I fig 2, den 6,5 sek infusionen (indikeras av den röda bar) gav en ökning av ström (som indikeras av den vita, nedåt vänd pil) vid oxidationspotentialen DA (indikeras av den vita streckad linje). Att omvandla data till en koncentration mot tiden tomt efter PCA kontrollerat att den ökade strömmen i svaren på tastant är resultatet av en ökning i DA koncentration. En annan tastant, mentol (0,005%, 200 pl per infusion) var också infuseras under FSCV inspelningar i NAC kärna. Figur 3 visar DA koncentration-tids exempel skrivs för intraoral sackaros och mentol, avslöjar ökade DA koncentration efter infusion av antingen tastant . Man bör förvänta sig att se några rättegång till rättegång variabilitet i phasic DA utsläpp till tastants (Figur 2 och 3A). Men vi normalt inte ser några icke-specifika tendenser till en ökning eller minskning av phasic DA frisättning över flera studier. Intervall 10-100 nM DA kan förvänta sig av ett typiskt experiment i ett enda djur.
Figur 1. Representant färg plot (överst) och koncentration mot tiden plot (botten) av elektriskt framkallade DA release i NAC kärna. Röd bar visar stimuleringstiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representant färg plot (överst) och DA koncentration kontra tidskurva (botten) under en enda infusion av sackaros. Red Bar indikerar 6,5 sek infusion. Vit nedåt pilen riktad anger i höjden i nuvarande (representerad i falsk färg) på oxidationspotentialen för DA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representant DA koncentration kontra tid spår under (A) 10% sackaros och (B) 0,005% mentol av intraoral administrering. Röd stapel visar 6,5 sek intraorala infusion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intraoral tastant leverans i kombination med FSCV medger analys av "realtid" DA svar på muntliga smakämnen. Det finns tre viktiga steg i det protokoll som krävs för framgångsrika DA mätningar. För det första är korrekt implantation av det muntliga kateter avgörande för leverans av smakämnen. Att se till att katetern är införd bakom första molar och kilas fast förhindrar katetern från att förlora öppenhet och förhindrar oavsiktlig borttagning av djuret. Spolning av katetern under de första dagarna efter återvinning är också viktig, eftersom den mjuka maten ges till djuret under de första två eller tre dagar efter operationen kunde täppa till katetern. För det andra, är kvaliteten hos elektroden kritiskt för att öka signal-till-brusförhållandet i ett fritt rörliga råtta. I vissa fall, till elektroder som visuellt verkar vara av hög kvalitet och god kondition kan ändå ge brusiga signaler. Ett sätt att felsöka detta problem är att ta utgångs inspelningar i dorsal striatum (4 mm under dura). Om elektroden producerar alltför mycket buller, kan elektroden avlägsnas och ersättas med en ny elektrod före utförandet av experiment i NAc kärninspelningsstället (6-7 mm under dura). Ett tredje viktigt steg är att hitta en lämplig inspelningsplats i den riktade hjärnregion, där spontana DA släpp händelser ("transienter") observerades vid en tillräckligt ofta (minst 1 per minut) med tillräckliga ökningar i DA koncentration (åtminstone 20 nM till 40 nM). Denna optimering kommer att säkerställa att spontana phasic DA släpp händelser kan detekteras vid viss plats, före smak administration. Sänkning av elektroden i steg som motsvarar storleken av den exponerade kolfiber (50-100 | im) maximerar chanserna att hitta ett inspelningsplatsen med detekterbara transienter.
En viktig nackdel med FSCV är oförmågan att bestämma absolut analytkoncentration vid en tidpunkt, eftersom FSCV är en differential teknik som mäter relativa förändringar koncentrations (jämfört med en stabil baslinje) under varje voltametri inspelningsfil. Men differential teknik möjliggör också för kvantifiering av under andra svängningar i dopaminkoncentrationen som svar på både givande och aversiva tastants 5. I samband med nikotinberoende, tobaksvaror tillsatser, såsom mentol och muntliga sötningsmedel, har visat sig påverka rökvanorna 18 och har nyligen förbjudits i cigaretter (med undantag för mentol) av familjen Rökning förebyggande och tobakskontroll Act. Således ger intraoralt leverans i kombination med FSCV ett viktigt metodverktyg som kan användas för att undersöka hur tobaksproduktsmakämnen kan förändra DA signalering, och potentiellt de förstärkande egenskaperna hos nikotin.
Här har vi beskrivit metoden att kombinera intraoral tastant infusion med FSCV i syfte att mäta phasic DAsläpp som svar på primära tastant stimuli. Det är viktigt att notera att även om vår teknik möjliggör undersökning av phasic DA utsläpp till tastants oberoende av åtgärd eller val, är det också möjligt att den oväntade karaktär tastant leverans skulle kunna påverka phasic DA frisättning 19. Således, en ordentlig kontroll lösning, såsom vatten eller konstgjord saliv, kan användas i kontrollexperiment för att jämföra och undersöka effekterna av en oväntad belöning eller stimulans på phasic DA frisättning oberoende av tastant av intresse. Emellertid är tekniken inte begränsad till antingen mätningar av DA-frisättning eller belöning. Till exempel har tidigare arbete undersökt noradrenalin frisättning under både belöning och aversion 20. Eftersom djur inte lätt förbrukar aversiva tastants intraoral tastant infusion med FSCV är den enda teknik som finns för att mäta phasic DA utsläpp till aversiva tastants. Men denna teknik inte avgöra om en tastant är aversiv eller enppetitive snarare mäter helt enkelt DA frisättning under förbrukning av tastant. För att bestämma det hedoniska värdet av en tastant, kan beteendetester införlivas för att observera orofacial responser under smak reaktivitet (såsom beskrivs på annan plats 5, 21).
Det bör också noteras att FSCV är även lämplig för att mäta andra viktiga neurochemicals, såsom serotonin 22 och syre 23, men metoder för registrering av dessa analyter i vaken, fritt rörliga djur finns ännu inte tillgängliga. Dessutom, med den kombinerade voltammetri och infusionsmetod intraoral, tids låst dopamin svar på tastant leverans kan analyseras i avsaknad av andra beteenden, såsom tillvägagångssätt beteende eller mat hämtning, som också skulle kunna påverka DA release. Som en tilläggsansökan, kan kombineras intraoral tastant leverans och FSCV vara perfekt för att mäta DA signalering till givande eller aversiva händelser under operant eller pavlovsk conditioning. Faktum är att en nyligen JUPITER publicering av Levy och kollegor kombinerar tastant leverans intraoral med operant beteende för att bestämma huruvida intraorala tastants stödja förvärv och underhåll av operant självadministrering beteende 24. Således kan sådana metoder också kombineras med FSCV att identifiera phasic DA svar på muntliga tastants under uppförande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| Cannula for electrode | BioAnalytical Systems | MD-2251 | |
| Glass capillary | A-M systems | 624503 | |
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
DS4 | |
| Heat shrink | 3M | FP-301 | |
| Insulated wires for electrodes | Squires electronics | Custom | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| Micromanipulator | Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop | ||
| Epoxy | ITW Devcon | 14250 | "5 minute epoxy" |
| Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene | Ion Power | LQ-1105 | i.e., Nafion |
| Silver paint | GC Electronics | 22-023 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Tubing for intra-oral catheters | Intramedic | 427426 | PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm |
| Tubing for intra-oral infusion | Fischer Scientific | 02-587-1A | I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| Syringe pump for flow cell | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| Surgical cement | Dentsply Caulk | 675571 and 675572 | |
| Air actuator | VICI | A60 | 6 position digital valve interface |
| Digital valve interface | VICI | DVI | 230 VAC |
| Quad headstage | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Power supply for tastant syringe pump | Med Associates | SG-504 | |
| Tastant syringe pump | Med Associates | PHM-107 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium chlroide | Sigma | S7653 | |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | |
| Hydrochloric acid (4 M) | Sigma | 54435 | |
| Soidum hydroxide | Sigma | 306576 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | H8502 | |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | Must request software: click here for link to software request page |
References
- Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
- Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
- Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
- Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
- Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
- Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
- Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
- Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
- Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
- Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
- Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
- Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
- Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
- Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
- Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
- Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
- Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
- Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
- Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).
