Protocol
NOTA: Los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con el comité de bienestar de los animales institucional (IACUC) directrices.
1. Reconstitución de la RAG-1 - / - ratones con células I n Vitro Cultivadas Th17 (Tres días antes de la infección)
- Para el establecimiento de las células Th17, cultura CD4 + CD25 CD44low CD62Lhigh células T naïve (3 x 104) en placas de 96 pocillos de fondo en U solo, o co-cultivo ellos junto con 3 x 104 células CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg en presencia de solubles α-CD3 (1 mg / ml), α-CD28 (2 g / ml) anticuerpos y células presentadoras de antígeno, en condiciones Th17 (polarizados usando IL-6 (25 ng / ml), TGF-β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 mg / ml) y α -IL-4 (2 mg / ml)) durante tres a cuatro días.
NOTA: Las células ingenuo y T regs fueron ordenados usando células activadas por fluorescencia (FACS) und procedimientos de aislamiento celular magnética y se cultivaron como se ha descrito previamente 19-22. - El día 4, después de resuspensión de las células Th17 utilizando la pipeta, recogerlos a partir de cultivos, y centrifúguelas en condiciones estériles.
- Tomar una pequeña alícuota de estas células para examinar su viabilidad y por el fenotipo. Resuspender en 500 l de medio RPMI, añadir yoduro de propidio (200 ng / ml) y evaluar su viabilidad inmediatamente por citometría de flujo. Realizar fenotipificación por citometría de flujo de evaluación de la producción de IL-17A después de la re-estimulación (ver sección 6.3).
- Centrifugar y lavar el grueso de las células en PBS estéril a 480 xg durante 6 min a 4 ° C en todos los pasos a menos que se especifique lo contrario.
- Utilice estas células para la transferencia adoptiva en 6-8 semanas de edad CD45.2 Rag1 - / - ratones inmunodeficientes.
- Resuspender las células a la densidad celular 1 x 10 7 células / ml usando PBS estéril frío.
- Inyectar 100 l de las células por intrapinyección eritoneal, utilizando 25 G agujas en 1 ml jeringas de tuberculina, de tal manera que un ratón recibe 1 x 10 6 células. Algunos ratones recibirán células PBS o Th17 solamente, y otros ratones recibirán las células Th17 que fueron co-cultivadas con células Treg.
NOTA: Realice todos los pasos de forma aséptica.
2. Crecimiento C. albicans para la infección (un día antes de la infección)
- Antes de la inoculación, dispersar cinco colonias de la CAF2-1 C. cepa albicans laboratorio en 100 l de suspensión de PBS estéril, y añadir la suspensión al caldo estéril.
- Inocular 5 colonias de la C. albicans en 50 ml de la base de nitrógeno de levadura (YNB sin aminoácidos) / Peptona medio / caldo de dextrosa y se incuba en un incubador agitador a 30 ° C durante 15-18 horas a 130 rpm.
- Monitorear el caldo de nubosidad, ya que es una indicación para el crecimiento del hongo.
3. CandidaLa cosecha y el procedimiento de conteo (En el Día de la infección)
- Recoger 10 ml de caldo de Candida en tubos de 15 ml. Para volúmenes mayores, recoger Candida en tubos de 50 ml.
- Centrifugar las blastosporas en 1900 xg durante 5 min a RT en todos los pasos a menos que se especifique lo contrario. Sedimentar las blastosporas por centrifugación, seguido por la eliminación del sobrenadante.
- Si hay más de un tubo, agrupar los blastosporas de Candida a partir de múltiples tubos, la adición de PBS estéril para los pellets y resuspender en 10 ml de PBS para el conteo.
- Tomar 20 l de blastosporas en 1,5 ml tubos de microcentrífuga, añadir 20 l de la paraformaldehído 2X e incubar a temperatura ambiente durante 15 a 20 min. Contar las blastosporas fijos utilizando el hemocitómetro bajo el microscopio.
NOTA: El paraformaldehido es cancerígeno. Abra la solución sin diluir sólo en la campana de humos. - Mientras tanto, repetir el lavado de las blastosporas al menos dos veces, por centrifugación tdobladillo en PBS, y la granulación las blastosporas. Mantenga las pastillas en tubos de 15 ml a temperatura ambiente, en la campana ABSL1, listas para la infección.
- Deje algo de PBS estéril a temperatura ambiente durante la resuspensión de las blastosporas de infección.
- Después de contar, añadir PBS estéril al sedimento blastospore para ajustar el número de células de levadura blastosporo a 2 x10 8 de levadura células / ml. Esta es la suspensión blastospore que se utilizó para infectar los ratones.
NOTA: Realice todos los pasos de forma aséptica.
4. Los ratones Infección (3-5 días después de la transferencia de la célula)
NOTA: El procedimiento básico infección se realizó como se describió anteriormente 19,23-25.
- Pese la RAG-1 - / - ratones que recibieron PBS o las células tres días antes.
- Calcular la dosis de los agentes anestésicos que utilizan su peso corporal. Anestesiar a los ratones mediante la administración de ketamina / mezcla de xilazina (16,1 mg / ml y 1,6 mg / ml), utilizando 25 g de agujas en 1 ml jeringas de tuberculina, por intrinyección aperitoneal.
- Administrar 50 l por 10 gramos de peso corporal. (Es decir, 0,8 mg de ketamina y 0,08 mg de xilazina / 10 g de peso corporal o 80 mg de ketamina y 8 mg de xilazina por kg de peso corporal, respectivamente). Observe la respuesta pizca dedo cada 15 minutos después de la anestesia.
NOTA: Esta dosis inducirá 60-90 min de la anestesia, lo cual es suficiente para el procedimiento de infección. - Aplique el ungüento lubricante oftálmica a los ojos de los ratones para evitar las córneas se sequen. A medida que el lubricante ocular podría secarse y repetir lubricación oftálmica cada 45 min.
- Administrar 50 l por 10 gramos de peso corporal. (Es decir, 0,8 mg de ketamina y 0,08 mg de xilazina / 10 g de peso corporal o 80 mg de ketamina y 8 mg de xilazina por kg de peso corporal, respectivamente). Observe la respuesta pizca dedo cada 15 minutos después de la anestesia.
- Inyectar 1 ml de solución salina (0,9% NaCl) por vía subcutánea en la parte posterior adyacente a la extremidad anterior, para ayudar a la rehidratación de los ratones durante la anestesia.
- Obtener una nueva, jaula limpia. Siga la infección procedimiento de un ratón a la vez, la colocación de cada ratón en la nueva jaula una vez infectados. Realice la infección PBS / farsa primero, y luego proceder a las gro de infección por Candidaups.
- Coge el ratón anestesiado y abrir la boca para revelar la base de la lengua.
- Coloque una bola de algodón diámetro 3 mm saturado con 50 l de PBS o blastospore suspensión, por vía sublingual en la cavidad oral durante 90 min. Da la vuelta al ratón todos los frentes 15 min y la espalda para evitar la congestión pulmonar, lo que garantiza que las bolas de algodón no se mueven.
- Establecer un temporizador para cada ratón para asegurar 90 min de Sham o Candida inoculación en la cavidad oral.
- Manténgalos en una jaula bajo la lámpara de calor (4 metros de distancia), y cada ratón sobre almohadillas de gel de calor.
- Asegúrese de que la lengua se retira dentro y fuera de los dientes, para evitar los dientes lacerantes la lengua.
- Al final de 90 minutos, retire la bola de algodón de la boca del ratón. Esté atento a cualquier ratón que pueden recuperarse de la anestesia antes de 75 minutos. En tal caso, anestesiar a ellos de nuevo con ketamina (40 mg / kg) solamente.
5. Publicar Procedure Monitoreo (durante los 90 minutos de anestesia)
- Use almohadillas de gel de calor durante la anestesia 90 min.
- Para mantener la temperatura del cuerpo y para evitar la asfixia, no permita que los ratones que se recuperan en la ropa de cama regular de ratón mazorca de maíz.
- Después de la recuperación de la anestesia, administrar un adicional de 1 ml de solución estéril de NaCl al 0,9% por vía subcutánea en dos lugares en la parte posterior.
- Infórmate de los cinco PBS (simulado) los ratones inoculados por jaula. Casa sólo 1-2 ratones infectados por jaula.
- Llene la tarjeta de procedimiento con las iniciales todos los días después del procedimiento para anotar los cambios en el peso corporal, hábitos de aseo y la salud en general.
6. Evaluación de la inflamación
6.1) La pérdida de peso
- Pesar los ratones cada día durante la infección, comenzando en el día antes del procedimiento infección.
NOTA: Por lo general, los ratones inmunodeficientes inyectados con células Th17 y sin T regs sucumben a 20Pérdida de peso -30% debido al aumento de la carga de hongos 19 y exacerba la inflamación.
6.2) Histología de puntuación de la lengua
- Sacrificar los ratones por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical.
- Abra las mordazas y diseccionar la lengua con tijeras y pinzas. El uso de fórceps romos para sostener la lengua, y el uso de las tijeras llegan a la parte posterior de la boca para incidir el extremo posterior de la lengua.
- Para hematoxilina inmuno y eosina (H & E) tinción de los tejidos de la lengua, enjuague los tejidos de la lengua con helado de PBS. Añadir 5 ml de formalina al 10% durante 2-3 lenguas y fijarlos O / N en tubos de 15 ml.
- Al día siguiente, eliminar el formol y sumergir los tejidos en 5 ml de etanol al 70% para evitar la hiper-fijación. Enviarlos a un servicio comercial para continuar con la inclusión en parafina, corte y tinción de secciones de parafina.
NOTA: El servicio de histología comercial se utiliza para realizar estos pasos. - Una vez que los portaobjetos están de vuelta desde el servicio de histología comercial, el grado de la inflamación mediante la observación de las secciones de tejido bajo un microscopio de luz.
- Puntuación de 0 a 5, siendo 0 ausencia de inflamación, y 5 la inflamación más severa. Partitura la inflamación usando la Tabla 1.
6.3) La producción de citocinas por las células Th17
NOTA: la producción de TNF-α excesiva es una de las lecturas para inmunopatología excesivas. Cuando los ratones se transfieren adoptivamente con células Th17 sólo, hace que la inmunopatología que está asociada con la producción excesiva de TNF-α en células Th17.
- Recoger una suspensión de células de bazo, los ganglios linfáticos cervicales, ganglios linfáticos axilares, y la lengua, usando métodos descritos previamente 19,26.
- Reestimular las células con miristato acetato de forbol (PMA) (50 ng / ml) e ionomicina (500 ng / ml) durante 4 h con Brefeldina A (10 mg / ml) añadido en el last 2 hr. Lavar las células con PBS y fijarlos utilizando un kit de fijación / permeabilización comercial según las instrucciones del fabricante.
- Realizar tinción de citoquinas intra celular utilizando el anti-TNF-α conjugados con fluorocromo, anti-IL-17A y anticuerpos ROR-γt como se describió anteriormente 19.
- Brevemente, resuspender las células en el tampón de permeabilización 1X con el cóctel de anticuerpos anti-TNF-α, los anticuerpos ROR-γt anti-IL-17A y, cada anticuerpo a 2-3 mg / ml de concentración final.
- Se incuban las células durante 1 hora a RT.
- Después de la incubación, se lavan las células con tampón de permeabilización 1X.
- Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS con 0,5% de albúmina de suero bovino para citometría de flujo análisis.
- Al día siguiente, eliminar el formol y sumergir los tejidos en 5 ml de etanol al 70% para evitar la hiper-fijación. Enviarlos a un servicio comercial para continuar con la inclusión en parafina, corte y tinción de secciones de parafina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En este modelo, tanto los ratones infectados con Candida y ratones no infectados en RAG-1 - / - de fondo inmunodeficiente se transfirieron de forma adoptiva con células Th17 3-5 días antes de la infección. Un total de 10-12 ratones fueron utilizados para los experimentos, con 2 ratones en cada Sham infectados grupos y 4-5 en cada uno de los grupos infectados Candida. Naive células se obtuvieron a partir Thy1.1 o CD45.1 congenic ratones, de modo que las células Th17 inyectados fueron rastreados in vivo usando Thy1.1 o CD45.1 tinción respectivamente (Figura 1A). T regs Co-transferido se derivaron de ratones CD45.2 para distinguirlas de las células Th17 CD45.1. Para algunos experimentos, CB-17 scid Thy1.2 ratones receptores, se utilizaron células Th17 donantes obtenidas de ratones Thy1.1 Balb / C y regs T obtenidas de ratones Thy1.2 congenic. Sólo Candida infectados los ratones, pero no los ratones no infectados exhibió el reclutamiento y la expansión de CD45.1 + reconstituida (Figura 1A). Los resultados representan los datos de un ratón en cada grupo.
Sólo en los ratones que se transfirió-co con T regs, se detectaron células CD4 negativo Foxp3 + CD45.1 + en el CLN. Esto demuestra que los regs T inyectadas también fueron reclutados para el sitio de infección (Figura 1B). Los resultados representan los datos de un ratón en cada grupo. Considerando infectado RAG-1 - / - perder peso y recuperado después de 4 días de la infección, los ratones inmunosuprimidos cortisona no se recuperó pero más perdido peso, como se indica anteriormente 27. Tanto los grupos de ratones que recibieron las células Th17 en presencia o ausencia de T regs perdieron peso inicialmente. Sin embargo, los ratones que recibieron regs T recuperados de la pérdida de peso y se resolvieron la infección. 2 mhielo se utilizaron en el grupo Sham infectados, y 4 en cada grupo de pacientes infectados por Candida. Había 3 ratones en el grupo de cortisona. Los ratones que recibieron células Th17 solamente, perdieron peso progresivamente (Figura 2) 19. Algunos de los ratones en ese grupo tuvieron que ser sacrificados. Estos resultados muestran la media de los pesos de todos los ratones en dicho grupo. Aunque se requieren neutrófilos para la autorización inicial de la infección, su presencia continua y la contratación en el tejido es un signo de inflamación sin resolver. Por lo tanto la infiltración de neutrófilos se examinó en la lengua infectada, mediante la determinación de la expresión de un marcador de neutrófilos, Gr-1, en puntos de tiempo posteriores tales como el día 7 después de la infección. Los ratones que recibieron las células Th17 solamente, tenía infiltrados inflamatorios superiores (Figura 3A), incluyendo Gr-1 + neutrófilos incluso días-4 después de la infección, en comparación con los ratones inyectados con regs T (Figura 3B). Estos resultados mostraron que en el presence de T regs, los ratones resuelto la inflamación de manera más eficiente y se recuperó de la infección.
En el día 7 después de la infección, se aislaron los tejidos del bazo (SPLN), CLN y la lengua, y suspensiones de células individuales se hicieron para el flujo de análisis de citometría. CLN reveló aumento de células CD45.1 Th17 (Figura 1) y la producción de TNF-α mayor (Figura 4A, 4B) en ratones que recibieron sólo las células Th17. Por otra parte, T reg receptores mostraron disminución de la frecuencia de las células Th17 y la producción de TNF-α reducido por las células Th17 (Figura 1 y 4A, 4B). En estos experimentos, se muestran los datos de CLN de un solo ratón, y los tejidos de la lengua cosechadas y agrupados de 2 ratones. Aunque en puntos de tiempo tempranos producción de IL-17A fue mayor en T reg receptores 19, en puntos de tiempo posteriores en ambos grupos, la producción de IL-17A por las células Th17 era mínima (datos no mostrados). Tinción de ácido periódico de Schiffde la lengua mostraron aumento de hifas de los hongos en los ratones que recibieron sólo las células Th17, mientras que los ratones que recibieron T regs así borran el hongo en el día-5 y día-7 después de la infección (Figura 5). Por otra parte, la puntuación histopatología de la inflamación de la lengua también mostró puntuaciones de inflamación reducidos en los ratones que recibieron T regs, en comparación con los ratones que recibieron sólo las células Th17 (Figura 6). Clasificación de la inflamación se basa en los parámetros histopatológicos tales como la lengua, la presencia de papilas, la integridad de la capa superficial del epitelio, la levadura visible o hifas, la invasión de hifas que indica la infección no resolver, engrosamiento de la capa basal (indicativo de la reparación del tejido en curso), y la presencia de la infiltración de células inmunes (neutrófilos y células Th17). Estos resultados demostraron que la inyección de células Th17 no reducir directamente la infección, pero aumentó la carga de hongos e inmunopatología primaria causada por C. albicans infecciónción, en tanto que co-transferencia de T regs mejorado inmunopatología.
Figura 1. inyectado células Th17 y células T reg reclutan y se expanden en los ganglios linfáticos de drenaje (CLN) de la C albicans infectaron ratones (A) Trapo-1 -.. / - Ratones CD45.2 fueron reconstituidos con células Th17 Th17 o + T reg células que se polarizan en condiciones Th17 durante 5 días. Células Th17 se obtuvieron de ratones congenic CD45.1 y células T reg fueron obtenidas de ratones CD45.2. Algunos ratones no recibieron ninguna célula (Sham o Candida + PBS). Los ratones receptores en cada grupo se infectaron con controles simulados o con C. albicans. En el día 5 después de la infección, CLN estaban isolated para hacer una suspensión de células individuales y realizar el seguimiento del CD45.1 inyectado expresando células Th17 por citometría de flujo (cerrada en todos los leucocitos en FSC, dispersión SSC) (B) Trapo-1 -. / - CD45.2 ratones fueron reconstituidos con células Th17 o se aislaron las células T reg Th17 + como en "A" y la infección con C. albicans. CLN para hacer una suspensión de células individuales y medir CD45.1 y expresión Foxp3 intracelular por citometría de flujo (cerrada en todas las células CD4). Las puertas T reg en los gráficos muestran la CD45.1 negativo, las células Foxp3 + CD4 +. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. inyectado células Th17 causan pérdida de peso en C . Albicans ratones infectados y co-administración de T regs mejora la recuperación de la pérdida de peso. SCID CB-17 ratones fueron reconstituidos con células Th17 o células T reg Th17 + como en la figura 1A. 3 días más tarde, los ratones receptores fueron infectados con C. albicans. Algunos ratones en cada grupo se infectaron con controles simulados. Ratones inmunodeprimidos recibieron acetato de cortisona inyección (Cort). El porcentaje de cambio de peso en ratones reconstituidos con células indicadas y infectados con C. albicans, con respecto a d-1 (un día antes de la infección) se muestra. Se normalizaron los datos con respecto a los datos de peso de (Sham + PBS) ratones no infectados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
"Src =" / files / ftp_upload / 52538 / 52538fig3highres.jpg "/>
Figura 3. inyectado células Th17 causan lengua inmunopatología en C. Albicans infectaron ratones y co-administración de T regs reduce la inmunopatología. La evaluación histológica de las lenguas de la C. albicans ratones infectados. Los ratones se reconstituyeron con células infectadas indicados y como en la Figura 1A. En el día 5 después de la infección, las lenguas fueron aisladas de ratones. (A) secciones sagitales de las lengüetas se tiñeron con H & E para evaluar la inflamación y la infiltración (IF) de las células inmunes. (Pa) y (Ep) denotan papilas y la capa epitelial de la lengua respectivamente. Imágenes microscópicas de las diapositivas que han visto aumentos at50X. (B) inmunotinción histológico de Gr-1 de neutrófilos marcador utilizando anti Gr-1 anticuerpo (Clone: 1A8-Ly6G) en las secciones de la lengua en el día 5 después de la infección (marrón, denotado por IF). Imágenes microscópicas de las diapositivas que han visto a un aumento de 100X se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La administración conjunta de T regs reduce TNF-α en células Th17 inyectados. (A) RAG-1 - / - ratones CD45.2 se reconstituyeron con células Th17 o células T reg Th17 + y se infectaron con C. albicans como en la figura 1A. El día 5 después de la infección, se aislaron tejidos CLN y la lengua para hacer una suspensión de células individuales. Estas células se volvieron a estimular con PMA e ionomicina antes staini intracelularng y análisis de citometría de flujo. Parcelas de citometría de flujo intracelular de contorno de ROR-γt y TNF-α expresión de las células Th17 se muestran (cerrada en células CD4 +). (B) la representación estadística del porcentaje de células TNFαpositive partir de experimentos realizados como en "A". Los datos representan 4 ratones del grupo no infectado, y 6 ratones en cada grupo de pacientes infectados, y se agrupan de dos experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Aumento de la inmunopatología también se asocia con un aumento de la carga de hongos en C. Albicans infectaron ratones. CB-17 scid mice fueron reconstituidos con células Balb / C Th17, o células T reg Th17 + como en Figure1A, y estaban infectados con C. albicans. Se muestra la evaluación histológica de la lengua de los ratones infectados. En el día 7 después de la infección, las lenguas se cosecharon y se tiñeron con ácido periódico de Schiff (PAS) para evaluar las lesiones fúngicas, la inflamación y la infiltración (IF) de las células, y para detectar hongos (Ca). Las diapositivas se vieron aumentos at100X. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. T regs mejoran inmunopatología en C. Albicans ratones infectados. scid fueron reconstituidos con células Balb / C Th17, o células T reg Th17 + como en la Figura 1A, y fueron infectados con C. albicans. Representación estadística de las puntuaciones medias histológicos de las lenguas de los ratones infectados evaluados como en la Figura 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Puntuación | Características |
| 0 | 0 - no visible de levadura o hifas, el epitelio superficial intacta en la superficie dorsal de la lengua, papilas claramente presente y en buen estado (puede o no ser la infiltración de células mononucleares en el tejido), sin engrosamiento de la capa basal, no hay células inmunes infiltrantes. |
| 1 | 1 - sin levadura visible o hifae, desigual o epitelio superficial ligeramente dañado, papilas claramente presente con daños mínimos y las células inmunes que infiltran poco frecuentes. |
| 2 | 2 - papilas reducida pero presente con el daño, el engrosamiento de la capa basal y las células inmunes que infiltran frecuentes. |
| 3 | 3 - grupos ocasionales de levadura visible y hifas invasor, evidencia de papilas dañado, lesiones ocasionales de epitelio dañado, engrosamiento de la capa basal y y pequeños grupos de la infiltración de células inmunes. |
| 4 | 4 - racimos frecuentes de levadura visible y hifas invasor, evidencia de papilas dañado, lesiones frecuentes de epitelio dañado, mínima infiltración de células inmunes, engrosamiento de la capa basal y agrupaciones frecuentes de la infiltración de células inmunes. |
| 5 | 5 - amplia evidencia de la invasión de hifas, epitelio muy dañado por la superficie dorsal, gran infiltración decélulas inmunes, pocas o ninguna papilas detectable, engrosamiento de la capa basal y racimos muy frecuentes y grandes de la infiltración de células inmunes. |
Tabla 1: Valores de Puntuación Histológico
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este modelo se basa en la inducción de C. Oral infección albicans inflamación dependiente Th17. Debido a la ausencia de T regs, la inflamación de células Th17 inducida es desenfrenada y conduce a la inmunopatología mal resuelto. In vitro derivan las células CD4 naive polarizados ya que se utilizaron células Th17 para la transferencia adoptiva. 40 - 50% de las células CD4 + cultivadas muestran detectable la expresión de IL-17A alrededor de 3 días (células Th17), y por lo tanto se utilizaron para la inyección en ratones. La principal ventaja de este modelo es que las células Th17 causan inmunopatología específica infección que puede ser mejorado de manera eficiente con la inyección de T reg. Así, el modelo se puede emplear para poner a prueba las estrategias de inmunomodulación con inyección T reg como control positivo. La inflamación se evalúa fácilmente sobre la base de la pérdida de peso, la puntuación histopatológico y la producción de citocinas proinflamatorias por las células Th17 de los ratones infectados.
Después de tél adoptivos transferencia de células Th17, que emigró a los órganos linfoides secundarios y diversos tejidos, incluyendo la lengua, el sitio primario de la infección. Después de la infección, otras células inflamatorias también fueron reclutados a la lengua para eliminar la infección. Sin embargo, sin la inmunomodulación T reg mediada, las células Th17 sí mismos no resuelven la infección, pero causaron inmunopatología aumentada. Co-transferencia de T regs resolvió completamente la inflamación. Curiosamente, los ratones con inflamación exacerbada en ausencia de T regs, también mostraron un aumento de la carga de hongos. Nuestro informe anterior mostró que esto se debió a la reducción de la producción de IL-17A en ratones, en comparación con aquellos con T regs. Nuestros experimentos actuales apoyan la idea de que también puede ser debido al aumento de TNF-α que empeoró la inflamación, posiblemente por el aumento de la apoptosis de las células epiteliales y el aumento de la carga de hongos 28. Considerando los efectos inmunoprotectores de IL-17A en la mucosa, Creemos que la patología inflamatoria que se observa con el aumento de la carga de hongos no es debido a IL-17A producida por las células Th17 o la falta de resistencia del huésped. Es causada debido a TNF-α y posiblemente otras citoquinas pro-inflamatorias producidas por las células Th17 inyectados. Esto puede ser validada por la observación de que Rag - / - ratones desprovistos de células Th17 mostrar sólo una mínima inflamación y posterior resolución de la infección y sólo aquellos que recibieron las células Th17 sucumbieron a la pérdida severa de peso (Figura 1). De acuerdo a estos datos, también se ha demostrado previamente que Rag - / - ratones eliminan la infección primaria OPC sin mucho inmunopatología 27. En estas condiciones, se ha demostrado que los mecanismos de compensación dependiente de IL-17A producir células inmunitarias innatas para eliminar la infección de Trapo - / - ratones 17,29,30. Tomados en conjunto, aunque la IL-17A producido por las células Th17 y el reclutamiento de neutrófilos juegan un papel protector en las fases iniciales de la infección, excproducción essive de TNF-α y otras citocinas por células Th17, y la continua presencia de neutrófilos causas exacerbada inmunopatología. Las funciones de las citoquinas pro-inflamatorias TNF-α además producida por las células Th17 aún no se han investigado en el contexto de la inmunopatología.
La principal limitación de este modelo es la cuestión de si es fisiológicamente relevante para OPC humano. Aunque las células Th17 se demuestra que son mediadores patológicos en varias enfermedades orales, si la activación crónica de las células Th17 es patógena en OPC aún no se han investigado. Con los recientes hallazgos implican el papel de C. albicans en la inflamación y el cáncer, Th17 inmunopatología en la cavidad oral es un campo activo de investigación 31. Así, el modelo que se describe aquí se puede utilizar para estudiar con más cuidado los roles específicos de células Th17 y cómo interactúan con las células inmunes innatas, dando una detallada comprensión de las enfermedades inmunológicas orales y el cáncer oral.
El paso crítico en la técnica es el reclutamiento y la expansión de las células Th17 adoptiva transferidos apropiado. Esto es altamente dependiente de la viabilidad y la IL-17A de producción de las células Th17 polarizadas in vitro antes de la transferencia. Lo mejor es probar su viabilidad y producción de citoquinas por citometría de flujo análisis 19. La correcta ejecución de la inyección de células y ratones infección Th17 conducirá a la infección depende inmunopatología Th17. Este modelo se puede aplicar a probar estrategias para frustrar Th17 inmunopatología y la inflamación oral en el contexto de otras infecciones. Además, el uso de este modelo, uno puede realizar re-infecciones secundarias y estudiar el papel de las células Th17 en la exacerbación de la inmunopatología en el contexto de las infecciones crónicas. Como este modelo implica ratones inmunodeficientes, puede ser muy relevante para disbiosis orales visto en pacientes con SIDA y PID, que sufren de infecciones recurrentes crónicas Candida.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CAF-2 | University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) | - | Candida culture |
| U-bottom 96 well plates | Fisher | 055588 | Used for cell culture |
| a-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| m-IL-6 | Bio Basic | RC232 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| h-TGF-b | R&D | 240-B | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IFN-g | eBiosciences | 16-7311-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IL-4 | eBiosciences | 16-7041-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| α-IL17A ef660 | eBiosciences | 50-7177-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| α-TNFa-PE-Cy7 | eBiosciences | 25-7423-41 | Used for cell culture - 1:100 |
| α-RORgt PE | eBiosciences | 12-6981-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium | Bio Basic | S507.SIZE | Mediium for candida growth |
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4300 | Incubation growth for candida |
| 15 ml tubes | Bio Basic | BT888-SY | Used for cell culture and candida growth |
| 50 ml tubes | Bio Basic | CT 788-YS | Used for cell culture and candida growth |
| Table top Centrifuge | VWR International LLC | 82017-654 | For pelleting candida -900 g |
| Allegra Centrifuge | Beckman Coulter | 392302 | Cell culture - 480 g |
| 1.5 ml eppendorf tubes | Bio Basic | BT620-NS | Preparing final concentration of candida |
| 2x paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixing candida for count |
| Hemocytometer | VWR International LLC | 15170-172 | Counting cells |
| PBS - Phosphate Buffered Saline | Bio Basic | PD8117 | Preparation of buffers |
| Ketamine/xylazine | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | Obtained from ARC approved protocol for anesthesia |
| Ophthalmic lubricant ointment | Allergan | - | Eye ointment for animals to prevent dryness |
| Saline (0.9% NaCl) | G Biosciences | 786-561 | Administerd to animals to prevent dehydration |
| 3-mm-diameter cotton wool ball | VWR International LLC | BP7603 | 3 mm balls for candida infection |
| Heat gel pads | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | for maintaining the body temperaturre and fast recovery |
| Hematoxylin and Eosin staining | Histoserv - MD | - | Tissue histology |
| 10% formalin | Electron Microscopy Sciences | JC1111/MC | Tissue histology |
| 70% ethanol | VWR International LLC | 97064-490 | Sterilization purpose |
| PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | Restimulation of cells |
| Ionomycin | Life Technologies | 124222 1mg | Restimulation of cells |
| Fixation permeabilization kit | eBiosciences | E16913-106 | Fixing cells for Flow cytometry |
| Tuberculin syringes | BD Biosciences | 309659 | Mice injection |
| 25 G x 3/8 needles | BD Biosciences | 309626 | Mice injection |
| Rag1 -/- mice | Jackson laboratories | Stock no: 002216 | Recipient mice |
| CD45.1 congenic mice | Jackson laboratories | Stock no:002014 | Donor Th17 cells |
| CB17-SCID mice | Jackson laboratories | Stock no: 001303 | Recipient mice |
| Balb/c mice | Jackson laboratories | Stock no: 000651 | Donor Th17 cells |
References
- Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
- Loesche, W. J. Periodontal disease: link to cardiovascular disease. Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).
- Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. Association between periodontal disease and stroke. Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).
- Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy. Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217 (2012).
- Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In. Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).
- Canabarro, A., et al. Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis. Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).
- Urzua, B., et al. Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets. Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).
- Ergun, S., et al. Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome. Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).
- Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment. Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).
- Gall, F., et al. Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions. The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).
- Grady, J. F., Reade, P. C. Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia. Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).
- Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia. Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).
- Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense. Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).
- Marodi, L., Johnston, R. B. Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms. Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).
- Kumamoto, C. A. Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In. Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).
- Kraneveld, E. A., et al. The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults. PloS One. 7 (8), e42770 (2012).
- Hernandez-Santos, N., et al. Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).
- Hasina, R., et al. ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis. Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).
- Pandiyan, P., et al. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model. Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).
- Pandiyan, P., et al. The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes. J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).
- Pandiyan, P., Lenardo, M. J. The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival. Biology Direct. 3 (6), (2008).
- Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells. Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al.
- Conti, H. R., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Kamai, Y., et al. New model of oropharyngeal candidiasis in mice. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).
- Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. Isolation of T cells from mouse oral tissues. Biological Procedures Online. 16 (1), 4 (2014).
- Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation. International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).
- Bishu, S., et al. The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections. Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).
- Quintin, J., et al. Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice. Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).
- Ramirez-Garcia, A., et al. Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression. Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).
