Protocol
Alle forsøkene ble gjennomført i henhold til National Institutes of Health (NIH) Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av Yale University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1) Pre-kirurgiske Forberedelser
- Mikstur forberedelse
- Lag oppløsninger av 10% sukrose og 0,005% L-mentol i deionisert vann (pH 7,4). Lagre disse løsningene i lukkede beholdere, på RT, og remake hver 2. uke, for å hindre nedbrytning.
- Løsninger elektrode kalibrerings
- Gjør Tris-buffer (pH 7,4) til enhver tid før kalibrering. Løsningen består av 12,0 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,20 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM MgCl2, og 2,00 mM Na 2 SO 4.
- Lag en stamløsning av 10 mM dopamin (DA, dopamin hydroklorid) i 0,1 M perklorsyre. Den perklorsyre bidrar til å hindre oksidasjon av dopamine. Oppbevar denne stamløsning ved -20 ° C og bruke for inntil 6 måneder. Lag flere prøver av DA stamløsning for lagring til å bruke hver prøve bare en gang.
- Fra 10 mM DA lager, fortynnede løsninger i Tris-buffer til konsentrasjoner på 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, og 31.25 nM.
- For pH-kalibrering, fremstille oppløsninger av Tris-buffer med pH på 7,2, 7,3, 7,5, og 7,6. Dette vil gi løsninger som etterligner pH skift som kan oppstå under in vivo forsøket.
- Elektrode fabrikasjon
- Ved vakuum-sug, aspirere en T-650 karbon-fiber (7 mikrometer i diameter) inn i et borsilikatglass kapillær (lengde 10 mm, utvendig diameter 0,6 mm, indre diameter 0,4 mm).
- Plasser glasskapillar fylt med carbon fiber inn i en vertikal elektrode avtrekker. For første parametere, sette ovnen til 55,0 og slå av magnet. Imidlertid kan ytterligere optimalisering være nødvendig som både varmer og magnetiske innstillingene varierer from lab til lab.
Merk: Elektroden bør være minst 5,5 cm lange (inkludert taper), slik at det lett kan passe inn mikromanipluatoren og settes inn minst 6,9 mm under dura i rottehjerne. Hvis elektroden er for kort, vil opptak fra ventral parti av nucleus accumbens ikke være oppnåelig. På den annen side bør den totale elektrodelengden ikke overstige 6,5 cm ellers vil være for lang til å passe inn i mikromanipulator. - Ved hjelp av et lysmikroskop, skjæres den eksponerte karbon-fiber, slik at den strekker seg 75 til 100 mikrometer forbi enden av glasset. Kontroller at elektrode har et svært stramt, knapt merkbar, forsegling mellom glasselektrode og karbonfiber, noe som vil gi minimal støy under påfølgende opptak. Kast den elektrode hvis det er noen merkbare sprekker i glasset eller dersom forseglingen er løst, noe som er en indikasjon på en dårlig tetning. For mer detaljerte instruksjoner kan du se [12] og [13].
- Montering av elektroden i micromanipulator
- Skaff et tre i, 30G ledning som er isolert langs halve lengden av ledningen og bruke en liten børste for å påføre et tynt lag sølvmaling direkte til ledningen. Umiddelbart etter påføring av sølvmaling, setter ledningen inn i hullet på toppen av elektroden for å tilveiebringe en fysisk og elektrisk forbindelse med karbonfiber. Under et mikroskop, sørge for at sølv wire kommer i kontakt med karbonfiber.
- Fest sølvtråd og elektroden til mikromanipluatoren ved hjelp av varme krympe.
- Plasser fremstilt karbonfiber elektroden i renset isopropylalkohol (IPA) i minst 10 min for å rense elektrodeoverflaten, og for å øke følsomheten for påfølgende dopamin. Etter bløtlegging i IPA, skyll karbonfiber med vann fra springen for å fjerne IPA.
- Referanseelektrode fabrikasjon
- Ta en 13 mm sølvtråd som inneholder en ca 6 mm Ag / Ag Cl mesh (7 mm sølv wire alene, 6 mm mesh, 0,4 mm diameter),kutte sølv parti ned til omtrent halvparten av sin opprinnelige lengde og lodde sølv del av tråden til en gull pin.
- Påfør epoxy over lodde på pinnen.
- Dypp Ag / Ag Cl mesh enden til en kopolymer av 5% polytetrafluoretylen og perfluor-3,6-dioksa-4-metyl-7octene-sulfonsyre 5 ganger, med 30 min luft tørkeperioder mellom hver neddykking.
- La belagt Ag / Ag Cl mesh lufttørke O / N.
- Cure i ovnen ved 120 ºC i 1 time.
2) Kombinert Intraoral kirurgi og Intrakraniell Kanylering Surgery (ca. 75 min)
- Oral kateter fabrikasjon
- Gjør den muntlige kateteret, og sterilisere med etylenoksid sterilisering, minst 10 dager før operasjonen.
- Kutt PE 100 rør inn 6 cm lange segmenter.
- Ved hjelp av en loddebolt, smelte den ene enden av PE-rør og straks trykker mot en fast overflate for å kjøle den PE-rør. Resultatet bør oppretteen liten, flat plate i den ene ende av PE-rør og bør ikke bli flenset. Bruk en nål (18 G) eller push pin for å lage et hull i midten av denne platen.
- På den andre enden av PE-rør, tett sette den butte enden av en 18 G nål inn i røret.
- Ved hjelp av en standard papirhullemaskin, punch flere sirkulære biter av en polytetrafluoretylen ark (3,18 mm tykke, 6 mm i diameter) til å lage polytetrafluoretylen skiver.
- Lag et hull i midten av skiven. Ta kanylen til PE rør og skyv den helt gjennom vaskemaskinen. Når nålen er gjennom, skyver vaskemaskinen til bunnen av PE rør slik at den er i flukt mot skiven.
- Oral kirurgi
- Etter sterilisering av kirurgiske instrumenter, kanylen (trimmet til 2,5 mm under understellet før sterilisering) og referanseelektroden, bedøve rotten med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg).
- After 5 min, gjelder en skadelig stimulus test (fot eller hale knipe) å vurdere nivået av anestesi. Dersom emnet viser noen fysiske reaksjon på skadelige stimuli test (vike respons, økning i luftveiene eller puls), gi en ketamin økning på 10% til 15% av den opprinnelige dosen og gjenta skadelige stimuli protokollen ovenfor.
- Etter rotte er fullt bedøvet og viser ingen reaksjon på skadelige stimuli test, bruker animalske hårklippe å barbere rotte pels fra øynene til ca 2 mm bak ørene. Deretter plasserer rotta på en tynn vannresirkuleringsvarmepute for å opprettholde kroppstemperaturen under operasjonen. Påfør øye smøremiddel. Administreres den ikke-steroide anti-inflammatoriske (NSAID) medikament, karprofen (5 mg / kg), ved intraperitoneal injeksjon før utfører noen snitt og før innføring intraorale kanyler. Bruk aseptisk teknikk til alle tider.
- Påfør betadine etterfulgt av 70% etanol for å rense huden. Dette gjentas 3 ganger.
- Place rotta på ryggen og åpne munnen ved hjelp av en steril bomullspinne. Finn den første øvre molar.
- Sett nålen inn i vevet mellom kinnet og den første øvre molar inntil nålen kommer ut like bak og mediale til ørene.
- Pierce nålen gjennom huden til PE slangen kommer ut av huden og er tilgjengelig.
- Trekk opp på kanylen (gripes av kanylen i seg selv og ikke nålen) og sikre den polytetrafluoretylen skiven til jekslene, slik at kateteret forblir på plass.
Merk: Kutte vaskemaskinen inn i en trapes form og sikre den mot jekslene med den flate siden vendt kinnet gjør dette trinnet enklere. - Ta en annen polytetrafluoretylen vaskemaskin og skyv den over eksponert nål ned plastrør, og ligge an mot snittet.
- For å sikre polytetrafluoretylen vaskemaskin, bruker sterilisert tape for å lage en trekantet "flagg", slik at vaskemaskinen ikke glir opp. Sikre vaskeer mot rotte hud og sterilisert tape.
- Kutt utsettes kateteret for å tillate 2-4 cm av røret som skal eksponeres ovenfor rotte hode.
- Gjenta trinn 2.2.1 gjennom 2.2.10 for den andre siden av munnen.
- Etter sterilisering av kirurgiske instrumenter, kanylen (trimmet til 2,5 mm under understellet før sterilisering) og referanseelektroden, bedøve rotten med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg).
- Intrakraniell kirurgi for voltammetry
- Plasser rotte i stereotaxic ramme og rense dyrets hodebunnen ved hjelp av en totrinns scrub (en betadine skrubb etterfulgt av en 70% etanol skrubbe, utføre med en 3 syklus repetisjon).
- Bruk sterilisert nål nese pinsett og kirurgisk saks til å klippe bort en 15 x 15 mm i hodebunnen vev.
- Tørke forsiktig av overflaten av skallen bruker steriliserte bomull tippe applikatorer. Videre rengjøres skallen ved å anvende 2 til 3 dråper av 3% -ig hydrogenperoksyd.
- Bruk en stereotaksisk drill for å gjøre tre små (mm diameter 1) hull i skallen for senere innsetting av skruer, 1 hull for guiden kanyle, 1 hull for stimulerende elektrode og en hull for referanse utvalgtered.
- For opptak i NAc kjerne, plasser guide kanyle på 1,2 mm anterior og 1,4 mm lateralt for Bregma. Senk kanyle-apparat inntil plastbasis er i flukt med hodeskallen.
- Plasser sterilisert referanseelektrode i halvkule kontralateral til guiden kanyle. Senk referansen ca 2 mm under dura.
- Plasser stimulerende elektrode på 5,2 mm posterior og 1,0 mm lateralt for Bregma og senkes 8,0 mm under dura å målrette ventral tegmentale området (VTA).
- Bruk en sterilisert lite kirurgisk skrutrekker for å feste skruene til skallen. Deretter setter du inn referanseelektrode, stimulerende elektrode, og veilede kanyle. Endelig sikre alle komponentene ved hjelp cranioplastic sement.
- For de første 48 timene av postoperativ behandling, administrere non-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID) Carprofen ved subkutan injeksjon (5 mg / kg). La det være minst en uke for komplett kirurgisk utvinning før gjennomføring voltammetry opptak.
- Ved postoperativ omsorg, flush muntlige katetre daglig med vann. Gir mat mettet i vann i to dager for å hjelpe til dyret tygger, og spising. Gi daglig overvåking for potensielle tegn på stress av smerte (på grunn av mild infeksjon eller dehydrering) og gi hensiktsmessige tiltak som er nødvendige (inkludert administrasjon av væsker, lokal administrasjon av antiseptiske midler, og eller NSAID Carprofen administrasjon på 5 mg / kg).
3) voltammetriske Recordings i Awake, fritt bevegelige Rat
- Senking av elektroden og anskaffe et DA treningssett.
- På dagen for forsøket, sjekk åpenheten til den muntlige kanylen ved infusjonen 200 ul vann og observere Orofacial svar (for å verifisere at rotta er smaker vannet).
- Fest FSCV heads å rotte ved å sette inn stimulerende elektrode (på heads) inn i bipolar stimulerende elektrode cannula (på rotter). Således kan heads (miniatyrisert strøm-til-spenningsomformer) kan kobles direkte til den bipolare stimulerende elektrode.
- Fjern dummy kanylen fra kanylen anordning og anvende to dråper 50% heparinløsning i kanylen. Deretter setter forsiktig en dummy kanyle (litt lenger enn den dummy kanylen som tidligere ble fjernet) for å fjerne eventuelle blodpropp eller glial arrdannelse som kan ha skjedd, noe som vil bryte karbonfiber elektroder som senere vil bli satt under forsøket. Forleng kanyle brukes til rydding propper 3-4 mm under skallen (minst 2 mm over innspillingen stedet).
- Sett mikromanipluatoren, med elektrode, inn i føringen kanyle og plasser omega ringen i en "låst" posisjon.
- Koble referanseelektrode ledningen fra heads til riktig pin. Koble deretter jobbe elektrodeledningen fra mikromanipluatoren til den aktuelle ledningen på heads.
- Senk elecroden til ca 4-4,5 mm under skallen.
- Bruk en potentiostat å bruke en trekantet bølgeform (400 V / s, -0,4 til 1,3 V). Påfør bølgeformen til elektroden ved 60 Hz i minst 10 min, deretter endre bølgeformen søknaden frekvensen til 10 Hz for påfølgende eksperimentelle opptak.
Merk: 60 Hz-kurven søknad trinn gir et stabilt karbonfiber overflate, og vil bidra til å forhindre elektrisk drift - Anvende elektrisk stimulering til VTA ved hjelp av forskjellige frekvenser (10-60 Hz) pulser (10 til 30 pulser) og strømmer (50 til 150 uA), alle med en pulsbredde på 2 ms / fase, for å fremkalle forskjellige konsentrasjoner av DA frigjøring og pH- skift. Anskaffe minst fem forskjellige konsentrasjoner av DA utgivelsen og fem forskjellige pH skift. Vent (2 - 3 min minimum) mellom stimuleringer for å tillate vesicular omlasting [14].
Merk: Det er viktig å få stimulations som produserer DA konsentrasjoner over hele området som vil bli samlet under den påfølgendeeksperiment, siden de vil bli brukt som et treningssett for Principal Component Analysis (se punkt 5.1). - Senk elektroden i NAc kjernen (6,3 mm ventral å dura). Deretter senkes elektroden 100 mikrometer trinn innenfor NAc kjernen til forbigående DA frigjørings hendelser er observert ved frekvenser på minst 1 pr min.
- Koble rør (indre diameter 1/32 ", ytre diameter 3/32") til en 20 ml sprøyte, knyttet til en sprøytepumpe. På den andre enden av røret ved å bruke en 23 G nål avfaset for å koble røret til rotte kanyle. Sørg for at slangen er fylt helt med ønsket tastant og kontrollere at ingen bobler eksisterer i slangen.
Merk: Vanligvis administrere en liten mengde av tastant inn i munningen av rotte før opptaket for å sikre at den første infusjon for opptak leverer hele infusjonen mengden og ikke noe gjenværende vann eller luft i slangen. Videre tillater dette dyret å ha noen tidligere erfaring viddh den tastant siden romanen tastants, selv appetitive seg, kan være motvilje i utgangspunktet på grunn av sin nyhet. - For datainnsamling, sette mot 200 ul tastant (6,5 sek ved hjelp av en pumpe og tidligere beskrevet tubing). Sette mot tastant hver 1-3 min. Sette mot i alt 25 ganger per tastant. Hver infusjon leverer 200 ul løsning.
- Hvis flere tastants blir levert i et enkelt eksperiment, skylle den muntlige kateter med vann etter å samle data for en tastant og vent i minst 20 min før infusjonen den nye tastant.
- Etter DA innspillingen, forberede for histologisk verifisering ved å lage en liten lesjon på opptaket nettstedet. For å bevare karbonfiber elektrode for påfølgende kalibrering, først trekke elektroden og fjerne mikromanipluatoren. Deretter bruker du en ny micromanipulator med et glass microelectrode og wolfram ledning (utvide 100 mikrometer utover glasset spissen) til samme dybde (under dura) som den opprinnelige karbon fIber microelectrode.
- For histologisk verifisering, lage en liten lesjon ved å bruke 3 V på wolfram wire og øke spenningen på trinn 1 V, hvert 10 sek, inntil 10 V er utløpt.
- Hvis en standard konsentrasjonskurven allerede er opprettet ved hjelp av flere karbonfiber elektroder, utføre lesjonen trinnet ovenfor (3.1.14) ved å påføre den potensielle direkte karbon fiber elektroden.
Merk: Denne lesjon metoden vil skade karbonfiber og forhindre påfølgende kalibrering med det bestemte elektroden. - Avlive dyret ved hjelp av en dødelig injeksjon pentobarbital (150 mg / kg, ip).
- Løsne headcap med kanyler med tang ved å dra direkte oppover på headcap. Ikke vri headcap siden dette vil føre til unødig skade på hjernen og gjør det utfordrende å identifisere plasseringen av elektroden under histologi.
- Fjern hjernen og plasser i 4% formalin i 3 dager etterfulgt av 30% suCrose for 1 uke. Lag 30 mikrometer skiver med en kryostat, montere på dekkglass og undersøke skiver under et lysmikroskop å identifisere plasseringen av karbonfiber eller wolfram lesjon.
Merk: Perfusjons er valgfritt for 3.1.17.
- Fjern hjernen og plasser i 4% formalin i 3 dager etterfulgt av 30% suCrose for 1 uke. Lag 30 mikrometer skiver med en kryostat, montere på dekkglass og undersøke skiver under et lysmikroskop å identifisere plasseringen av karbonfiber eller wolfram lesjon.
4) elektrode Kalibrering
- Ved hjelp av strømningscellen for å skape en strøm-konsentrasjonsomregningsfaktor.
- For å bestemme elektrode følsomhet, kalibreres elektrodene etter hvert forsøk ved bruk av en strømnings "T-celle" apparat. Senk elektroden inn i "T-celle" mens Tris buffer, pH oppløsninger, eller DA oppløsninger vaskes over elektrodeoverflaten (ved en hastighet på 2 ml / min). Bruk en seksposisjon luft solenoidaktuatoren å bytte frem og tilbake mellom buffer og pH eller DA løsning.
- For hver kalibrering, samle voltammetriske data under 5 sek anvendelse av Tris-buffer (baseline) etterfulgt av 5 sek anvendelse av pH eller DA-løsning, etterfulgt av en 20 sekPROGRAM av Tris-buffer (30 sek total fil). Gjenta hver kjøring tre ganger for hver kalibrerings standard konsentrasjon, avbalansering mellom ulike konsentrasjoner av hver standard.
- For hver prøvetaking, måling av topp DA eller pH-fremkalt strøm. Gjennomsnittlig peak strøm over hvert forsøk for å oppnå en konsentrasjon versus peak nåværende forhold. For mer detaljerte instruksjoner kan du se [12] og [13].
5) Data Analysis
- Ved hjelp av et treningssett i prinsipal komponent analyse (PCA)
Merk: Under en voltammetry eksperiment, blir produsert som utgangsstrøm, noe som er et resultat av dopamin oksidasjon og reduksjon, pH-skift, og elektrokjemisk støy. PCA tillater separasjon av disse faktorene, slik at man kan isolere de ønskede komponenter (DA og pH) og fjerne tilleggskomponenter som kan forvrenge de ønskede signaler (for en mer detaljert beskrivelse, se 15, 16).- Tildele en kalibreringsfaktor til the utgangsstrøm (ca. 5 til 10 nA / iM) etter PCA å tillate konsentrasjonsverdier av analyttene som skal bestemmes.
- Bruke treningssettet innhentet i et eksperiment for å "trene" PCA-modell for å skille ut DA, pH og andre faktorer. PCA tar treningen satt sykliske voltammograms (samlet i avsnitt 3.1.8) og bestemmer hvilke viktige egenskaper ved voltammogram kan brukes til å identifisere hver analytt samlet under in vivo voltametri innspillinger.
- For å bestemme antall hovedkomponenter for å holde, bruke en Malinowski F-test. Vanligvis holder bare to eller tre hovedkomponenter, som normalt forklarer omtrent 95-99% av variansen i dataene. For ytterligere diskusjon om implementering av Malinowski F-test, se 17.
Merk: Når antallet komponenter bestemmes, PCA analyse effektivt vil projisere de målte voltammograms fra DA og pH trening setter inn de viktigste komponentene som har blitt beholdt.Resultatet er et datasett som er filtrert slik at bare DA (eller pH) data igjen, og den gjenværende data som ikke er identisk med DA eller pH blir fjernet (se Representative resultater for forventede utgang). For ytterligere detaljert forklaring og trinnvis instruksjon for bruk av PCA for voltametrisk analyse se Materialer ark og 16, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FSCV kombinert med intraoral kateter implantering ble brukt til å undersøke hvordan sukrose, en appetitive tastant, modulerer phasic DA utgivelse i NAc kjernen. Før tastant infusjon, elektrisk stimulering (150 uA, 60 Hz, 24 pulser, fremgår av den røde linjen) av VTA produserer robuste økninger i phasic DA utgivelse i NAC (figur 1) Figur 1 viser en farge tomt med potensiale på. y-aksen, tiden på x-aksen, og strøm (representert som falske farger) på z-aksen. Nedenfor fargen tomten er DA konsentrasjons spor. Konsentrasjonen som funksjon av tiden ble bestemt ved bruk av strøm som funksjon av tid trase ved oksydasjonspotensialet av dopamin (antydet med stiplet hvit linje) som ble omdannet til konsentrasjon, etter post-kalibrering av elektroden. Dette DA konsentrasjons trase ble brukt som en del av treningssettet for PCA.
Etter treningssettet ble kjøpt, 25 infusjoner av sukrose(10%, 200 ul pr infusjon) ble gitt hver 1-3 min. Eksempler på sukrose modulering av DA fasisk frigjørings er vist i figurene 2 og 3. I figur 2 er den 6,5 sek infusjon (angitt med rød bar) produserte en økning i strømmen (indikert med hvite, nedadvendt pil) ved oksydasjonspotensialet av DA (angitt med hvite stiplet linje). Transformasjon av dataene i en konsentrasjon som funksjon av tid plottet etter PCA bekreftet at den økte strømmen i respons til tastant er et resultat av en økning i DA-konsentrasjon. En annen tastant, mentol (0,005%, 200 mL per infusjon) ble også tilført under FSCV opptak i NAc kjernen. Figur 3 viser DA konsentrasjons eksempel spor for intra-oral sukrose og mentol, avslører økt DA konsentrasjonen etter infusjon av enten tastant . Man bør forvente å se en del prøving for retten variasjon i phasic DA utslipp til tastants (figur 2 og 3A). Men vi vanligvis ikke ser noen uspesifikke trender mot en økning eller reduksjon i phasic DA utgivelsen over flere studier. Spenner 10-100 nM DA kan forventes i et typisk forsøk i et enkelt dyr.
Figur 1. Representant fargeflekk (øverst) og konsentrasjons tomten (nederst) av elektrisk fremkalt DA utgivelse i NAc kjernen. Red bar indikerer stimulering tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative fargeflekk (øverst) og DA konsentrasjons spor (nederst) i løpet av en enkelt infusjon av sukrose. Red Bar indikerer 6.5 sek infusjon. Hvit nedadvendt pil indikerer i høyde i dagens (representert i falske farger) ved oksidasjon potensialet i DA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representant DA konsentrasjon versus tidstraser under (A) 10% sukrose og (B) 0,005% mentol av intraoral administrasjon. Red bar indikerer 6,5 sek intraorale infusjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intraoral tastant levering kombinert med FSCV tillater analyse av "real-time" da svar på muntlige smaksstoffer. Det er tre viktige skritt i protokollen som er nødvendig for vellykkede DA målinger. For det første er passende implantering av kateteret oral kritisk for avgivelse av smaksstoffer. Sikre at kateteret er innført bak den første molar og kilt på plass hindrer kateteret fra å miste åpenhet og forhindrer utilsiktet fjerning av dyret. Spyling av kateteret i løpet av de første dagene etter utvinning er også viktig, fordi den myke mat gitt til dyret i løpet av de første 2 eller 3 dager etter kirurgi kan tette kateteret. For det andre, er kvaliteten av elektroden kritisk for å øke signal-til-støy-forhold i et fritt bevegelige rotte. I noen tilfeller, for å elektroder som visuelt synes å være av høy kvalitet og god stand kan likevel gi støysignaler. En måte å feilsøke dette problemet er å ta baseline opptak i dØrsal striatum (4 mm under dura). Hvis elektroden produserer for mye støy, kan elektroden fjernes og erstattes med en ny elektrode før gjennomføring av eksperimentet i NAc kjernen registreringsstedet (6-7 mm under dura). En tredje viktig skritt er å finne en passende opptak beliggenhet i målrettet hjernen regionen, hvor spontane DA utslipp hendelser ("transienter") er observert på en tilstrekkelig frekvens (minst 1 per min) med tilstrekkelig økning i DA konsentrasjon (minst 20 nM til 40 nM). Dette optimalisering vil sikre at spontane phasic DA utslipp hendelser kan oppdages på bestemt sted, før smaks administrasjon. Senking av elektroden i intervaller som tilsvarer størrelsen på det eksponerte karbonfiber (50-100 um) maksimerer sannsynligheten for å finne en registreringsstedet med påvisbare transienter.
En viktig påminnelse av FSCV er manglende evne til å bestemme absolutte analyttkonsentrasjonen på et tidspunkt, siden FSCV er en difdifferensial teknikk som måler relative konsentrasjonsendringer (i forhold til en stabil basislinje) i løpet av hver voltammetri opptak fil. Imidlertid kan også den differensielle teknikk for kvantifisering av sub-andre variasjoner i dopaminkonsentrasjonen i respons til både givende og aversjons tastants 5. I sammenheng med nikotinavhengighet, tobakk produkt tilsetningsstoffer, for eksempel mentol og muntlig søtningsmidler, har vist seg å påvirke røykeatferd 18 og har nylig blitt forbudt i sigaretter (med unntak av mentol) av familien Smoking Prevention and Tobacco Control Act. Således, intraoral levering i kombinasjon med FSCV gir et viktig metodisk verktøy som kan brukes til å undersøke hvordan tobakkprodukt smaksstoffer kan endre DA signalisering, og eventuelt armerings egenskapene til nikotin.
Her har vi beskrevet en metode for å kombinere intraoral tastant infusjon med FSCV for det formål å måle fasisk DAslipp i respons til primær tastant stimuli. Det er viktig å merke seg at mens vår teknikken tillater undersøkelse av phasic DA utslipp til tastants uavhengig av handling eller valg, er det også mulig at det uventede natur tastant levering kunne påvirke phasic DA utgivelse 19. Dermed vil en passende kontrolloppløsning, slik som vann eller kunstig spytt, kan benyttes i kontrollforsøk for å sammenligne og å undersøke virkningene av en uventet belønning eller stimulans på fasisk DA frigjøring uavhengig av tastant av interesse. Imidlertid er teknikken ikke begrenset til enten målinger av DA utgivelse eller belønning. For eksempel har tidligere arbeidet undersøkt noradrenalin utgivelse under både belønning og aversjon 20. Siden dyrene ikke lett forbruke aversjons tastants intraoral tastant infusjon med FSCV er den eneste teknikken tilgjengelig for måling phasic DA utslipp til aversive tastants. Men dette betyr teknikken ikke avgjøre hvorvidt en tastant er aversive eller enppetitive snarere bare måler DA frigjøring under forbruket av tastant. For å bestemme verdien av en hedonisk tastant, adferdstester kan bli tatt med for å observere oro-facial signaler mens smak reaktivitet (som beskrevet andre steder 5, 21).
Det bør også bemerkes at FSCV er også egnet til å måle andre viktige neurochemicals, slik som serotonin 22 og oksygen 23, men fremgangsmåter for registrering av slike analytter i våkne, fritt bevegelige dyr er ennå ikke tilgjengelige. Videre med den kombinerte voltammetry og intra-oral infusjon metode, tids låst dopamin svar på tastant levering kan analyseres i fravær av annen atferd, som for eksempel tilnærming atferd eller mat gjenfinning, som kanskje også påvirke DA utgivelse. Som en ekstra søknad kan kombineres intraoral tastant levering og FSCV være ideelt for å måle DA signale å belønne eller aversive hendelser under operant eller Pavlovian conditioning. Faktisk en fersk Jove publikasjon av Levy og kolleger kombinerer intra-oral tastant med operant atferd levering for å fastslå om intra-oral tastants støtte anskaffelse og vedlikehold av operant selvadministrering atferd 24. Således kan slike metoder også kombineres med FSCV å identifisere fasisk DA respons på orale tastants under oppførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| Cannula for electrode | BioAnalytical Systems | MD-2251 | |
| Glass capillary | A-M systems | 624503 | |
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
DS4 | |
| Heat shrink | 3M | FP-301 | |
| Insulated wires for electrodes | Squires electronics | Custom | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| Micromanipulator | Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop | ||
| Epoxy | ITW Devcon | 14250 | "5 minute epoxy" |
| Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene | Ion Power | LQ-1105 | i.e., Nafion |
| Silver paint | GC Electronics | 22-023 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Tubing for intra-oral catheters | Intramedic | 427426 | PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm |
| Tubing for intra-oral infusion | Fischer Scientific | 02-587-1A | I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| Syringe pump for flow cell | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| Surgical cement | Dentsply Caulk | 675571 and 675572 | |
| Air actuator | VICI | A60 | 6 position digital valve interface |
| Digital valve interface | VICI | DVI | 230 VAC |
| Quad headstage | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Power supply for tastant syringe pump | Med Associates | SG-504 | |
| Tastant syringe pump | Med Associates | PHM-107 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium chlroide | Sigma | S7653 | |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | |
| Hydrochloric acid (4 M) | Sigma | 54435 | |
| Soidum hydroxide | Sigma | 306576 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | H8502 | |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | Must request software: click here for link to software request page |
References
- Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
- Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
- Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
- Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
- Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
- Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
- Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
- Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
- Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
- Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
- Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
- Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
- Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
- Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
- Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
- Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
- Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
- Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
- Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).
