Summary
ここでは、幼虫により摂取されたキトサン/干渉RNAナノ粒子の使用を通じて疾病媒介蚊で遺伝子機能を阻害するための手順を記述している。
Abstract
媒介蚊は、他の生物よりも多くの人的被害を与える-と百万人以上の人毎年殺す。蚊のゲノムプロジェクトは、プライマリアフリカのマラリアベクトルハマダラカとデング熱や黄熱病ベクトルネッタイシマカにおける機能遺伝子研究を含め、蚊の生物学の新しいファセットの研究を促進した。電波妨害RNA（RNAiを）媒介遺伝子サイレンシングは、これらの疾患の媒介蚊の種の両方において、目的の遺伝子を標的とするために使用されてきた。ここでは、食物と一緒にし、幼虫により摂取されたキトサン/干渉RNAナノ粒子の調製のための手順を記載している。長い二本鎖RNA（dsRNA）または低分子干渉RNA（siRNA）分子と互換性があり、この技術的に簡単で、高スループット、比較的安価な方法は、Aの異なるいくつかの遺伝子のノックダウンの成功のために使用されているハマダラカとA.ネッタイシマカ幼虫。定量RT-PCRを介して、またはin situハイブリダイゼーションで確認された幼虫授乳、ノックダウン、続いて、少なくとも後半蛹を通 じて持続することができます。この方法は、農業害虫、並びに他の非モデル生物を含む蚊および他の昆虫種の多種多様に適用可能である。研究室でのその有用性に加えて、将来、キトサン、安価な、非毒性および生分解性ポリマー中に、潜在的な分野で利用することができる。
Introduction
ハマダラカとAedine属の血液供給の媒介蚊は、人類の最悪の災いのいくつかの責任病気の原因となる物質を伝達する。推定34億の人々が毎年世界中でオーバーワン50万人の死亡の原因であるマラリアを、縮小するための危険にさらされている。 マラリア原虫属による感染からマラリアの結果。主要なアフリカのベクトルハマダラカ （含むハマダラカ属の感染した蚊の刺さを通じて人々に送信され、寄生虫、 http://www.who.int/topics/malaria/en/ 、2014）1。 ネッタイシマカは、デング熱、世界で最も広範かつ重要なアルボウイルス疾患である非特異的な熱性疾患の原因となるデング熱ウイルス、の主要な蚊ベクトルである。デング熱ウイルスは毎年incidenで、現在熱帯> 25億人への脅威である毎年〜24000人が死亡（結果として約5000万例のCE http://www.cdc.gov/dengue/ 、2014）2。人の健康に蚊が媒介する病気の壊滅的な世界的な影響にもかかわらず、これらの疾患の予防及び治療の効果的な手段が不足している。モスキートコントロールは、現在、病気の予防の最善の方法です。
ベクトル昆虫の遺伝子操作によって節足動物媒介疾患を制御するための可能性は40年以上3認識されてきた。 A.のトランスジェニック系統抑制性女性特有飛べ表現型を有するように操作ネッタイシマカは、最近、トランスジェニックベクターコントロール戦略現実4-6を使用するための可能性を作った。これらの進歩は、ベクター対照と媒介蚊で遺伝子機能を操作するさらなる手段のための新規の遺伝子標的を同定するために研究者が挑戦してきた。遺伝子発現dの変質を雌飛べ蚊4でそうであったようにuring開発は、新規ベクトル制御戦略の解明を促進することができる。しかし、主として技術的な課題に、非常に少数の遺伝子の機能は、Aの開発中に特徴付けられているハマダラカ、ネッタイシマカ、または他の蚊の種。
C.年の発見以来エレガンス 7、動物、植物および微生物において保存されているRNA干渉（RNAi）は、広範囲の昆虫8,9を含む多種多様な生物において機能的な遺伝学的研究のために使用されてきた。 RNAi経路は、配列特異的干渉RNAとして機能する短い20-25ヌクレオチド長のsiRNAに切断する長いdsRNAダイサーによって開始される。転写産物のターンオーバー、切断、および翻訳9の破壊を促進することにより、配列が相補的であるsiRNAは沈黙遺伝子。 particulaをターゲットに長いdsRNA分子（通常は300〜600塩基対）、またはカスタムのsiRNArの配列は、目的の任意の遺伝子をサイレンシングするために研究室で使用することができる。干渉RNAが送達されたときに管理することにより、研究者は、遺伝子がサイレンシングを開始する時間を制御することができる。それは遺伝変異を有する株の生産やメンテナンス、すべての昆虫種ではまだ使用できません高価で労働集約的なプロセスを妨げることができるように、発達致死や無菌性などの課題を克服するために使用することができようにこの利点に便利です。 RNAiによる遺伝子サイレンシングの程度は、動物への遺伝子、組織、組織、および動物に遺伝子変化し得るが、RNAiは広く蚊や他の昆虫8,9における遺伝子の機能解析のために使用される。
三つの干渉RNA送達戦略は、蚊に使用されてきた：微量注入、浸漬/局所適用、経口摂取を。詳細な歴史と昆虫におけるこれらの3つの技術の利用の比較のために、ゆうら 8を参照してください。 Weは成功してAの発生遺伝子をターゲットとするsiRNAを送達する手段としてマイクロインジェクション10を使用していたネッタイシマカの胚、幼虫、蛹11-14。しかし、この労働集約的な配信戦略は、マイクロインジェクションのセットアップと熟練した手の両方を必要とします。また、マイクロインジェクションは、行動の表現型が評価される場合は特に、生物、交絡因子にストレスが多い。最後に、マイクロインジェクション送達は、ベクトル制御のためのフィールドを拡張することができない。それは便利であり、ほとんどの機器や労力を必要とする別の方法として、RNA溶液を干渉する生物を浸すことはまた、遺伝子サイレンシングを誘導する人気の手段となっている。浸漬は、主に昆虫細胞株に適用された8を研究が、最近の研究では、ノックダウンA.で達成されたネッタイシマカの幼虫は、動物が摂取するように思われたdsRNA 15の溶液に浸漬した。ただし、複数のエクスペリの分析を含む研究のためのL基または表現型は、浸漬はかなり高価である。ロペス·マルティネスら 16は、RNAi、干渉RNAを含む水の一滴と食塩水と水分補給で脱水を伴うRNAの配信を妨害するための新規のアプローチを駆動水分補給を説明した。このアプローチは、動物全体の浸漬に関連するコストを削減するが、マイクロインジェクションよりも高価であり、高い浸透圧に耐えることができる化学種への適用に限定されてもよいしない。また、浸漬、脱水/再水和の浸漬方法は、フィールド内のベクトル制御に適合させることができるか想像することは困難である。これらの理由から、後胚の研究のために、摂取した食物との干渉RNAの送達は実行可能な代替戦略です。
摂取ベースの戦略は、すべての昆虫種では動作しませんが、おそらく最も顕著キイロショウジョウバエ 、食品と混合したRNA干渉の経口送達は、遺伝子のSiを推進してきましたA.含む昆虫8,17、さまざまなlencing ネッタイシマカ大人18。私たちは、Aにキトサンナノ粒子媒介RNAiを説明したハマダラカ幼虫 19に成功A.における遺伝子発現の低減のためのこのアプローチを適用しているネッタイシマカの幼虫20,21。ここで、高分子キトサンによるRNA干渉の包括を伴うこのRNAiの手順、方法論は、詳細です。キトサン/干渉RNAナノ粒子は、キトサン中のアミノ基の正電荷とRNA 19干渉の主鎖にリン酸基により担持された負電荷間の静電力を介して干渉RNAとポリカチオンの自己集合により形成される。記載された手順は、長いdsRNA分子（以下のdsRNAとも呼ばれる）または二本鎖siRNA（以下のsiRNAと呼ばれる）の両方と互換性がある。以下の合成、キトサン/ RNAナノ粒子が幼虫食品と混合に配信される干渉経口摂取を通じて幼虫。この方法は、比較的安価であり、少ない設備および労力19を必要とし、行動20,21の解析を含む複数の表現型のハイスループット分析を容易にする。他の疾患ベクターおよび昆虫農業害虫を含む他の昆虫の遺伝子サイレンシング研究のために適合させることができるこの方法は、潜在的に他の種々の動物種における遺伝子サイレンシングのために使用することができる。また、キトサン、安価な、非毒性および生分解性ポリマー22は 、潜在的に種特異的な蚊の駆除のための分野において利用することができる。
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Protocol
1.蚊種と飼育
- A.を維持ハマダラカ G3 とA.ネッタイシマカリバプールIB12株（下の代表的研究に使用される）または関心のある他の株の標準実験室の練習にまたは以前に23,24説明したように従った。
2. dsRNAおよびsiRNAの設計と製造
- 設計プライマーは、関心対象の遺伝子に特異的な長いdsRNAテンプレートを構築した。 E-のRNAiツール25を使用してください。として選択または方法に従ってのdsRNA産生は、以前に19を記載した。
- 陰性対照のために、緑色蛍光タンパク質（GFP）、β-ガラクトシダーゼ（β-gal）、または蚊では発現されないいくつかの他の遺伝子の配列に対応するdsRNAが19を合成する。所望であれば、以下に要約する代表的な結果を生成するために利用dsRNAは19を陽性対照として使用することができる。ストアdsRNAは、-80℃で無RNAse水に溶解; C必要になるまで。
- あるいは、設計遺伝子特異的siRNA標準ラボ慣行または以前に記載10のようによれ。すべての蚊の遺伝子に対応していないネガティブコントロールsiRNAを設計するためにノックダウンsiRNAの配列をスクランブル。評判の良いベンダーの数を介して使用できますカスタムsiRNAを、購入してください。
- 所望であれば、以下に要約する代表的な結果を得るために用いたsiRNA 20,21は、陽性対照として使用することができる。必要になるまでストアsiRNAは、-80℃でRNaseフリー水に溶解した。
3. RNAナノ粒子干渉/キトサンの準備
- 既製のRT 100mMの硫酸ナトリウムを集める（脱イオンH 2 O中の100mMのNa 2 SO 4）、0.1 M酢酸ナトリウム（脱イオンH 2 O中の0.1 M NAC 2 H 3 O 2 -0.1 M酢酸、pH4.5）中バッファ。
- キトサンを溶解する（≥75％脱アセチル化された）は、0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液（w / v）の希釈標準溶液、0.02％を作るために、使用前にRTで溶液を維持する。
- H 2 Oの脱イオン50μl中のdsRNAまたはsiRNAを溶解し、50 mMの硫酸ナトリウム100μlのあたりのdsRNA / siRNAの32μgの100μlの溶液を作製するために100 mMの硫酸ナトリウムバッファーに追加します。
- のdsRNA / siRNA溶液にキトサン溶液100μlを加え、その後、1分間55℃の水浴中で混合物を加熱する。キトサン溶液の100μlに50 mMの硫酸ナトリウム100μlを加えることで制御を設定し、同じ手順に従います。
- ナノ粒子の形成を容易にするために、室温で、高速ボルテックスで30秒間、直ちに溶液を混合する。
- 遠心分離し、ペレットを表示するか、その時間後室温で10分間、13,000×gで混合。新しい1.5 mlチューブに上清を移し。蚊の食品を調製するために使用する前に室温で≈10分間、ペレットを空気乾燥。
- M上清に残ったのdsRNA / siRNAの総量を計算するために、ブランクとしてコントロール（3.5を参照）からの上清を使用して上清中のdsRNA / siRNAの濃度をeasure。のdsRNA / siRNAの出発量の差を使用して、ナノ粒子中に封入さのdsRNA / siRNAの割合を計算するために、上清中に残存する量。この充填効率は、通常90％以上である。
- 以上のナノ粒子が必要な場合は、同じ手順を繰り返します。すぐに乾燥したナノ粒子を使用してください。使用前に粒子の低温貯蔵の影響が評価されていない。
4.モスキート食品は、RNAナノ粒子干渉/キトサンを含む準備
- （w / v）の脱イオン水に、アガロースを溶融し、2％アガロース溶液1mlを調製し、使用前に55℃の水浴中で融解したアガロース溶液を保つ。
- 魚の餌フレークを混ぜ（47％粗タンパク質、分。粗脂肪10％、最大粗繊維3％）で、乾燥酵母2：1の比（w / w）である。 （第50号米国標準試験ふるいを通過できる）を乳鉢と乳棒で小さな粒子に混合物を挽く。どちらかすぐに、色が茶色がかったあるべき地上の食べ物を、使用するか、または数週間4℃で密封容器に保管してください。
- 1.5ミリリットルチューブでは、つまようじで3.7節からの乾燥ナノ粒子で地面食品の6 mgのミックス。
- 食品·ナノ粒子混合物に2％のプレ溶融したアガロースゲル溶液の30μlのを追加します。つまようじまたはピペットチップを使用してすぐに、徹底的にかき混ぜる。
- すぐに蚊の幼虫を養うために食品やナノ粒子を含むゲルを使用してください。ゲルが完全に室温で固化されると代替的に、4℃でゲルを格納し、使用する次の日に、または後で使用するために-80℃で。
食べ物は、RNAナノ粒子干渉/キトサンを含有する蚊の幼虫を餌5.
- 給餌A.ハマダラカ蚊の幼虫：
- Siのを削除爪楊枝を使用して1.5ミリリットルチューブからngleゲルペレットときれいなカミソリの刃や歯のピックを使用して6等しいスライスにカット。
- 脱イオン水100mlを含む500mlペトリ皿に20三齢幼虫を転送します。
- 4日間、一日一回ペトリ皿当たりゲルペレット（細かく小さな断片に切り刻ま）の1スライスを追加することによって蚊の幼虫フィード。大幅にサイズが縮小または翌日までに完全に存在する必要があり、ペレット、上の幼虫の摂食を必ず守ってください。時間が経過すると、蚊が遅れて4齢幼虫に発展する。
- 実験中の目に見える表現型の変化を記録します。 4日間の期間の終了時にセクション6で説明したように転写レベルおよび他の表現型の変化を調べます。
- 給餌A.ネッタイシマカの蚊の幼虫：
- 清潔なカミソリの刃や爪楊枝を使って6等しいスライスにゲルペレットをカット。
- 卵孵化Fiの後に50歳の同期24時間を置きます≈40mlの脱イオン水中のシャーレに1の幼虫。
- その日の残りの1グラウンド魚の餌フレークとドライイースト：その後2の正規の幼虫の食事に戻って幼虫を転送する、4時間/日のペトリ皿当たりの幼虫1スライスを養う。 4幼虫齢を通して毎日の手順を繰り返します。
- 希望発達の時点でセクション6で説明したように転写レベルおよび他の表現型の変化を調べます。
遺伝子ノックダウンの6.確認
- Aの定量RT-PCRによる相対転写産物の定量化ネッタイシマカとA.ハマダラカの幼虫。
- 少なくとも10の3つの生物学的複製とを実行し、分析のqRT-PCRアッセイは11,19,20が記載されている実験の幼虫対コントロールをプールし、または標準的な実験手順に従って。代表的な結果を以下に含まれています。
- 特定の組織タイプ/本体部分（ すなわち 、脳またはアンテナ）の分析のために、perfo目的の組織を回復する解剖以下6.1.1に記載のように定量RT-PCRのrm（例えば、マイソールら 21を参照されたい）。
- in situハイブリダイゼーションによるノックダウンの確認
- ジゴキシゲニン標識アンチを合成し、標準的な実験室の練習にまたは26に記載のように応じて制御リボプローブを感知。
- 11,20以前に説明し、以下の代表的な結果のセクションで説明したようにノックダウンの確認のためハウゲンら 27プロトコルごとin situハイブリダイゼーションを実行します。
- 免疫組織化学によるノックダウンの確認
- 標的遺伝子のタンパク質産物に対する抗体が利用可能である場合、以前representatiに例示されるように表現型分析20のためのノックダウンの最大レベルを有する個体の同定を容易に28を 、説明したように、免疫組織化学を行う下記の結果セクションVEの。
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Representative Results
A.ハマダラカ：
キトサン/ dsRNAはナノ粒子によるキトサンのアミノ基とdsRNAのリン酸基との間の静電相互作用によって形成されている。溶液からのdsRNAの枯渇によって測定されるように、ナノ粒子中へのdsRNAの取り込みの効率は、通常90％以上である。原子間力顕微鏡画像は、100〜200nmの（ 図1）の範囲の直径がそのキトサンのdsRNA粒径平均が140nmを示す。
キトサンおよび干渉RNAによる図1のナノ粒子の形成。キトサン/ dsRNAのナノ粒子（A）またはdsRNA（B）を添加していないキトサン溶液の原子間力顕微鏡画像。画像のサイズは、1.0ミクロン×1.0であった。スケールバー= 250 nmの。e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
標準の幼虫食べ物と一緒にし、アガロースに組み込まれているこれらの粒子の供給は正常な発育をサポートしています。重要なことは、外胚葉由来のAgCHS1転写物の特異的ノックダウンだけでなく、中腸固有AgCHS2（ 図2）は、dsRNAは、ナノ粒子の摂取を通じて取り上げていることを実証し、19の可能な腸を超えてRNAiを開始している。 ≈40-60％ノックダウン効率が（ 例えば 、 図2）を観察し、転写産物の間で変化した。
でのdsRNA摂取後のキチン合成酵素2（AgCHS2）の図2.転写レベル <em>のA.ハマダラカの幼虫。DS AgCHS2または制御DS GFPを有するナノ粒子で飼育幼虫でAgCHS2の相対的mRNAレベル。データは、3つの独立した生物学的複製からの平均±SDとして提示されている。バー上の異なる文字は対t検定（P = 0.003）に基づく有意差を示している。
AgCHS1のノックダウンが大幅に4齢幼虫の合計キチン含量を減少させ、キチン合成阻害剤の殺虫剤に対する感受性を増加させ、19ジフルベンズロン、AgCHS2のノックダウンはかなり白いカルコフロアの効果を増加し、4齢に囲食マトリックス（PM）を破砕しているスレイトール幼虫死亡率の増加17になります（ 図3）。
ネッタイシマカ：
キトサン/ siRNAのナノ粒子は、A中の軸索ガイダンス遺伝子セマフォリン-1A（sema1a）を標的とするために使用されたネッタイシマカ幼虫の開発20。 sema1aのノックダウンは、幼虫の脳のお尻の≈60％でsema1aレベルの低下を検出したin situハイブリダイゼーション 、 貫通確認された（B対図4C、黄色の矢印は、触角葉を示す）essedとノックダウン動物の脳の≈40％でsema1a発現を検出することができなかった。 （対照ナノ粒子を与えた動物と比較して、プールされた全動物に対して行わ定量RT-PCRアッセイは、この技術はsema1a転写物における32±10％の減少をもたらしたことを明らかにした、図4A、対応のあるt検定に基づくP <0.01、N = 5、N生物学的複製の数）がある。幼虫および蛹の嗅覚表現型分析の間に有意なノックダウンを有する動物を同定するために使用した抗Sema1a抗体発現（D1対図4E1）の喪失によって証明されるように脳内のノックダウンは、蛹の開発の少なくとも24時間持続した。 （表1の定量化）幼虫と蛹の触角葉欠陥がsema1aノックダウン幼虫と蛹で検出された（ 図4E2、E3対
図4.キトサン/ siRNAは、Aの開発嗅覚系でsema1aのノックダウンを誘発したネッタイシマカ。定量RT-PCR（A）及びin situハイブリダイゼーション （B、C）アッセイは、siRNA 890をターゲットsema1aの混合物を供給したsiRNA 1198キトサン/ RNA干渉する制御ナノ粒子対ナノ粒子の幼虫にsema1aのノックダウンを確認した。 Sema1a発現の喪失は、（D1-3対E1-3）変形している糸球体になった。詳細は本文を参照してください。背側は、すべてのパネルにアップしている。 =25μmのスケールバー。この図は、もともとマイソールら 20に登場した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 幼虫 | さなぎ | |||||
| siRNAは | N | <strong>の野生型 | AL欠陥 | N | 野生型 | AL欠陥 |
| コントロール | 69 | 69（100％） | 0（0％） | 68 | 68（100％） | 0（0％） |
| sema1a KD | 77 | 42（54.5％） | 35（44％）* | 75 | 51（68％） | 24（32％）* |
表1. sema1aノックダウン後触角葉欠陥の定量。対照siRNA対sema1aノックダウンのために得られた結果のコンパイル済みのまとめ（KD）のsiRNA 890 +のsiRNA 1198キトサンナノ粒子を与えた動物の両方の幼虫で行わ8反復実験（の合計から左）および蛹（右）が示されている。合計触角葉（AL）の欠陥（欠陥を標的嗅覚受容ニューロン、不良神経網糸球体形成）対野生型の形態を示した動物の評価個体数（n）および数字/パーセンテージが示されている。ノックダウン（*で示される）最も重篤な欠陥を示した動物のサブセットにおける抗Sema1a抗体染色（15幼虫および蛹10）で免疫組織化学的に確認された。コントロールを与えた動物でSema1aレベルが著しく変化しなかったときにこのようにして評価した全てのノックダウン動物は、Sema1aのレベルが低下していることが見出された。この表は、もともとマイソールら 20で登場しました。
第二の調査では21、キトサン/ siRNAのナノ粒子は、嗅覚系の開発中にひたむきな転写因子（SIM）を標的とするために使用された。動物全体から解剖プールされた脳と定量RT-PCRアッセイは、SIMノックダウンの脳は平均47％のreductiに持っていたことが示された上のナノ粒子を与えた動物をコントロールする比較してシム転写物（P = 0.005、対応のあるt検定に基づく）。に関してシムレベルの平均77％削減を明らかにしたアンテナと同等のアッセイは、動物（P = 0.002対応のあるt検定に基づく）を制御給餌する。組織と動物のノックダウンのレベルのある程度の変動にもかかわらず、 シム転写物は、二つの異なるノックダウンのsiRNA（ 図5B2、B3、C2のいずれかで処理した後のノックダウン動物の脳/アンテナの≈50％にin situハイブリダイゼーションを介して検出されなかったB1対C3、C1、表2）。酵母に魅了された個人が魅了されていない動物が0のスコアを与えたが、1のスコアを授与シム430のために、平均点またはSIMされた時に酵母行動アッセイでは718ノックダウン動物は、Siた2反復実験での制御を与えた動物のそれよりgnificantly低い（ 図5A、対応のあるt検定に基づいて、P <0.001）。減少したアンテナでシムのレベル（ 図5B2、B1対B3）と脳と相関の不良臭気行動追跡（ 図5A）（図5C2、C1対C3、黄色のドットが触角葉の周囲をマーク; 表を参照してください。結果の定量化のための2）。複数の欠陥が（マイソールらを参照してください。詳細については21）アンテナおよびSIMノックダウン動物の触角の葉で同定された。例えば、SIMノックダウン幼虫と蛹はORCO、嗅覚受容ニューロン（ 図6）内のすべての嗅覚受容体のための偏性コレセプターの発現を欠いていた。減少ORCO転写レベルは（シム430に供給される個体において検出された図6A3、B3）または（ 図6A4は、B4）ノックダウン（KD）キトサン/ siRNAのナノ粒子が（ 図6A1、B1に野生型動物と比較し、 図6A2におけるキトサン/ siRNAのナノ粒子を与えた動物、B2）を制御718シム 。 L4幼虫（ 図6A1-A4）で観察されたORCO発現表現型の損失は、蛹の形成（ 図6B1-B4）後少なくとも24時間を通じて持続した。
図5. SIMノックダウン幼虫ショーの不良匂い誘引行動。situハイブリダイゼーションでは、SIM 430とSIM 7の減少触角でシム RNAのレベル（B2、B3）、脳（C2、C3）を明らかにした酵母嗅覚誘引（A）への応答に失敗した18ノックダウン動物（と比較し、B1に制御する葉C1）、。詳細は本文を参照してください。アンテナの近位端は、B1-B3に上向きに配向されている。背がC1-C3で上向き。 =25μmのスケールバー。この図は、もともとマイソールら 21に登場した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
現像A.でORCO式図6.損失シムのノックダウン後ネッタイシマカアンテナ。ORCO転写物のレベル低下は、個人FEで検出されたシム430（A3、B3）または718 SIMと D （A4、B4）のノックダウン（KD）キトサン/ siRNAのナノ粒子（B1、A1、野生型動物と比較して、A2にキトサン/ siRNAのナノ粒子を与えた動物をコントロール、B2）。詳細は本文を参照してください。 =25μmのスケールバー。この図は、マイソールら 21に掲載された画像からコンパイルされました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 魅了 | 魅了されない | ||||||||
| siRNAは | N | ＃動物 | ノーマル | 適度な | ヌル | ＃動物 | ノーマル | 適度な | ヌル |
| コントロール | 195 | 196（100％） | 196（100％） | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| シム430 KD | 176 | 63（35％） | 48（76％） | 15（24％） | 0 | 113（64％） | 20（18％） | 12（11％） | 81（71％） |
| シム718 KD | 177 | 66（37％） | 44（66％） | 22（34％） | 0 | 111（63％） | 20（18％） | 9（8％） | 82（74％） |
表2.レベルシムのSは、 酵母の行動アッセイで幼虫の性能と相関する。4酵母嗅覚誘引で得られた結果のコンパイル済みのまとめをした実験を複製示されている。動物の総数（n）は、これらの行動アッセイで試験した個々の幼虫の数を示す。魅了された個々の幼虫の数（＃動物）（左;酵母ペレットに触れたと1のスコアを授与された動物）か否惹か（右;酵母ペレットに触れ0のスコアを受けていなかった動物）各条件（コントロールは、430 KDをSIM、または718 KDキトサン / siRNAのナノ粒子供給をSIM）の下に示されており、全体の動物のパーセンテージは、生の数値以下に含まれています。 シムのノックダウンは、動物の脳と触角にin situハイブリダイゼーションを介して評価された酵母（右）惹か（左）または魅了しない。ザ·生の数/（SIM転写レベルを野生型と同程度の）通常の個体の割合は、ヌル（無観察可能なSIM転写物）、または中等度（還元ではなく、野生型）SIMのレベルが示されている。 シムの損失は、酵母の魅力の欠如とよく相関していた。この表は、もともとマイソールら 21で登場しました。
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Discussion
本明細書に記載のキトサン/干渉RNAナノ粒子法は、効果的にAの発育中の遺伝子を標的とするために使用されているハマダラカ （ 図2、図3）およびA.ネッタイシマカ （ 図4、図5、図6、表1、表2）。キトサンナノ粒子は、本明細書に記載の代表的な結果によって証明されるように蚊に成功裡に使用されている両方とも、長いdsRNAまたはsiRNAのいずれかを用いて調製することができる。 dsRNAの合成は、siRNAを購入するよりも安価であるが、より労働集約的である。キトサン/ siRNAは使用される場合、表現型が明らかに表現型がオフサイト標的化によるものではないことをより良く保証を可能にする、複数のsiRNAを用いて確認することができる。また、siRNAは一斉の商業生産は、より良好な視野に種特異的な蚊の駆除のためのRNAサイレンシングを妨害/キトサンの拡張を容易にすることができる。これはもちろんobsta克服が必要ですそのようなコスト、納期などクル。
私たちはこのプロトコルとの良好な成功を収めているが、方法論は、各遺伝子のために最適化されなければならない。このような理由から、私たちは、新しいプロジェクトの開始時に、おそらく複数のsiRNA、または1 siRNAおよび長いdsRNAをテストすることをお勧めします。表現型は、目的の遺伝子に対応する少なくとも2つの異なるsiRNAを同定し、確認されると、それは表現型浸透度（ 図4）を増加させるために、これらのsiRNAを組み合わせることが有用であり得る。また、タイミング及びキトサン/干渉RNA供給時間の持続時間は、各研究のために最適化することができる。A.キトサンのみを与えたときハマダラカは、本明細書に記載のRNA食品干渉/繁栄する。しかし、我々はこれまでに行った実験では、A.ネッタイシマカは 、補足的な栄養なしでうまく我々は、RNAの供給を妨害する/キトサンの4時間後に通常の食品の食事療法にそれらを転送することによって克服してきた問題を善戦していない。 /キトサンを使って実験を妨害我々はまだ試みられていない別の食品基板におけるRNAの送達は、この問題を回避することができる。私たちは、数日間にわたって4時間毎日の授乳がノックダウンと十分な栄養のバランスになることを発見したが、給餌の期間の修正は、さらに必要に応じて達成しようとすることができる。また、キトサン/干渉RNAナノ粒子供給が/継続開始される幼虫齢、遺伝子機能は、このプロトコルの主な利点を検討している重要な発育期間に応じて、各実験のために調整することができる。
ノックダウンの検証はもちろん重要ですが、また、トラブルシューティングが必要な場合があります。このため、ノックダウン効率が評価されているように、目的の表現型が生成されているかを同時に確認することが有用であり得る。定量RT-PCRの検証実験のためには、プライマーおよびPCR条件を最適化することが重要である。また、動物が発達していることが重要であるいくつかの転写産物の発現が開発し、概日リズムのために29の間に非常に動的であることができるように、実験の開始時に同期された。この技術は明らかに腸を越えてノックダウンを生成しながらさらに、我々は、この手法が有効であるために、組織を評価するために開始され、これは種間で変化してもよい。したがって、in situハイブリダイゼーションを介して定量RT-PCRアッセイのために、または動物全体から関心のある組織を切開することによって達成することができる特定の組織、（ 図4-6）20,21および免疫組織化学（ 図4）20でノックダウンを測定するのに有用であろうアッセイ（ハウゲンら27とClemonsさんらを参照してください。28、それぞれ、これらのプロトコルのトラブルシューティング）。ノックダウンは、個体間で変化するので、ノックダウンのレベルと組み合わせて、表現型を評価するために二重標識アッセイを実行するために有用である（ ふぃぎゅ非常に表現型の特徴付けを容易にする、4）20再 。行動研究のために、個々の動物におけるノックダウンレベルは、それらの行動の性能（ 表2）20,21と相関させることができる。
A.するには、以下のキトサン媒介干渉RNA配信ネッタイシマカの幼虫は、減少遺伝子発現は、蛹の開発の24時間（ 図4、図6）20,21で検出される。遺伝子発現のレベルは、まだ開発のこのポイントを超えて詳細な様式で評価されていないが、遺伝子発現レベルの低下は、両方の48および72時間Aで検出されているネッタイシマカの蛹（KM、未発表）。それはAの複数の段階でノックダウンレベルのより詳細な分析を追求することが有用であるA.を評価するためにもネッタイシマカ蛹の開発およびハマダラカの蛹。また、ノックダウンは成人に持続するかどうかを判断するために興味深いものになるだろうと中にナノ粒子媒介探求する成虫用RNA送達戦略をterfering。
アプローチを標的部位特異的ヌクレアーゼ遺伝子は、最近Aに導入したネッタイシマカとA.ハマダラカ蚊および他の非遺伝的モデル生物30,31における標的化、遺伝変異の生成を可能にしている。これらのアプローチの使用は、機能表現型のより均一な損失は、RNAiのアプローチに対する利点を分析可能にするが、目的の変異についてのスクリーニングは、まだかなり時間がかかり、労働集約的である。機能研究のRNAiの損失が唯一の野生型株のメンテナンスが必要ですがさらに、変異体蚊株は個別に飼育されなければならない。劣性致死または成人無菌変異の維持管理は、現在、蚊でマークされたバランサーの現在の不足与え挑戦している。アプローチを標的部位特異的ヌクレアーゼ遺伝子を迅速人気を集めている間にこのように、標的化キトサン/干渉性RNAは、最適である蚊株を維持するために装備されていない実験室用と場合によっては選択がいる開発中の遺伝子機能の喪失は、株の生存と互換性がありません。
我々の知見に基づいて、我々は、キトサン/干渉RNAは、Aの開発中に、多くの異なる遺伝子のノックダウンのために広く使用することができることを予想するハマダラカ、ネッタイシマカ、ならびに他の昆虫、および潜在的に他の非遺伝的モデル生物。キトサンとの正常な遺伝子サイレンシングは、/干渉RNAは、 クルマエビモノドン （エビ）32を含む他の節足動物種で報告されている。最近の研究では、ナノ粒子は、dsRNAの取り込みを促進するため、農業害虫を標的とするこの技術を使用する可能性を強調しているアジアcornborer 33におけるdsRNAの直接給餌に比べて、ノックダウン効率を高めることが実証された。ヒトでの治療薬としてのsiRNAナノ粒子の使用の可能性は大いにOを集めている医学界でのF関心。 Giljohann ら 34は、遊離のdsRNAと比較して6倍長い半減期を有し、容易に細胞に入る多価RNA金ナノ粒子コンジュゲートの合成および特徴付けを記載した。 Davis ら 35は、固形腫瘍を有する患者に、ナノ粒子送達システムを使用して、siRNAの全身投与を含む最初のヒト臨床試験を記載し、及びキトサン/ siRNA治療薬を使用する可能性は、最近36を検討した。したがって、キトサン/技術を標的RNA遺伝子を妨害することは、より広い用途の可能性のある、貴重な実験技術である。今後の研究では、この技術のための追加のアプリケーションを探る。また、キトサンおよび他のポリマー、研究の活発な領域の化学修飾は、干渉RNAの送達の効率を増加させるか、特定の組織37の標的化送達を可能にすることができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.02 ml pipetteman | Rainin | PR20 | for resuspension of interfering RNA |
| 0.2 ml pipetteman | Rainin | PR200 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 0.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-120 | for aliquoting resuspended interfering RNA |
| 1 ml pipetteman | Rainin | PR1000 | for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1.5 ml graduated tube | Fischer Scientific | 05-408-046 | for preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| 1M Sodium Acetate, pH 4.5 | TEKnova | S0299 | to prepare sodium acetate buffer |
| Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | to prepare sodium acetate buffer |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | to coat prepared interfering RNA/nanoparticles |
| Centrifuge | Eppendorf AG | 5415D | to pellet interfering RNA/nanoparticles |
| Chitosan, from shrimp shells | Sigma-Aldrich | C3646-25G | to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles |
| Dry Yeast | Universal Food Corp | NA | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| E-RNAi tool | German Cancer Research Center | NA | for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| goldfish food | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles |
| Heated water bath | Thermo Scientific | 51221048 | to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC |
| Ice | not applicable | not applicable | for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 02-591-44 | for storage of ice used during the procedure |
| liver powder | MP Biomedicals LLC. | 900396 | to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment |
| Microwave oven | A variety of vendors | not applicable | to prepare 2% agarose solution |
| petridish (100 x 15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae |
| pH meter | Mettler Toledo | S220 | for preparation of buffers |
| Razor blade | Fischer Scientific | 12-640 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | for preparation of siRNA/nanoparticles |
| Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) | BDH/distributed by VWR | VWR BDH0302-500G | to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended |
| Thermometer | VWR | 61066-046 | to measure the water bath temperature |
| Tooth picks | VWR | 470146-908 | for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets |
| Ultralow freezer | A variety of vendors | not applicable | for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC |
| Vortex mixer | Fischer Scientific | 02-216-108 | for preparation of chitosan/interfering RNA |
| Weight paper | Fischer Scientific | NC9798735 | to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings |
References
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