Protocol
NOTA: Os experimentos com ratos foram realizados de acordo com o animal institucional comitê de bem-estar (IACUC) orientações.
1. Reconstituição da Rag-1 - / - Os ratos com células I n Vitro Cultivadas Th17 (três dias antes da infecção)
- Para o estabelecimento de células Th17, cultura de células CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- células T ingénuas (3 x 104) de fundo em U em placas de 96 poços, sozinho ou co-cultura eles, juntamente com 3 x 104 células T CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs na presença de solúvel α-CD3 (1 ug / ml), α-CD28 (2 ng / ml) de anticorpos e células apresentadoras de antigénio, sob condições Th17 (polarizadas usando IL-6 (25 ng / mL), TGF-β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) e α -IL-4 (2 ng / ml)) durante três a quatro dias.
NOTA: células ingênuo e regs T foram classificados usando fluorescência de células activadas (FACS) umad procedimentos de isolamento de células magnético e cultivadas como descrito anteriormente 19-22. - No dia 4, depois de re-suspender as células Th17, utilizando a pipeta, recolher-los a partir de culturas, e centrifugar-las em condições estéreis.
- Tomar uma pequena alíquota destas células para examinar a sua viabilidade e para fenotipagem. Ressuspender-los em 500 ul de meio RPMI, adicionar iodeto de propídio (200 ng / ml) e avaliar a sua viabilidade imediatamente por citometria de fluxo. Execute fenotipagem por citometria de fluxo avaliação da produção de IL-17A após restimulação (ver secção 6.3).
- Centrifugar e lavar o grosso das células em PBS estéril a 480 xg durante 6 minutos a 4 ° C em todas as etapas, a menos que especificado de outra forma.
- Use essas células para transferência adotiva em 6-8 semanas de idade CD45.2 RAG1 - / - ratos imunodeficientes.
- Ressuspender as células a 1 x 10 7 células / ml de densidade celular utilizando PBS estéril frio.
- Injectar 100 ul de células por intraperitoneal injecção, utilizando agulhas 25 G em seringas de 1 ml de tuberculina, de tal modo que um ratinho receber 1 x 10 6 células. Alguns ratos receberão células Th17 PBS ou somente, e outros ratos receberão células Th17 que foram co-cultivados com células Treg.
Observação: executar todos os passos de forma asséptica.
2. Crescer C. albicans para a infecção (um dia antes da infecção)
- Antes da inoculação, dispersar cinco colônias do CAF2-1 C. albicans estirpe laboratorial em 100 ul de suspensão de PBS estéril e adicionar a suspensão ao caldo estéril.
- Inocular 5 colônias de C. albicans em 50 ml de base de azoto de levedura (YNB sem aminoácidos) / peptona / meio de caldo de dextrose e incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C durante 15-18 horas a 130 rpm.
- Monitorar o caldo para a opacidade, uma vez que é uma indicação para o crescimento do fungo.
3. CandidaColheita e Counting Procedimento (No dia da infecção)
- Recolha de 10 ml de caldo de Candida em tubos de 15 ml. Para volumes maiores, coletar Candida em tubos de 50 ml.
- Centrifugar os blastosporos a 1900 xg durante 5 min à temperatura ambiente em todas as etapas, a menos que especificado de outra forma. Agregar as blastosporos por centrifugação, seguida pela remoção do sobrenadante.
- Se houver mais do que um tubo, reunir os blastosporos Candida a partir de múltiplos tubos, adicionando PBS estéril para os peletes e ressuspender-los em 10 ml de PBS para contagem.
- Tomar 20 ul de blastosporos em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 20 uL de paraformaldeído a 2X e incubar à temperatura ambiente durante 15-20 min. Contagem blastosporos fixos usando o hemocitômetro sob o microscópio.
NOTA: O paraformaldeído é cancerígeno. Abrir a solução não diluída apenas na hotte. - No entretanto, repetir a lavagem dos blastosporos pelo menos duas vezes, por centrifugação them em PBS, e peletização blastosporos. Manter os peletes em tubos de 15 ml à temperatura ambiente, na capa ABSL1, prontos para a infecção.
- Deixar alguns PBS estéril à temperatura ambiente durante ressuspensão dos blastosporos para a infecção.
- Após a contagem, adicionar PBS estéril para o sedimento blastosporo para ajustar o número de células de levedura blastosporo a 2 x10 8 de levedura células / ml. Esta é a suspensão blastosporo que será utilizado para infectar os ratinhos.
Observação: executar todos os passos de forma asséptica.
4. Ratos Infection (3-5 dias após a transferência celular)
NOTA: O procedimento básico infecção é realizada como descrito anteriormente 19,23-25.
- Pesar o Rag-1 - / - ratos que receberam PBS ou as células três dias antes.
- Calcula-se a dose de agentes anestésicos, utilizando o seu peso corporal. Anestesiar os ratos por administração de cetamina / xilazina mistura (16,1 mg / ml e 1,6 mg / ml), utilizando agulhas 25 G em seringas de 1 ml de tuberculina, por intrinjeção aperitoneal.
- Administrar 50 ul por 10 gramas de peso corporal. (Ou seja, 0,8 mg de cetamina e 0,08 mg de xilazina / 10 g de peso corporal ou 80 mg de cetamina e de xilazina 8 mg por kg de peso corporal, respectivamente). Observar o desenvolvimento de resposta toe pitada a cada 15 minutos após a anestesia.
NOTA: Esta dosagem irá induzir 60-90 min da anestesia, o que é suficiente para o procedimento de infecção. - Aplicar a pomada lubrificante oftálmico aos olhos dos ratinhos para evitar que as córneas de secar. Como o lubrificante ocular pode secar, repita lubrificação oftálmica a cada 45 min.
- Administrar 50 ul por 10 gramas de peso corporal. (Ou seja, 0,8 mg de cetamina e 0,08 mg de xilazina / 10 g de peso corporal ou 80 mg de cetamina e de xilazina 8 mg por kg de peso corporal, respectivamente). Observar o desenvolvimento de resposta toe pitada a cada 15 minutos após a anestesia.
- Injectar 1 mL de solução salina (NaCl a 0,9%) por via subcutânea no lado de trás do membro anterior, para ajudar a re-hidratação dos ratos durante a anestesia.
- Obter uma nova gaiola, limpo. Siga o procedimento de uma infecção do mouse em um momento, colocando cada rato na gaiola nova, uma vez infectado. Realize a infecção PBS / sham em primeiro lugar, e depois prosseguir para as gro infecção por Candidaups.
- Pegue o rato anestesiado e abra a boca para revelar a base da língua.
- Coloque uma bola de algodão 3 mm de diâmetro saturado com 50 ul de PBS ou blastosporo suspensão, sublingualmente na cavidade oral durante 90 min. Virar os ratos a cada 15 minutos frente e de trás para evitar congestão pulmonar, garantindo que as bolas de algodão não se movem.
- Configurar um temporizador para cada rato para garantir 90 min de Sham ou Candida inoculação na cavidade oral.
- Mantê-los em uma gaiola sob a lâmpada de calor (4 metros de distância), e cada mouse sobre almofadas de gel de calor.
- Certifique-se de que a língua é retirado dentro e longe dos dentes, para evitar dentes dilacerante da língua.
- No final de 90 minutos, retire a bola de algodão da boca do mouse. Preste atenção para qualquer rato que pode recuperar da anestesia mais cedo do que 75 minutos. Em tal caso, anestesiar-los novamente com cetamina (40 mg / kg) apenas.
5. Publicar Procedure Monitoramento (durante a anestesia 90 min)
- Use almofadas de gel de calor durante a anestesia 90 min.
- Para manter a temperatura do corpo e para evitar sufocamento, não permitem que os ratos se recuperar no mouse cama sabugo de milho regular.
- Após a recuperação da anestesia, administrar um adicional de 1 ml de NaCl a 0,9% esterilizado subcutaneamente em dois locais no dorso.
- Mantenha-se cinco PBS (sham) camundongos inoculados por gaiola. Casa apenas 1-2 camundongos infectados por gaiola.
- Preencha o cartão de procedimento com as iniciais todos os dias após o procedimento para anotar as mudanças no peso corporal, higiene hábitos e saúde em geral.
6. Avaliação da Inflamação
6.1) A perda de peso
- Pesar os ratinhos todos os dias durante a infecção, começando no dia anterior ao processo de infecção.
NOTA: Normalmente, os ratos imunodeficientes injetados com células Th17 e sem regs T sucumbir a 20-30% De perda de peso devido ao aumento da carga fúngica 19 e exacerbado inflamação.
6.2) pontuação Histologia da língua
- Sacrifício dos ratinhos por asfixia com CO 2, seguida por deslocação cervical.
- Abra as mandíbulas e dissecar a língua com tesouras e pinças. Use uma pinça rombo para manter a língua, e usando a tesoura chegar à parte de trás da boca para entalhar a extremidade traseira da língua.
- Para hematoxilina immunocytochemical e eosina (H & E) a coloração dos tecidos da língua, lavar os tecidos língua com PBS gelado. Adicionar 5 ml de formol a 10% por 2-3 línguas e corrigi-los O / N em tubos de 15 ml.
- No dia seguinte, remover a formalina e mergulhar os tecidos em 5 ml de etanol a 70% para evitar a hiper-fixação. Enviá-los para o serviço comercial para continuar com parafina, corte e coloração de cortes de parafina.
NOTA: serviço histologia comercial é usado para executar estes passos. - Uma vez que as lâminas estão de volta a partir do serviço histologia comercial, grau de inflamação, observando as secções de tecido sob um microscópio de luz.
- Pontuação de 0 a 5, sendo 0 sem inflamação, e 5 sendo o mais grave inflamação. Pontuação da inflamação usando Tabela 1.
6.3) A produção de citocinas pelas células Th17
NOTA: A produção excessiva de TNF-α é uma das leituras de imunopatologia excessiva. Quando os ratos são transferidos adoptivamente com células Th17 só, faz com que a imunopatologia que está associado com a produção excessiva de TNF-α em células Th17.
- Coletar uma suspensão de células individuais do baço, linfonodos cervicais, linfonodos axilares, e língua, utilizando métodos previamente descritos 19,26.
- Reestimular as células com miristato acetato de forbol (PMA) (50 ng / ml) e ionomicina (500 ng / ml) durante 4 h com Brefeldina A (10 ug / ml) adicionada no last 2 h. Lavam-se as células com PBS e corrigi-los utilizando um kit de fixação / permeabilização comercial de acordo com as instruções do fabricante.
- Realização da coloração de citocinas celular intra utilizando o anti-TNF-α conjugado com fluorocromo, anti-IL-17A e anticorpos ROR-γt como anteriormente descrito 19.
- Resumidamente, ressuspender as células em tampão de permeabilização 1X com o cocktail de anticorpos anti-TNF-α, anti-IL-17A e anticorpos ROR-γt, cada anticorpo a 2-3 ug / ml de concentração final.
- Incubam-se as células durante 1 h à TA.
- Após a incubação, lavar as células com tampão de permeabilização 1X.
- Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de PBS com 0,5% de albumina de soro bovino para análise de citometria de fluxo.
- No dia seguinte, remover a formalina e mergulhar os tecidos em 5 ml de etanol a 70% para evitar a hiper-fixação. Enviá-los para o serviço comercial para continuar com parafina, corte e coloração de cortes de parafina.
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Representative Results
Neste modelo, tanto os camundongos infectados por Candida e camundongos não infectados em Rag-1 - / - fundo imunodeficientes foram adotivamente transferidos com células Th17 3-5 dias antes da infecção. Um total de 10-12 ratinhos foram utilizadas para as experiências, com dois ratos em cada Sham grupos infectados e 5/4 em cada um dos grupos infectados Candida. Células naive foram derivadas de Thy1.1 ou CD45.1 ratinhos congénicos, de modo que as células Th17 injectados foram rastreados in vivo utilizando Thy1.1 CD45.1 ou coloração, respectivamente (Figura 1A). Transferiu-Co regs T foram derivadas de camundongos CD45.2 para distingui-los a partir de células Th17 CD45.1. Para algumas experiências, CB-17 THY1.2 ratinhos receptores scid, foram usadas células Th17 dadoras obtidas a partir de ratinhos Thy1.1 Balb / C e regs T obtidas de ratinhos congénicos THY1.2. Apenas os ratinhos infectados com Cândida, mas não os ratinhos não infectados exibiu o recrutamento e a expansão do CD45.1 + reconstituído (Figura 1A). Os resultados representam dados a partir de um ratinho em cada grupo.
Apenas nos ratos que são co-transferidas com regs T, células Foxp3 CD45.1 + CD4 + foram detectados negativo na CLN. Isto mostra que os regs T injectadas também foram recrutadas para o local da infecção (Figura 1B). Os resultados representam dados a partir de um ratinho em cada grupo. Considerando infectado Rag-1 - / - peso perder peso e recuperou após 4 dias de infecção, camundongos imunossuprimidos cortisona não se recuperou, mas ainda perdido, como mostrado anteriormente 27. Ambos os grupos de ratinhos que receberam células Th17 na presença ou ausência de regs T perderam peso inicialmente. No entanto, os ratinhos que receberam regs T recuperados a partir da perda de peso e resolvida a infecção. 2 mgelo foram usadas no grupo Sham infectado, e 4 em cada grupo infectado Candida. Havia três ratinhos no grupo de cortisona. Os ratinhos que receberam apenas células Th17, perderam progressivamente peso (Figura 2) 19. Alguns dos ratos no grupo que tinham de ser submetidos a eutanásia. Estes resultados mostram a média dos pesos de todos os murganhos nesse grupo. Embora tanto os neutrófilos são necessárias para a depuração inicial da infecção, a sua presença contínua e recrutamento no tecido é um sinal de inflamação não resolvido. Portanto a infiltração de neutrófilos foi examinada na língua infectada, através da determinação da expressão de um marcador de neutrófilos, Gr-1, em pontos de tempo posteriores, tais como dia 7 após a infecção. Os ratinhos que receberam apenas células Th17, tinha infiltrados inflamatórios mais elevadas (Figura 3A), incluindo Gr-1 + neutrófilos mesmo dia-4 após a infecção, em comparação com os ratos injectados com regs T (Figura 3B). Estes resultados mostraram que na presence de regs T, ratos resolvido a inflamação mais eficientemente e recuperado da infecção.
No dia 7, após a infecção, baço (DRN), CLN e a língua tecidos foram isolados, e suspensões de células isoladas foram feitas por análises de citometria de fluxo. CLN revelou aumento de células CD45.1 Th17 (Figura 1) e de produção de TNF-α aumentada (Figura 4A, 4B) em ratinhos que receberam apenas células Th17. Por outro lado, t reg receptores apresentaram diminuição na frequência de células Th17 e reduziu a produção de TNF-α por células Th17 (Figura 1 e 4A, 4B). Nestas experiências, os dados de CLN de um único rato e tecidos da língua colhidas e reunidas a partir de 2 ratinhos são mostrados. Embora em pontos de tempo iniciais da produção de IL-17A foi maior em T reg receptores 19, em pontos de tempo mais tardios em ambos os grupos, a produção de IL-17A por células Th17 era mínima (dados não mostrados). Coloração ácido Schiff de Periódicada língua mostraram aumento hifas fúngicas em ratinhos que receberam apenas células Th17, enquanto que os ratinhos que receberam regs T assim apuradas o fungo no dia 5 e dia--7 após a infecção (Figura 5). Além disso, a histopatologia de pontuação da inflamação da língua também mostrou reduzidas pontuações da inflamação em ratinhos que receberam regs T, em comparação com os ratinhos que receberam apenas células Th17 (Figura 6). Marcando a inflamação foi baseada na língua histopatológicos tais como, presença de papilas, o intactness da camada superficial do epitélio, levedura visível ou hifas, invadindo hifas indicando infecção não resolver, espessamento da camada basal (indicativo de reparação tecidual em curso), e a presença de infiltração de células imunitárias (neutrófilos e células Th17). Estes resultados demonstraram que a injeção de células Th17 não reduzem diretamente a infecção, mas aumentou a carga fúngica e imunopatologia causada por C. primário infec albicansção, enquanto co-transferência de regs T amenizada imunopatologia.
Figura 1. injetaram células Th17 e células T reg recrutar e expandir nos gânglios linfáticos que drenam (CLN) da C albicans camundongos infectados (A) Rag-1 -.. / - Camundongos CD45.2 foram reconstituídos com células Th17 ou Th17 + T reg células que foram polarizadas sob condições Th17 durante 5 dias. Th17 células foram obtidas a partir de ratinhos congénicos CD45.1 e reg células T foram obtidas a partir de ratinhos CD45.2. Alguns ratos não recebeu quaisquer células (sham ou Candida + PBS). Os ratinhos receptores de cada grupo foram infectados com controlos falsos ou com C. albicans. No dia 5 após a infecção, CLN foram isolated para fazer uma suspensão de células única e controlar a CD45.1 injectado expressando células Th17, por citometria de fluxo (fechado em todos os leucócitos do FSC, SSC dispersão) (B) Rag-1 -. / - CD45.2 ratinhos foram reconstituídos com células Th17 ou células Th17 reg + T como em "A" e infectado com C. albicans. CLN foram isolados para fazer uma suspensão de células individuais e medir CD45.1 e expressão Foxp3 intracelular por citometria de fluxo (fechado em todas as células CD4). Os portões T reg nas parcelas mostrar o CD45.1 negativo, Foxp3 + CD4 + células. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. injetaram células Th17 causar perda de peso em C . Albicans ratinhos infectados e co-administração de regs T melhora a recuperação de perda de peso. SCID CB-17 ratinhos foram reconstituídos com células Th17 ou células T reg + Th17 como na Figura 1A. 3 dias mais tarde, os ratinhos receptores foram infectadas com a C. albicans. Alguns ratinhos em cada grupo foram infectados com controlos simulados. Ratinhos imunodeficientes recebeu acetato de cortisona (Cort) injecção. A percentagem de alteração de peso em murganhos reconstituídos com células indicadas e infectados com C. albicans, com respeito a d-1 (um dia antes da infecção) é mostrado. Os dados são normalizados relativa de não infectadas (Sham + PBS) ratos para os dados de peso. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. injetaram células Th17 causar língua imunopatologia em C. Albicans camundongos infectados e co-administração de regs T reduz a avaliação imunopatologia. Histológico das línguas do C. albicans camundongos infectados. Os ratinhos foram reconstituídos com células infectadas e indicados como na Figura 1A. No dia 5 após a infecção, as línguas foram isoladas a partir de ratinhos. (A) Cortes sagitais das linguetas foram coradas com H & E para avaliar a inflamação e infiltração (IF) de células imunes. (Pa) e (Ep) denotam papilas e da camada epitelial da língua, respectivamente. As imagens microscópicas dos slides exibidos ampliação at50X. (B) immunostaining histológica para Gr-1 marcador de neutrófilos usando anti Gr-1 anticorpo (Clone: 1A8-Ly6g) nas seções de língua no dia 5 após a infecção (marrom, denotado por IF). As imagens microscópicas dos slides exibidos no aumento de 100X são mostrados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A administração concomitante de regs T reduz TNF α em células Th17 injetadas. (A) Rag-1 - / - ratos CD45.2 foram reconstituídos com células Th17 ou células T reg + Th17 e infectados com C. albicans como na Figura 1A. No dia 5 após a infecção, os tecidos CLN e foram isolados da língua para fazer uma suspensão de células individuais. Estas células foram re-estimuladas com PMA e ionomicina antes staini intracelularng e citometria de fluxo analisa. Parcelas de citometria de fluxo intracelular de contorno de ROR-γt e TNF- α expressão das células Th17 são mostradas (gated em células CD4 +). (B) representação estatística da percentagem de células TNFαpositive a partir de experiências realizadas como em "A". Os dados representam 4 ratos no grupo não infectado, e 6 ratos em cada grupo infectado, e são compilados a partir de dois experimentos independentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Aumento da imunopatologia também está associada com o aumento da carga fúngica em C. Albicans camundongos infectados. CB-17 mic SCIDe foram reconstituídos com células Balb / C Th17, Th17 ou células reg + T como na Figura 1A, e foram infectadas com a C. albicans. A avaliação histológica da língua de camundongos infectados é mostrado. No dia 7, após a infecção, as línguas foram colhidos e corados com ácido periódico de Schiff de (PAS) para avaliar lesões fúngicas, inflamação e infiltração (IF) de células, e para detectar fungos (Ca). As lâminas foram vistos ampliação at100X. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. regs T melhorar imunopatologia em C. Albicans camundongos infectados. SCID foram reconstituídos com células Balb / C Th17, Th17 ou células reg + T como na Figura 1A, e foram infectadas com a C. albicans. Representação estatística dos escores histológicos médios das línguas de camundongos infectados avaliadas como na Figura 5. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ponto | Características |
| 0 | 0 - nenhum levedura visível ou hifas, epitélio superficial intacta sobre a superfície dorsal da língua, as papilas claramente presente e não danificado (pode ou não ser infiltrado de células mononucleares no interior do tecido), sem espessamento da camada basal, não há infiltração de células imunes. |
| 1 | 1 - sem fermento visível ou hyphae, áspero ou epitélio superficial ligeiramente danificado, papilas claramente presente com danos mínimos e células do sistema imunológico que se infiltram pouco frequentes. |
| 2 | 2 - papilas reduzido, mas presente com danos, espessamento da camada basal e células do sistema imunológico que se infiltram frequentes. |
| 3 | 3 - grupos ocasionais de levedura visível e invadindo hifas, as provas de papilas danificado, lesões ocasionais de epitélio danificado, espessamento da camada basal e e pequenos grupos de infiltração de células do sistema imunológico. |
| 4 | 4 - aglomerados freqüentes de levedura visível e invadindo hifas, as provas de papilas danificado, lesões freqüentes de epitélio danificado, infiltração mínima de células do sistema imunológico, espessamento da camada basal e aglomerados freqüentes de infiltração de células do sistema imunológico. |
| 5 | 5 - amplas evidências de invadir hifas, epitélio amplamente danificado em toda superfície dorsal, grande infiltração decélulas do sistema imunológico, poucos ou nenhum papilas detectável, espessamento da camada basal e clusters altamente freqüentes e grandes de se infiltrar nas células do sistema imunológico. |
Tabela 1: Valores de pontuação histológicos
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Discussion
Este modelo é baseado na indução C. bucal infecção albicans dependente inflamação Th17. Devido à ausência de regs T, a inflamação induzida por células Th17 desprendido e leva a imunopatologia mal resolvidas. In vitro derivados de células T CD4 + naive polarizadas como células Th17 foram utilizados para a transferência adoptiva. 40 - 50% das células CD4 + cultivadas células mostram detectável expressão de IL-17A por volta do dia 3 (células Th17), e por isso foram utilizadas para a injecção em ratinhos. A principal vantagem do modelo é que as células Th17 imunopatologia causar infecção específica que pode ser melhorada eficientemente com injecção T reg. Assim, o modelo pode ser utilizado para testar as estratégias de imunomodulação com injecção T reg como um controlo positivo. A inflamação é facilmente avaliado com base na perda de peso, de pontuação histopatológica e produção de citocina pró-inflamatória das células Th17 dos ratinhos infectados.
Depois de tele adotivos transferência de células Th17, migraram para os órgãos linfóides secundários e vários tecidos, incluindo a língua, o principal local de infecção. Após a infecção, também outras células inflamatórias foram recrutados para a língua para limpar a infecção. No entanto, sem imunomodulação T reg mediada, as células Th17-se não resolver a infecção, mas causou imunopatologia intensificada. Co-transferência de regs T completamente resolvido a inflamação. Curiosamente, os ratos com inflamação exacerbada na ausência de regs T, também apresentaram aumento da carga fúngica. O nosso relatório anterior mostrou que isso era devido à redução da produção de IL-17A em camundongos, em comparação com aqueles com regs T. Nossos experimentos atuais suportam a idéia de que ele também pode ser devido ao aumento TNF-α que agravou a inflamação, possivelmente aumentando a apoptose de células epiteliais e aumento da carga fúngica 28. Considerando os efeitos imunoprotectores de IL-17A na mucosa, Acreditamos que a patologia inflamatória que se observa com o aumento da carga fúngica não é devido a IL-17A produzido por células Th17 ou falta de resistência do hospedeiro. Ela é causada devido ao TNF-α e, possivelmente, outras citocinas pró-inflamatórias produzidas por células Th17 injectados. Isto pode ser validado pela observação de que Rag - / - murganhos desprovidos de células Th17 mostrar apenas inflamação mínima e subsequente resolução da infecção e somente aqueles que receberam células Th17 sucumbiram a severa perda de peso (Figura 1). Consistente com estes dados, ele também foi mostrado anteriormente que a RAG - / - ratos limpar a infecção OPC primário sem muito imunopatologia 27. Sob estas condições, os mecanismos compensatórios dependente de IL-17A a produção de células imunitárias inatas têm sido mostrados para limpar a infecção em Rag - / - ratos 17,29,30. Tomados em conjunto, apesar de IL-17A produzido por células Th17 e recrutamento de neutrófilos estão desempenhando um papel protetor nas fases iniciais da infecção, excessive produção de TNF-α e outras citoquinas por células Th17, e a continuação da presença de neutrófilos causas exacerbada imunopatologia. Os papéis de citocinas pró-inflamatórias, além de TNF-α produzido por células Th17 continuam a ser estudados no contexto de imunopatologia.
A principal limitação do modelo é a questão de saber se é fisiologicamente relevante para OPC humano. Embora as células Th17 são mostrados para ser mediadores patológicas diversas doenças orais, se a ativação crônica das células Th17 é patogénica em OPC ainda precisam ser investigados. Com as descobertas recentes que implicam o papel de C. albicans em inflamação e cancro, Th17 imunopatologia na cavidade oral é um campo de investigação activo 31. Assim, o modelo que está descrito aqui pode ser usado para estudar com mais cuidado as funções específicas de células Th17 e como eles interagem com as células da imunidade inata, dando percepções detalhadas em doenças imunológicas orais e câncer bucal.
O passo fundamental para a técnica é o recrutamento e expansão das células Th17 adotivamente transferidos apropriado. Isto é altamente dependente da viabilidade e IL-17A produção das células Th17 in vitro antes da transferência polarizados. É melhor testar a sua viabilidade e produção de citocinas por citometria de fluxo analisa 19. Correcta execução da injeção e ratos células Th17 infecção vai levar à infecção dependente imunopatologia Th17. Este modelo pode ser utilizado para testar estratégias para frustrar Th17 e imunopatologia inflamação oral no contexto de outras infecções bem. Também, utilizando este modelo, pode-se efectuar re-infecções secundárias e estudar o papel das células Th17 na exacerbação imunopatologia no contexto de infecções crónicas. Como este modelo envolve ratos imunodeficientes, pode ser muito relevante para a disbiose bucal visto em pacientes com AIDS e PID, que sofrem de infecções recorrentes Candida crônicas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CAF-2 | University of Pittsburgh (Sarah Gaffen) | - | Candida culture |
| U-bottom 96 well plates | Fisher | 055588 | Used for cell culture |
| a-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| m-IL-6 | Bio Basic | RC232 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| h-TGF-b | R&D | 240-B | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IFN-g | eBiosciences | 16-7311-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| a-IL-4 | eBiosciences | 16-7041-85 | Polarization of cells to Th17 conditions |
| α-IL17A ef660 | eBiosciences | 50-7177-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| α-TNFa-PE-Cy7 | eBiosciences | 25-7423-41 | Used for cell culture - 1:100 |
| α-RORgt PE | eBiosciences | 12-6981-82 | Used for cell culture - 1:50 |
| YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium | Bio Basic | S507.SIZE | Mediium for candida growth |
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4300 | Incubation growth for candida |
| 15 ml tubes | Bio Basic | BT888-SY | Used for cell culture and candida growth |
| 50 ml tubes | Bio Basic | CT 788-YS | Used for cell culture and candida growth |
| Table top Centrifuge | VWR International LLC | 82017-654 | For pelleting candida -900 g |
| Allegra Centrifuge | Beckman Coulter | 392302 | Cell culture - 480 g |
| 1.5 ml eppendorf tubes | Bio Basic | BT620-NS | Preparing final concentration of candida |
| 2x paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixing candida for count |
| Hemocytometer | VWR International LLC | 15170-172 | Counting cells |
| PBS - Phosphate Buffered Saline | Bio Basic | PD8117 | Preparation of buffers |
| Ketamine/xylazine | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | Obtained from ARC approved protocol for anesthesia |
| Ophthalmic lubricant ointment | Allergan | - | Eye ointment for animals to prevent dryness |
| Saline (0.9% NaCl) | G Biosciences | 786-561 | Administerd to animals to prevent dehydration |
| 3-mm-diameter cotton wool ball | VWR International LLC | BP7603 | 3 mm balls for candida infection |
| Heat gel pads | Case Western Reserve University - Animal Resource Center | - | for maintaining the body temperaturre and fast recovery |
| Hematoxylin and Eosin staining | Histoserv - MD | - | Tissue histology |
| 10% formalin | Electron Microscopy Sciences | JC1111/MC | Tissue histology |
| 70% ethanol | VWR International LLC | 97064-490 | Sterilization purpose |
| PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | Restimulation of cells |
| Ionomycin | Life Technologies | 124222 1mg | Restimulation of cells |
| Fixation permeabilization kit | eBiosciences | E16913-106 | Fixing cells for Flow cytometry |
| Tuberculin syringes | BD Biosciences | 309659 | Mice injection |
| 25 G x 3/8 needles | BD Biosciences | 309626 | Mice injection |
| Rag1 -/- mice | Jackson laboratories | Stock no: 002216 | Recipient mice |
| CD45.1 congenic mice | Jackson laboratories | Stock no:002014 | Donor Th17 cells |
| CB17-SCID mice | Jackson laboratories | Stock no: 001303 | Recipient mice |
| Balb/c mice | Jackson laboratories | Stock no: 000651 | Donor Th17 cells |
References
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