Protocol
ملاحظة: وأجريت التجارب باستخدام الفئران وفقا للجنة الرفق بالحيوان المؤسسي (IACUC) المبادئ التوجيهية.
1. إعادة تشكيل خرقة-1 - / - الفئران بخلايا أنا ن المختبر مثقف Th17 (ثلاثة أيام قبل العدوى)
- لإنشاء خلايا Th17، ثقافة CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- خلايا T السذاجة (3 × 104) في أسفل U-96 لوحات جيدة وحدها، أو شارك في ثقافة لهم على طول مع 3 × 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs في وجود قابل للذوبان α-CD3 (1 ميكروغرام / مل)، α-CD28 (2 ميكروغرام / مل) الأجسام المضادة وخلايا مستضد تقديم، في ظل ظروف Th17 (الاستقطاب باستخدام IL-6 (25 نانوغرام / مل)، β TGF- (2 نانوغرام / مل) ، α-IFN-γ (2 ميكروغرام / مل)، وα -IL-4 (2 ميكروغرام / مل)) لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام.
ملاحظة: تم فرز خلايا ساذجة وT البندان باستخدام مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) لد إجراءات عزل الخلايا المغناطيسية ومثقف كما هو موضح سابقا 19-22. - في يوم 4، وبعد إعادة التعليق الخلايا Th17 باستخدام ماصة، وجمع لهم من الثقافات، وأجهزة الطرد المركزي منهم تحت ظروف معقمة.
- اتخاذ قسامة صغيرة من هذه الخلايا لدراسة الجدوى وللphenotyping. و resuspend لهم في 500 ميكرولتر من RPMI المتوسطة، إضافة يوديد propidium (200 نانوغرام / مل)، وتقييم قدرتها على الاستمرار على الفور من قبل التدفق الخلوي. أداء phenotyping بواسطة التدفق الخلوي تقييم إنتاج IL-17A بعد restimulation (انظر القسم 6.3).
- الطرد المركزي وغسل الجزء الأكبر من الخلايا في برنامج تلفزيوني العقيمة في 480 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية في جميع الخطوات ما لم ينص على خلاف ذلك.
- استخدام هذه الخلايا لنقل بالتبني في CD45.2 Rag1 6-8 أسبوع من العمر - / - الفئران العوز المناعي.
- Resuspend الخلايا في 1 × 10 7 خلية / مل كثافة الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة البارد.
- ضخ 100 ميكرولتر من الخلايا عن طريق intrapحقن eritoneal، وذلك باستخدام الإبر 25 G في 1 مل الحقن السلين، مثل أن الماوس واحد يتلقى 1 × 10 6 خلايا. فإن بعض الفئران يتلقى خلايا PBS أو Th17 فقط، وسوف الفئران الأخرى الحصول على خلايا Th17 التي كانت شاركت في تربيتها مع الخلايا Treg.
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات جو معقم و مطهر.
2. تزايد C. البيض للعدوى (يوم واحد قبل العدوى)
- قبل التلقيح، وتفريق خمسة مستعمرات CAF2-1 C. سلالة البيض مختبر في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة تعليق وإضافة تعليق إلى مرق العقيمة.
- تطعيم 5 مستعمرات C. البيض في 50 مل من قاعدة النيتروجين الخميرة (YNB دون الأحماض الأمينية) / ببتون / سكر العنب المتوسطة مرق واحتضان في حاضنة شاكر في 30 درجة مئوية لمدة 15-18 ساعة عند 130 دورة في الدقيقة.
- مراقبة مرق لالغيوم، لأن ذلك يعد مؤشرا لنمو الفطريات.
3. المبيضاتالحصاد وإجراء العد (في يوم العدوى)
- جمع 10 مل من مرق المبيضات في 15 مل أنابيب. لكميات أكبر، وجمع المبيضات في 50 مل أنابيب.
- الطرد المركزي blastospores الساعة 1900 x ج لمدة 5 دقائق على RT في جميع الخطوات ما لم ينص على خلاف ذلك. بيليه blastospores بواسطة الطرد المركزي، تليها إزالة طاف.
- إذا كان هناك أنبوب أكثر من واحد، تجميع blastospores المبيضات من أنابيب متعددة، مضيفا PBS العقيمة إلى الكريات و resuspend لهم في 10 مل من برنامج تلفزيوني لمدة العد.
- يستغرق 20 ميكرولتر من blastospores في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، إضافة 20 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 2X واحتضان في RT لمدة 15-20 دقيقة. عد blastospores الثابتة باستخدام عدادة الكريات تحت المجهر.
ملاحظة: لامتصاص العرق هو مادة مسرطنة. فتح الحل غير مخفف فقط في غطاء الدخان. - في هذه الأثناء، كرر غسل blastospores مرتين على الأقل، بواسطة الطرد المركزي رتنحنح في برنامج تلفزيوني، والتكوير وblastospores. الحفاظ الكريات في 15 مل أنابيب في RT، في غطاء محرك السيارة ABSL1، وعلى استعداد للعدوى.
- ترك بعض PBS العقيمة في RT لإعادة التعليق على blastospores للعدوى.
- بعد العد، إضافة PBS العقيمة لبيليه بوغ برعمي لضبط أعداد الخلايا الخميرة بوغ برعمي إلى 2 X10 8 من الخميرة خلية / مل. هذا هو تعليق بوغ برعمي التي سيتم استخدامها لتصيب الفئران.
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات جو معقم و مطهر.
4. الفئران العدوى (3-5 أيام بعد نقل خلية)
ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراء العدوى الأساسي كما هو موضح سابقا 19،23-25.
- تزن خرقة-1 - / - الفئران التي تلقت PBS أو الخلايا قبل ثلاثة أيام.
- حساب جرعة من وكلاء مخدر باستخدام وزن الجسم. تخدير الفئران عن طريق إدارة الكيتامين / زيلازين خليط (16.1 ملغ / مل و 1.6 ملغ / مل)، وذلك باستخدام الإبر 25 G في 1 مل الحقن السلين، من خلال INTRحقن aperitoneal.
- إدارة 50 ميكرولتر لكل 10 غراما من وزن الجسم. (أي 0.8 ملغ من الكيتامين و 0.08 ملغ من زيلازين / 10 غرام من وزن الجسم أو 80 ملغ من الكيتامين و 8 ملغ من زيلازين لكل كيلوغرام من وزن الجسم على التوالي). مراقبة للاستجابة قرصة أخمص قدميه كل 15 دقيقة بعد التخدير.
ملاحظة: هذا الدواء يحفز 60-90 دقيقة من التخدير، وهو ما يكفي لإجراء العدوى. - تطبيق مرهم التشحيم العيون في أعين الفئران لمنع القرنيات من الجفاف. كما زيوت التشحيم العين قد تجف، كرر تزييت العيون كل 45 دقيقة.
- إدارة 50 ميكرولتر لكل 10 غراما من وزن الجسم. (أي 0.8 ملغ من الكيتامين و 0.08 ملغ من زيلازين / 10 غرام من وزن الجسم أو 80 ملغ من الكيتامين و 8 ملغ من زيلازين لكل كيلوغرام من وزن الجسم على التوالي). مراقبة للاستجابة قرصة أخمص قدميه كل 15 دقيقة بعد التخدير.
- حقن 1 مل من المياه المالحة (0.9٪ كلوريد الصوديوم) تحت الجلد على ظهر المتاخمة للforelimb، للمساعدة في معالجة الجفاف من الفئران أثناء التخدير.
- الحصول على، قفص نظيفة الجديد. اتبع العدوى إجراء واحد الماوس في كل مرة، وضع كل الماوس في قفص جديد مرة واحدة مصابة. أداء PBS / العدوى الشام أولا، ثم انتقل إلى غرو عدوى المبيضاتيو بي إس.
- التقاط الماوس تخدير وفتح الفم واسعة للكشف عن قاعدة اللسان.
- وضع 3 مم الكرة قطر القطن مشبعة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو بوغ برعمي تعليق، تحت اللسان في تجويف الفم لمدة 90 دقيقة. الوجه الفئران كل 15 دقيقة أمام والخلف لمنع الازدحام الرئة، وضمان أن كرات القطن لا تتحرك.
- إعداد الموقت لكل الماوس لضمان 90 دقيقة من الشام أو المبيضات التلقيح في تجويف الفم.
- إبقائهم في قفص تحت مصباح الحرارة (4 أمتار)، ولكل الماوس على منصات هلام الحرارة.
- تأكد من أن يتم سحب اللسان داخل وبعيدا عن الأسنان، لتجنب الأسنان يمزق اللسان.
- في نهاية 90 دقيقة، وإزالة القطن الكرة من فم الفأر. مشاهدة اي الماوس التي قد تعافي من التخدير في وقت أقرب مما 75 دقيقة. في مثل هذه الحالة، تخدير لهم مرة أخرى مع الكيتامين (40 ملغ / كلغ) فقط.
5. المشاركة الاجراءالبريد رصد (خلال التخدير 90 دقيقة)
- استخدام منصات هلام الحرارة خلال التخدير 90 دقيقة.
- للحفاظ على درجة حرارة الجسم ومنع الاختناق، لا تسمح الفئران لاسترداد على قطعة خبز الذرة والفراش الماوس العادية.
- بعد التعافي من التخدير، وإدارة و1 مل إضافية من معقم 0.9٪ كلوريد الصوديوم تحت الجلد في موقعين على ظهره.
- إبقاء ما يصل إلى خمسة PBS (صورية) الفئران الملقحة في القفص. البيت فقط 1-2 الفئران المصابة في القفص.
- ملء بطاقة الإجراء مع بالاحرف الاولى كل يوم بعد العملية ليدون التغييرات في وزن الجسم، والاستمالة عادات والصحة العامة.
6. تقييم التهاب
6.1) فقدان الوزن
- وزن الفئران كل يوم خلال العدوى، ابتداء من اليوم السابق لإجراء العدوى.
ملاحظة: عادة، والفئران العوز المناعي حقنها بخلايا Th17 وبدون البندان T تستسلم إلى 20-30٪ وفقدان الوزن بسبب زيادة عبء الفطرية 19 وتفاقم الالتهاب.
6.2) التهديف الأنسجة من اللسان
- التضحية الفئران عن طريق CO 2 الاختناق تليها خلع عنق الرحم.
- فتح الفكين وتشريح خارج اللسان مع مقص وملقط. استخدام ملقط حادة لعقد اللسان، وباستخدام مقص وصول إلى الجزء الخلفي من الفم إلى شق نهاية الجزء الخلفي من اللسان.
- لالهيماتوكسيلين immunocytochemical ويوزين (H & E) تلطيخ من الأنسجة اللسان، وشطف الأنسجة اللسان مع الجليد الباردة PBS. إضافة 5 مل من 10٪ من الفورمالين لمدة 2-3 الألسنة واصلاحها O / N في 15 مل أنابيب.
- في اليوم التالي، وإزالة الفورمالين وتزج الأنسجة في 5 مل من الايثانول 70٪ لمنع فرط التثبيت. إرسالهم إلى الخدمة التجارية لمواصلة البارافين التضمين، باجتزاء وتلطيخ أقسام البارافين.
ويستخدم خدمة الأنسجة التجارية لتنفيذ هذه الخطوات التالية: ملاحظة. - مرة واحدة الشرائح تعود من الخدمة الأنسجة التجارية، الصف الالتهاب من خلال مراقبة أقسام الأنسجة تحت المجهر الضوئي.
- يسجل 0-5، مع 0 كونها لا الالتهاب، و 5 كونها التهاب أشد. يسجل التهاب باستخدام الجدول 1.
6.3) إنتاج السيتوكينات من قبل خلايا Th17
ملاحظة: الإفراط في إنتاج TNF-α هي واحدة من قراءات لالباثولوجيا المناعية المفرطة. عندما يتم نقل الفئران adoptively مع خلايا Th17 فقط، فإنه يتسبب الباثولوجيا المناعية مقترن المفرط إنتاج TNF-α في خلايا Th17.
- جمع تعليق خلية واحدة من الطحال والغدد الليمفاوية العنقية، lymphnodes الإبطية، واللسان، وذلك باستخدام الأساليب المذكورة سابقا 19،26.
- Restimulate الخلايا مع خلات phorbol ميريستات (PMA) (50 نانوغرام / مل)، وIonomycin (500 نانوغرام / مل) لمدة 4 ساعة مع Brefeldin ألف (10 ميكروغرام / مل) المضافة في لترAST 2 ساعة. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واصلاحها باستخدام طقم التثبيت / permeabilization التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- أداء داخل خلوى الخلوي تلطيخ باستخدام تألقي مترافق مكافحة TNF-α، ومكافحة IL-17A والأجسام المضادة ROR-γt كما هو موضح سابقا (19).
- لفترة وجيزة، resuspend الخلايا في permeabilization العازلة 1X مع مزيج من مكافحة TNF-α، ومكافحة IL-17A والأجسام المضادة ROR-γt، كل الأجسام المضادة في 2-3 ميكروغرام / مل تركيز النهائي.
- احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة على RT.
- بعد الحضانة، وغسل الخلايا مع 1X العازلة permeabilization.
- resuspend الكرية خلية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ ألبومين المصل البقري لتحليل التدفق الخلوي.
- في اليوم التالي، وإزالة الفورمالين وتزج الأنسجة في 5 مل من الايثانول 70٪ لمنع فرط التثبيت. إرسالهم إلى الخدمة التجارية لمواصلة البارافين التضمين، باجتزاء وتلطيخ أقسام البارافين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا النموذج، فإن كلا من الفئران -infected المبيضات والفئران غير المصابة في خرقة-1 - / - خلفية العوز المناعي نقلوا adoptively مع خلايا Th17 3-5 أيام السابقة للعدوى. واستخدمت ما مجموعه 10-12 الفئران للتجارب، مع 2 الفئران في كل الشام المصابين المجموعات، و4-5 في كل مجموعة من المجموعات المصابة المبيضات. وقد استمدت خلايا ساذجة من مسانج Thy1.1 أو CD45.1 الفئران، بحيث تم تتبع خلايا Th17 حقن في الجسم الحي باستخدام Thy1.1 أو CD45.1 تلطيخ على التوالي (الشكل 1A). وقد استمدت-نقل شركة T البندان من الفئران CD45.2 لتمييزها عن الخلايا CD45.1 Th17. وبالنسبة لبعض التجارب، CB-17 Thy1.2 الفئران المتلقي SCID، استخدمت خلايا Th17 المانحة تم الحصول عليها من الفئران Thy1.1 BALB / C والبندان T تم الحصول عليها من الفئران Thy1.2 مسانج. فقط -infected المبيضات الفئران، ولكن ليس الفئران غير مصاب عرضت تجنيد وتوسيع CD45.1 أعيد + (الشكل 1A). النتائج تمثل البيانات من الماوس واحد في كل مجموعة.
فقط في الفئران التي يتم نقلها شارك مع البندان T، تم الكشف عن Foxp3 + CD45.1 CD4 + الخلايا سلبي في CLN. هذا يدل على أن البندان T حقن تم تعيين أيضا إلى موقع الإصابة (الشكل 1B). النتائج تمثل البيانات من الماوس واحد في كل مجموعة. في حين أن المصابين خرقة-1 - / - فقدان الوزن وتعافى بعد 4 أيام من العدوى، والفئران كبت المناعة الكورتيزون لم يتعافى ولكن أبعد فقدت الوزن، كما هو موضح سابقا (27). كل من مجموعات من الفئران التي تلقت خلايا Th17 في وجود أو عدم وجود T البندان فقدت الوزن في البداية. ومع ذلك، فإن الفئران التي تلقت البندان T تعافى من فقدان الوزن وحلها العدوى. 2 ماستخدمت الجليد في المجموعة الشام المصابة، و 4 في كل مجموعة المصابة المبيضات. كان هناك 3 الفئران في مجموعة الكورتيزون. الفئران التي تلقت خلايا Th17 فقط، فقدت الوزن تدريجيا (الشكل 2) 19. كان بعض من الفئران في هذه المجموعة ليتم التخلص. وتشير هذه النتائج متوسط وزن كل الفئران في تلك المجموعة. وعلى الرغم من العدلات مطلوبة لإزالة الأولي للعدوى، تواجد مستمر وتجنيدهم في الأنسجة هو علامة على وجود التهاب دون حل. لذلك تم فحص تسلل العدلات في اللسان المصاب، من خلال تحديد التعبير عن علامة العدلة، GR-1، في نقاط زمنية لاحقة مثل يوم 7 بعد الإصابة. الفئران التي تلقت خلايا Th17 فقط، وكان أعلى تتسرب التهابات (الشكل 3A)، بما في ذلك GR-1 + العدلات حتى يوم 4 بعد الإصابة، مقارنة مع الفئران المحقونة مع البندان T (الشكل 3B). وأظهرت هذه النتائج أنه في presenc(ه) من T البندان، قررت الفئران التهاب أكثر كفاءة وتعافى من الإصابة.
في يوم 7 بعد الإصابة، تم عزل الطحال (SPLN)، CLN واللسان الأنسجة، وقدمت تعليق خلية واحدة لتدفق يحلل الخلوي. CLN كشفت زيادة خلايا CD45.1 Th17 (الشكل 1)، ورفع إنتاج TNF-α (الشكل 4A، 4B) في الفئران التي تلقت خلايا Th17 فقط. من ناحية أخرى، ريج T المتلقين أظهرت تراجع وتيرة خلايا Th17 وانخفاض الإنتاج TNF-α من قبل خلايا Th17 (الشكل 1 و 4A، 4B). في هذه التجارب، وتظهر البيانات من CLN من ماوس واحدة، والأنسجة اللسان المقطوع والمجمعة من 2 الفئران. على الرغم من أن في وقت مبكر نقاط الوقت كان إنتاج IL-17A العالي في T ريج المتلقين 19، في نقاط زمنية لاحقة في كل من المجموعات، كان إنتاج IL-17A من قبل خلايا Th17 الحد الأدنى (لا تظهر البيانات). الدوري تلطيخ حمض شيفاللسان أظهرت زيادة خيوط فطرية في الفئران التي تلقت خلايا Th17 فقط، في حين أن الفئران التي تلقت T البندان مسح فضلا الفطر في يوم 5 ويوم 7 بعد الإصابة (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، أظهر التشريح المرضي التهديف من التهاب اللسان أيضا انخفاض درجات التهاب في الفئران التي تلقت T البندان، مقارنة مع الفئران التي تلقت خلايا Th17 فقط (الشكل 6). سجل التهاب استند على اللسان المعلمات النسيجية المرضية مثل، وجود حليمات، وintactness طبقة سطحية الظهارية، الخميرة مرئية أو خيوط، خيوط تشير إلى غزو غير حل العدوى، سماكة الطبقة القاعدية (يدل على إصلاح الأنسجة المستمر)، ووجود تسلل الخلايا المناعية (العدلات وخلايا Th17). وأظهرت هذه النتائج أن حقن الخلايا Th17 لم يقلل الإصابة مباشرة ولكن زادت العبء الفطرية والباثولوجيا المناعية التي تسببها C. الأساسي البيض infecنشوئها، في حين نقل المشارك لT البندان تحسينها الباثولوجيا المناعية.
الشكل 1. حقن خلايا Th17 والخلايا التائية ريج تجنيد وتوسيع في الغدد الليمفاوية استنزاف (CLN) من C البيض الفئران المصابة (A) خرقة-1 -.. / - تم تشكيلها الفئران CD45.2 مع خلايا Th17 أو Th17 + T ريج الخلايا التي تم الاستقطاب في ظل ظروف Th17 لمدة 5 أيام. تم الحصول على خلايا Th17 من الفئران مسانج CD45.1 والخلايا التائية ريج تم الحصول عليها من الفئران CD45.2. لم بعض الفئران لا تتلقى أي خلايا (الشام أو المبيضات + PBS). أصيب الفئران المتلقي في كل مجموعة مع الضوابط صورية أو مع C. البيض. في يوم 5 بعد الإصابة، وكانت CLN isolatإد لتقديم تعليق خلية واحدة وتتبع CD45.1 حقن معربا عن الخلايا Th17 بواسطة التدفق الخلوي (بوابات على كل الكريات البيض في FSC، مبعثر SSC) (B) خرقة-1 - / - CD45.2 تم إعادة تشكيل الفئران بخلايا Th17 أو Th17 + T خلايا ريج كما هو الحال في "A" والمصابين C. البيض. CLN تم عزل لتقديم تعليق خلية واحدة وقياس CD45.1 والتعبير Foxp3 داخل الخلايا بواسطة التدفق الخلوي (بوابات على جميع خلايا CD4). بوابات T ريج في المؤامرات تظهر CD45.1 سلبي، Foxp3 + CD4 + الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. حقن خلايا Th17 تسبب فقدان الوزن في C . البيض الفئران المصابة وشارك في إدارة T البندان يحسن الشفاء من فقدان الوزن. وقد أعيد SCID CB-17 الفئران بخلايا Th17 أو Th17 + T خلايا ريج كما في الشكل 1A. في وقت لاحق 3 أيام، تم إصابة الفئران المتلقي مع C. البيض. بعض الفئران في كل مجموعة أصيب مع الضوابط صورية. تلقت الفئران كبت المناعة خلات الكورتيزون (كورت) الحقن. التغيير في المئة الوزن في الفئران تشكيلها مع الخلايا المشار إليها والمصابين C. البيض، فيما يتعلق د-1 (قبل للإصابة يوم واحد) هو مبين. البيانات هي تطبيع نسبة إلى البيانات الوزن من غير المصابة (الشام + PBS) الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
"SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52538 / 52538fig3highres.jpg "/>
الشكل 3. حقن خلايا Th17 تسبب اللسان الباثولوجيا المناعية في C. المبيضة البيضاء المصابة الفئران وشارك في إدارة T البندان يقلل من الباثولوجيا المناعية. التقييم النسيجي من ألسنة من C. إصابة البيض الفئران. تم إعادة تشكيل الفئران بخلايا المشار إليها وإصابة كما في الشكل 1A. في يوم 5 بعد الإصابة، تم عزل ألسنة من الفئران. (A) كانت ملطخة أقسام السهمي من ألسنة مع H & E لتقييم التهاب والتسلل (IF) من الخلايا المناعية. (باسكال) و (الجيش الشعبي) دلالة الحلمية وطبقة الظهارية في اللسان على التوالي. صور مجهرية من الشرائح ينظر at50X التكبير. (B) المناعية النسيجي ل GR-1 العدلات علامة استخدام الألغام المضادة GR-1 الضد (اومهشمال شرق: 1A8-Ly6g) في الأقسام اللسان في يوم 5 بعد الإصابة (البني، الرمز بواسطة IF). صور مجهرية من الشرائح ينظر في التكبير 100X ترد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. شاركت ادارة T البندان يقلل α TNF- في خلايا Th17 حقن. (A) خرقة-1 - / - تم تشكيلها الفئران CD45.2 مع خلايا Th17 أو Th17 + T خلايا ريج والمصابين C. البيض كما في الشكل 1A. وفي يوم 5 بعد الإصابة، تم عزل الأنسجة CLN واللسان لتقديم تعليق خلية واحدة. تم restimulated هذه الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية وIonomycin قبل staini داخل الخلايانانوغرام وتدفق تحليل الخلوي. وتظهر قطع تدفق cytometric كفاف من الخلايا ROR-γt وTNF- α التعبير عن خلايا Th17 (بوابات على CD4 + الخلايا). (ب) التمثيل الإحصائي للالنسبة المئوية للخلايا TNFαpositive من التجارب أجريت كما في "A". تمثل البيانات 4 الفئران في مجموعة غير المصابة، و6 الفئران في كل مجموعة المصابة، ويتم تجميع من تجربتين مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويرتبط الشكل 5. زيادة الباثولوجيا المناعية أيضا مع زيادة عبء الفطرية في C. المبيضة البيضاء المصابة الفئران. CB-17 هيئة التصنيع العسكري SCIDه تم تشكيلها مع الخلايا BALB / C Th17، أو Th17 + T خلايا ريج كما هو الحال في Figure1A، وكانت مصابة C. البيض. ويظهر التقييم النسيجي لسان من الفئران المصابة. في يوم 7 بعد الإصابة، وكان حصاد الألسنة وملطخة الدوري حمض شيف (PAS) لتقييم الآفات الفطرية، التهاب والتسلل (IF) من الخلايا، وللكشف عن الفطريات (CA). وكان ينظر إلى الشرائح at100X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. T البندان تخفف الباثولوجيا المناعية في C. البيض الفئران المصابة. SCID مع الخلايا BALB / C Th17، أو Th17 + T خلايا ريج كما في الشكل 1A، وكانت مصابة C. البيض. التمثيل الإحصائي للعشرات النسيجية يعني من ألسنة من الفئران المصابة تقييمها كما في الشكل (5). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أحرز هدفا | الخصائص |
| 0 | 0 - لا الخميرة مرئية أو خيوط، ظهارة سطحية سليمة على السطح الظهري للسان، الحليمات الحالي بشكل واضح وغير التالفة (قد تكون أو لا تكون تسلل خلايا وحيدات النوى داخل الأنسجة)، لا سماكة الطبقة القاعدية، أي الخلايا المناعية التسلل. |
| 1 | 1 - لا الخميرة مرئية أو خوطالبريد، خشنة أو أضرار طفيفة ظهارة سطحية، الحليمات الحالي بشكل واضح بأقل ضرر والخلايا المناعية تسلل نادرة. |
| 2 | 2 - الحلمية خفضت لكن الحاضر مع الضرر، وسماكة الطبقة القاعدية والخلايا المناعية تسلل متكررة. |
| 3 | 3 - مجموعات عرضية من الخميرة واضحة وغزو خيوط، دليل على الحليمات التالفة، والآفات عرضية من ظهارة التالفة، سماكة الطبقة القاعدية وومجموعات صغيرة من التسلل الخلايا المناعية. |
| 4 | 4 - مجموعات متكررة من الخميرة واضحة وغزو خيوط، دليل على الحليمات التالفة، والآفات المتكررة للظهارة التالفة، والحد الأدنى تسلل الخلايا المناعية، سماكة الطبقة القاعدية والتجمعات المتكررة للتسلل الخلايا المناعية. |
| 5 | 5 - أدلة على نطاق واسع من غزو خيوط، ظهارة أضرار واسعة عبر السطح الظهري، وتسلل كبير منالخلايا المناعية، قليلة أو معدومة الحليمات كشفها، سماكة الطبقة القاعدية والتجمعات المتكررة للغاية وكبيرة من التسلل الخلايا المناعية. |
الجدول 1: قيم يحرز النسيجية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند هذا النموذج على حمل عن طريق الفم C. عدوى البيض يعتمد Th17 الالتهاب. بسبب غياب T البندان، التهابات الخلايا التي يسببها Th17 هو غير المقيد ويؤدي إلى الباثولوجيا المناعية ضعيفة حلها. في المختبر المستمدة خلايا CD4 ساذجة الاستقطاب كما استخدمت خلايا Th17 لنقل بالتبني. 40 - 50٪ من CD4 + الخلايا مثقف تظهر IL-17A كشفها التعبير حول يوم 3 (خلايا Th17)، وبالتالي كانت تستخدم للحقن في الفئران. والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو أن خلايا Th17 تسبب الباثولوجيا المناعية محدد العدوى التي يمكن تحسينها بكفاءة مع حقن T ريج. وهكذا فإن النموذج يمكن استخدامها لاختبار استراتيجيات تعديل مناعي مع حقن T ريج كعنصر تحكم إيجابية. ويتم تقييم التهاب بسهولة بناء على فقدان الوزن، وسجل الأنسجة وإنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات من قبل خلايا Th17 من الفئران المصابة.
بعد رانه بالتبني نقل خلايا Th17، أنها هاجرت إلى أجهزة اللمفاوية الثانوية والأنسجة المختلفة بما في ذلك اللسان، والموقع الرئيسي للعدوى. بعد الإصابة، تم تجنيد خلايا التهابية أخرى أيضا على اللسان لمسح العدوى. ومع ذلك، من دون تعديل مناعي T ريج بوساطة خلايا Th17 أنفسهم لم يحل العدوى ولكنه تسبب في الباثولوجيا المناعية المتزايدة. شارك في نقل البندان T تحل تماما من الالتهاب. ومن المثير للاهتمام، والفئران مع التهاب المستفحل في غياب T البندان، كما أظهرت زيادة عبء الفطرية. أظهر تقريرنا السابق أن ذلك يرجع إلى انخفاض إنتاج IL-17A في الفئران، مقارنة مع تلك T البندان. تجاربنا الحالية تدعم فكرة أنه قد يكون أيضا نتيجة لزيادة TNF-α أن تفاقم الالتهاب، ربما عن طريق زيادة الخلايا الخلايا الظهارية وزيادة عبء الفطرية 28. وبالنظر إلى الآثار immunoprotective من IL-17A في الغشاء المخاطي، فإننا نعتقد أن أمراض التهابات التي نلاحظها مع زيادة عبء الفطرية لا يعود إلى IL-17A التي تنتجها خلايا Th17 أو عدم وجود مقاومة المضيف. ويتسبب ذلك بسبب TNF-α والسيتوكينات ربما غيرها الموالية للالتهابات التي تنتجها خلايا Th17 حقن. هذا ويمكن التصديق عليها من قبل ملاحظة أن خرقة - / - الفئران خالية من خلايا Th17 تظهر فقط التهاب الحد الأدنى وقرار لاحق من العدوى وفقط تلك التي حصلت استسلمت خلايا Th17 لفقدان الوزن الشديد (الشكل 1). متسقة لهذه البيانات، فقد تبين أيضا في وقت سابق ان خرقة - / - الفئران اضحة العدوى OPC الأساسي دون الكثير الباثولوجيا المناعية 27. في ظل هذه الظروف، وقد ثبت أن الآليات التعويضية تعتمد على IL-17A إنتاج الخلايا المناعية الفطرية لمسح العدوى في خرقة - / - الفئران 17،29،30. أخذت معا، على الرغم من IL-17A التي تنتجها خلايا Th17 والتوظيف العدلات تلعب دورا وقائيا في المراحل الأولى من العدوى، غير شاملإنتاج essive من TNF-α والسيتوكينات أخرى من قبل خلايا Th17، واستمرار وجود أسباب العدلات تفاقم الباثولوجيا المناعية. تبقى أدوار السيتوكينات الموالية للالتهابات إلى جانب TNF-α التي تنتجها خلايا Th17 للتحقيق معهم في سياق الباثولوجيا المناعية.
فإن القيود الرئيسية من هذا النموذج هو مسألة ما إذا كان ذلك هو ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لOPC البشري. على الرغم من أن تظهر خلايا Th17 ليكونوا وسطاء المرضية في العديد من أمراض الفم، سواء تفعيل مزمن في خلايا Th17 غير المسببة للأمراض في OPC لا يزال يتعين التحقيق فيها. مع النتائج الأخيرة مما يدل على دور C. البيض في الالتهابات والسرطان، Th17 الباثولوجيا المناعية في تجويف الفم هو حقل نشط التحقيق 31. وهكذا فإن النموذج الموضح هنا يمكن أن تستخدم لدراسة أكثر بعناية أدوار محددة من خلايا Th17 وكيفية تفاعلها مع الخلايا المناعية الفطرية، وإعطاء رؤى تفصيلية في الأمراض المناعية عن طريق الفم وسرطان الفم.
في خطوة حاسمة في هذه التقنية هي التوظيف والتوسع في خلايا Th17 نقل adoptively المناسب. هذا يعتمد إلى حد كبير على سلامة وIL-17A إنتاج في المختبر خلايا Th17 الاستقطاب قبل نقل. فمن الأفضل لاختبار جدوى إنتاج وخلوى من خلال التدفق الخلوي يحلل 19. والتنفيذ السليم لحقن الخلايا والفئران العدوى Th17 يؤدي إلى الإصابة يعتمد Th17 الباثولوجيا المناعية. ويمكن تطبيق هذا النموذج لاختبار استراتيجيات لإحباط Th17 الباثولوجيا المناعية والتهاب الفم في سياق الالتهابات الأخرى كذلك. أيضا، وذلك باستخدام هذا النموذج، يمكن للمرء أن أداء إعادة العدوى الثانوية ودراسة دور خلايا Th17 في تفاقم الباثولوجيا المناعية في سياق الالتهابات المزمنة. كما يتضمن هذا النموذج الفئران العوز المناعي، قد تكون ذات صلة جدا لdysbiosis عن طريق الفم ينظر في الإيدز وPID المرضى، الذين يعانون من التهابات متكررة المبيضات المزمنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CAF-2 | University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) | - | Candida culture |
| U-bottom 96 well plates | Fisher | 055588 | Used for cell culture |
| a-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| m-IL-6 | Bio Basic | RC232 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| h-TGF-b | R&D | 240-B | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IFN-g | eBiosciences | 16-7311-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IL-4 | eBiosciences | 16-7041-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| α-IL17A ef660 | eBiosciences | 50-7177-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| α-TNFa-PE-Cy7 | eBiosciences | 25-7423-41 | Used for cell culture - 1:100 |
| α-RORgt PE | eBiosciences | 12-6981-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium | Bio Basic | S507.SIZE | Mediium for candida growth |
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4300 | Incubation growth for candida |
| 15 ml tubes | Bio Basic | BT888-SY | Used for cell culture and candida growth |
| 50 ml tubes | Bio Basic | CT 788-YS | Used for cell culture and candida growth |
| Table top Centrifuge | VWR International LLC | 82017-654 | For pelleting candida -900 g |
| Allegra Centrifuge | Beckman Coulter | 392302 | Cell culture - 480 g |
| 1.5 ml eppendorf tubes | Bio Basic | BT620-NS | Preparing final concentration of candida |
| 2x paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixing candida for count |
| Hemocytometer | VWR International LLC | 15170-172 | Counting cells |
| PBS - Phosphate Buffered Saline | Bio Basic | PD8117 | Preparation of buffers |
| Ketamine/xylazine | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | Obtained from ARC approved protocol for anesthesia |
| Ophthalmic lubricant ointment | Allergan | - | Eye ointment for animals to prevent dryness |
| Saline (0.9% NaCl) | G Biosciences | 786-561 | Administerd to animals to prevent dehydration |
| 3-mm-diameter cotton wool ball | VWR International LLC | BP7603 | 3 mm balls for candida infection |
| Heat gel pads | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | for maintaining the body temperaturre and fast recovery |
| Hematoxylin and Eosin staining | Histoserv - MD | - | Tissue histology |
| 10% formalin | Electron Microscopy Sciences | JC1111/MC | Tissue histology |
| 70% ethanol | VWR International LLC | 97064-490 | Sterilization purpose |
| PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | Restimulation of cells |
| Ionomycin | Life Technologies | 124222 1mg | Restimulation of cells |
| Fixation permeabilization kit | eBiosciences | E16913-106 | Fixing cells for Flow cytometry |
| Tuberculin syringes | BD Biosciences | 309659 | Mice injection |
| 25 G x 3/8 needles | BD Biosciences | 309626 | Mice injection |
| Rag1 -/- mice | Jackson laboratories | Stock no: 002216 | Recipient mice |
| CD45.1 congenic mice | Jackson laboratories | Stock no:002014 | Donor Th17 cells |
| CB17-SCID mice | Jackson laboratories | Stock no: 001303 | Recipient mice |
| Balb/c mice | Jackson laboratories | Stock no: 000651 | Donor Th17 cells |
References
- Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
- Loesche, W. J. Periodontal disease: link to cardiovascular disease. Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).
- Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. Association between periodontal disease and stroke. Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).
- Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy. Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217 (2012).
- Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In. Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).
- Canabarro, A., et al. Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis. Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).
- Urzua, B., et al. Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets. Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).
- Ergun, S., et al. Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome. Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).
- Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment. Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).
- Gall, F., et al. Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions. The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).
- Grady, J. F., Reade, P. C. Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia. Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).
- Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia. Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).
- Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense. Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).
- Marodi, L., Johnston, R. B. Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms. Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).
- Kumamoto, C. A. Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In. Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).
- Kraneveld, E. A., et al. The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults. PloS One. 7 (8), e42770 (2012).
- Hernandez-Santos, N., et al. Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).
- Hasina, R., et al. ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis. Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).
- Pandiyan, P., et al. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model. Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).
- Pandiyan, P., et al. The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes. J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).
- Pandiyan, P., Lenardo, M. J. The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival. Biology Direct. 3 (6), (2008).
- Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells. Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al.
- Conti, H. R., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Kamai, Y., et al. New model of oropharyngeal candidiasis in mice. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).
- Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. Isolation of T cells from mouse oral tissues. Biological Procedures Online. 16 (1), 4 (2014).
- Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation. International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).
- Bishu, S., et al. The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).
- Quintin, J., et al. Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice. Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).
- Ramirez-Garcia, A., et al. Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression. Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).
