Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Goud nanorod-bijgestaan ​​Optische Stimulatie van neuronale cellen

Published: April 27, 2015 doi: 10.3791/52566
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

Introduction

Recente studies hebben aangetoond dat de tijdelijke verwarming verband met de absorptie van infrarood licht door water (golflengte> 1400 nm) kan worden gebruikt om actiepotentialen induceren in zenuwweefsel 1 en intracellulaire calcium in cardiomyocyten 2. Het gebruik van infrarood licht is verhoogd grote belangstelling voor toepassingen in neurale prothesen, vanwege het mogelijke fijnere ruimtelijke resolutie, geen direct contact met het weefsel, minimalisering van stimulatie artefacten, en verwijdering van de noodzaak genetisch wijzigen van de cellen voorafgaande aan stimulatie ( zoals vereist optogenetics) 1. Ondanks al deze voordelen, recent ontwikkelde thermische modellen gesuggereerd dat de beoogde weefsel / cellen kan worden beïnvloed door cumulatieve verwarming effecten, wanneer meerdere stimulus sites en / of hoge herhaling tarieven worden gebruikt 3,4.

In reactie op deze uitdagingen, hebben de onderzoekers de potentie om extrinsieke Opname in een erkendemers voor zenuwstimulatie om meer gelokaliseerde verwarming effecten in het weefsel te produceren. Huang et al. Demonstreerde dit beginsel met ferriet superparamagnetische nanodeeltjes op afstand activeren temperatuurgevoelige TRPV1 kanalen in HEK 293-cellen met een hoogfrequent magnetisch veld 5. Hoewel deze techniek kunnen toestaan ​​diepere penetratie (magnetische velden interactie relatief zwak met tissue), werden de antwoorden enige geconstateerd gedurende perioden seconden, plaats de milliseconde duur vereist bionic apparaten 5. Evenzo Farah et al. Toonden elektrische stimulatie van rat corticale neuronen met gekleurde microdeeltjes in vitro. Zij toonden cel-niveau precisie bij stimulatie met behulp van pulsduren in de orde van honderden microseconden en energieën in het bereik van uJ, wat het mogelijk maakt voor een snellere herhaling tarieven 6.

Het gebruik van extrinsieke absorptiemiddelen ook toegepast inducerenmorfologische veranderingen in vitro. Ciofani et al. Toonden een stijging van ~ 40% in neuronale cel uitgroei behulp van piëzo-elektrische boronnitride nanobuisjes opgewonden door echografie 7. Zo hebben endocytose ijzeroxide nanodeeltjes in PC12-cellen is gerapporteerd neurieten differentiatie vergroten op een dosisafhankelijke wijze door de activatie van celadhesie moleculen het ijzeroxide 8.

Recentelijk is de belangstelling extrinsieke absorbers neurale stimulatie helpen ook gericht op het gebruik van nanodeeltjes van goud (Au NP). Au NPs hebben het vermogen om efficiënt te absorberen laserlicht op plasmonische piek en te dissiperen in de omgeving in de vorm van warmte 9. Onder alle beschikbare deeltje vormen, de optische absorptie van goud nanorods (Au NRs) gemakkelijk past het therapeutische venster van biologisch weefsel (nabij infrarood - NIR, golflengte van 750-1,400 nm) 10. Bovendien, in het vervolgext van neurale stimulatie, het gebruik van Au NRs biedt relatief gunstige biocompatibiliteit en een breed scala aan oppervlakte functionalisering opties 11. Recente studies hebben aangetoond dat een stimulerend effect op differentiatie kan worden geïnduceerd na continue laser blootstelling van Au NRs in NG108-15 neuronale cellen 12. Evenzo werden intracellulaire calcium opgenomen in neuronale cellen gekweekt met Au NRs na laserbestraling gemoduleerd met variabele frequentie en pulslengten 13. Cel membraandepolarisatie werd ook opgenomen na NIR laser verlichting van Au NRs in primaire, spiraal ganglion neuronen 14. De eerste in vivo toepassing met bestraalde Au NRs onlangs is aangetoond. Eom en medewerkers bloot Au NRs hun plasmon hoogtepunt en nam een ​​zesvoudige toename van de amplitude van verbinding zenuw actiepotentialen (CNAPs) en een drie-voudige verlaging in de stimulatiedrempel bij ratten heupzenuwen. De nlEnhanced respons werd toegeschreven aan lokale verwarming effecten als gevolg van de excitatie van de NR plasmonische piek 15.

In de huidige papieren, zijn protocollen voor onderzoek naar de effecten van laser stimulatie in NG108-15 neuronale cellen gekweekt met Au NRs gespecificeerd. Deze methoden bieden een eenvoudige, maar krachtige manier om celpopulaties te bestralen in vitro met behulp van standaard biologische technieken en materialen. Het protocol is gebaseerd op een gevezelde laserdiode (LD) die veilige werking en herhaalbare uitlijning maakt. De Au NR monsterbereiding en laserbestraling werkwijzen kunnen verder worden uitgebreid tot verschillende deeltjesvormen en neuronale celkweken, mits de specifieke synthese en cultuur protocollen bekend, respectievelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Au NRs Voorbereiding

Opmerking: Au NRs kan worden gesynthetiseerd door een aantal recepten 16, of gekocht van commerciële leveranciers.

  1. Meet de aanvankelijke optische dichtheid (OD) van de Au NR oplossing via UV-Vis spectroscopie, door registratie van de absorptiewaarden van 300 nm tot 1000 nm met een resolutie van 0,5-2 nm. Vary het volume van de oplossing te worden gebruikt met de beschikbare cuvette.
  2. Evalueer de aanvankelijke NP molaire concentratie met een geschikte techniek 17 (zoals UV-Vis spectroscopie, deeltje inductief gekoppeld plasma massa spectrometrie, transmissie elektronenmicroscopie) of gebruik de concentratiewaarden door de verkoper.
  3. Bereid een 5 ml voorraadoplossing door verdunning van de aanvankelijke Au NR monster tot een OD bereiken = 1. Voor de beste reproduceerbaarheid, houdt de OD constant voor alle geteste monsters. Volg protocol commerciële leverancier voor de samenstelling van het verdunnende oplosmiddel. Als onzekerGebruik gedemineraliseerd water.
  4. Centrifuge 1 ml van de Au NR oplossing tweemaal gedurende 15 min bij 7800 xg elke chemische overmaat van de oplossing te verwijderen. Centrifugeren cycli kunnen variëren in kracht en tijd (bijvoorbeeld 20 min bij 5600 × g) 18.
  5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de NRS in gedeïoniseerd water. Als opnieuw gesuspendeerde deeltjes aggregaten kunnen vormen zijn opgelost, ze dagelijks de beste resultaten. Als alternatief, op te slaan in een koelkast niet langer dan 1 week. Niet invriezen.
  6. Voor het gebruik van onder celcultuur condities, ultrasone trillingen de Au NR-oplossing gedurende 5 minuten en dan steriliseren met UV-licht gedurende 30 min (UV-stralingsintensiteit niet minder dan 400 mW ∙ m -2 bij 254 nm).

2. NG108-15 neuronale cellijn, Cultuur en differentiatie

  1. Voor het celkweekmedium, bereiden 500 ml van steriele Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) dat 10% (w / v) foetaal kalfsserum (FCS), 1% (w / v) L-glutamine, 1%(W / v) penicilline / streptomycine en 0,5% (w / v) amfotericine B.
    Opmerking: Supplementen worden hoeveelheden verdeeld, bewaard bij -20 ° C en toegevoegd aan de media op de dag noodzakelijk. Celkweekmedium kan worden gekoeld in een steriele toestand maximaal 1 maand.
  2. Voor de celdifferentiatie medium bereiden 50 ml steriel DMEM bevattende 1% (w / v) L-glutamine, 1% (w / v) penicilline / streptomycine en 0,5% (w / v) amfotericine B.
  3. Groeien NG108-15 neuronale cellen in 10 ml celkweekmedium in T75 kolven van polystyreen in een incubator met bevochtigde atmosfeer (5% CO2 bij 37 ° C). Normaal zaad 1,5-2 x 10 5 cellen in elke kolf direct in 3-4 dagen. Veranderen celcultuurmedium om de twee dagen.
    Opmerking: Om genetische afwijkingen of variaties voorkomen, mag u geen cellen ouder dan doorgang 21 voor experimenten te gebruiken.
  4. Als 70-80% samenvloeiing in de cultuur, verandert het medium met warme verse celcultuurmedium. Mechanisch losmaken van de cellen door voorzichtig Knockoning de bodem van de confluente kolf. Gebruik geen trypsine.
  5. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 600 xg en resuspendeer de cel pellet in 2 ml warm celdifferentiatie medium.
  6. Seed 2 x 10 4 cellen / cm2 in een weefselkweek polystyreen plaat met 96 putjes met 200 ui celdifferentiatie medium. Incubeer het experiment 1 dag bij 5% CO 2/37 ° C.
  7. Voeg tussen 3,2 x 10 9 -4,2 × 1 0 10 deeltjes / ml Au NR oplossing op dag 2 en incubeer het voor nog 24 uur. Laat de deeltjes niet toe voor de controle-experimenten.
    Opmerking: Als een alternatief controlesysteem kan Au NP met een goed gedifferentieerde piekabsorptiegolflengte gebruikt voor vergelijkingsdoeleinden 14. Voor een meer consistente cel gedrag, houden de celdichtheid constant en niet de goed oppervlak voorafgaand aan de cel zaaien niet wijzigen.

3. neurietuitgroei Enhancement

  1. Paarde laser met een single mode glasvezel (numerieke opening = 0,13) en eindigen met een vezel connector (FC connectoren zijn handig en algemeen beschikbaar). Meet de uitgang laservermogen met een standaard power meter. Om optimale resultaten, overeenkomen met de piek golflengte van de laser om de plasmon resonantie piek van de NRs.
  2. Op dag 3 na NR incubatie, bevestig de FC-connector naar de put. Bestralen steekproeven en controles bij RT gedurende 1 minuut in continuous wave, voor verschillende laser bevoegdheden. Laat de kweek verlopen gedurende 3 bijkomende dagen bij 5% CO 2/37 ° C. Herhaal de laserbestraling gedurende minimaal 3 onafhankelijke metingen.
    Opmerking: Verschillende bestralingstijden en pulsfrequentie kunnen worden geselecteerd, afhankelijk van de toepassing.
  3. Kenmerkend zijn voor de laser in termen van de balk diameter en laser instraling (W ∙ cm -2).
    1. Voor een standaard single mode fiber, gebruiken NA = n ∙ sin θ,waarin n de brekingsindex van het medium in gebruik is en θ is de halve hoek van de lichtkegel de vezel verlaat (zie figuur 1A). Van trigonometrie, r = tan θ ∙ d, waarbij r de straal straal en d de afstand tussen de vezel en het monster. De FC connector voor de diameter van de bron, dus het verlichten van het monster op een afstand d = 2.70 ± 0.20 mm. Licht verlaat de vezel in water (n = 1,33), het geven van r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d.
    2. Met deze vergelijking Bereken de laserstraal radius, de bijbehorende balk stippellijn de gemiddelde laser bestralingssterkte (laservermogen gedeeld door balk gebied) op het doel (zie voorbeeld grafiek in figuur 1B). Deze waarden vertegenwoordigen de gemiddelde instraling op het verlichte oppervlak.
    3. Evalueer de fouten voor de metingen met de algemene theorie van foutenpropagatie.
      Opmerking: De afstand between de FC connector en het monster kan worden gemeten door foto's van de experimentele opstelling en naverwerking van de afbeelding met geschikte software (bijv ImageJ).
  4. Op dag 5, verwijdert celdifferentiatie medium uit de experimenten en bevestig de monsters met 3,7% (v / v) formaldehyde oplossing gedurende 10 min, vervolgens permeabilize de cellen met 0,1% (v / v) Triton X-100 gedurende 20 min.
  5. Voeg 3% (w / v) runderserumalbumine (BSA) de monsters gedurende 60 min naar het omgezette eiwit bindingsplaatsen te blokkeren. Label de monsters voor anti-βIII-tubuline overnacht (5 ug / ml in PBS aangevuld met 1% BSA) bij 4 ° C.
  6. Incubeer de cellen gedurende 90 min in het donker met een geschikt secundair antilichaam (bijv TRITC geconjugeerd anti-muis IgG-antilichaam) met een concentratie van 0,4-2 ug / ml in 1% BSA in PBS. Label de celkernen met DAPI (0,1 ug / ml in gedeïoniseerd water) gedurende 10 min.
    Opmerking: Antibody vervoeging en concentratie might variëren volgens het bedrijf protocol. Was monsters met PBS tweemaal gedurende 5 min na elke kleuring fase.
    Figuur 1
  7. Afbeelding stalen door epifluorescentie of confocale microscopie met ten minste 20 x objectief. Kies de microscoop filtert dienovereenkomstig aan het secundaire antilichaam. Selecteer een DAPI filter (λ EX = 358 nm, EM λ = 488 nm) om de celkernen zichtbaar.
  8. Analyseer de foto door beoordeling: i) de maximale lengte van neurieten (opnemen de lengte van de punt van de neurieten aan het begin van het cellichaam), ii) het aantal neurieten per neuronale cel (vatten alle neurieten per cel) en iii) het percentage van cellen met neurieten (verdeel het totale aantal cellen die βIII-tubuline door het totale aantal cellen met een positief gekleurde kern) 19.

4. Laser-geïnduceerde intracellulaire Ca 2+ Imaging

Bereid een 20% (w / v) voorraad oplossing van Pluronic F-127 door het oplossen van 2 g opgeloste stof in 10 ml watervrij dimethylsulfoxide (DMSO). Verwarm de oplossing van Pluronic F-127 bij 40 ° C gedurende ongeveer 20 minuten om de oplosbaarheid te verhogen. Bereiden op voorhand indien bewaard bij kamertemperatuur.
  • Op dag 3 na NR incubatie bereiden een gebalanceerde zoutoplossing (BSS; 135 mM NaCl, 4,5 mM KCI, 1,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 5,6 mM glucose en 10 mM HEPES, pH 7,4) en aangevuld met 5 uM Fluo-4:00 in DMSO en 0,1% (w / v) van Pluronic F-127 oplossing.
    Opmerking: BSS oplossing kan worden voorbereid en gekoelde maximaal 1 maand. Voeg de supplementen (Fluo-04:00 en Pluronic F-127) op de dag van het experiment.
  • Verwijder celdifferentiatie medium en vervang het door het aangevuld BSS oplossing. Om de beste resultaten met een omgekeerde confocale microscoop verkrijgen, incubeer de cellen in een micro-slide goed.
  • Load NG108-15 cellen met Fluo-04:00gedurende 30 min in het donker bij 5% CO 2/37 ° C. Na de incubatietijd, wassen monsters tweemaal met BSS aan een extracellulaire onbelaste fluorofor verwijderen.
  • Koppel de laser met een single mode optische vezel en klieven spuitkop standaardtechnieken. Observeer de resulterende tip onder een optische microscoop, een oppervlak van hoge kwaliteit te waarborgen (dwz de punt loodrecht op de vezel-as en plat op microscopie inspectie zou moeten zijn).
    1. Meet de uitgang laservermogen met een standaard power meter. Steek het licht levering vezel in een optische vezel houder en brengen het naar een micropositioner. Zie Brown et al. 20 voor meer details over glasvezel voorbereiding en positionering.
      Let op: Volg de algemene regels voor de veiligheid van de laser tijdens de meting van het laservermogen (bv niet direct in de laserstraal kijken, draag laser veiligheidsbril tijdens het hanteren, strooilicht blootstelling aan andere lab gebruikers voorkomen) <./ Li>
  • Sluit een oscilloscoop aan de draagbare laser het optische modulatie volgen. Gebruik een binair signaal met variabele frequenties (0,5-2 Hz) en pulslengten (20-100 msec). Sluit de laser met behulp van de modulatie signaal als transistor-transistor logica (TTL) input voor de microscoop, na de in Paviolo et al. 13 setup.
    1. Plaats de cellen onder een omgekeerde confocale microscoop en positioneren het licht levering fiber 250 ± 50 micrometer uit de buurt van de doelcel in de transmissie verlichting mode. Op deze afstand, gebruik maken van de vergelijkingen die in 3.3.1 om de bundel straal te berekenen op het doel.
  • Gebruik een argon-ion laser (488 nm) de geïnternaliseerde Fluo-04:00 kleurstof exciteren (λ EX = 494 nm, EM λ = 516 nm) en de gesynchroniseerde LD voor de excitatie van de endocytose NRs. Voer de beeldvorming bij RT van monsters en controles met behulp van ten minste 40 × doelstelling door het verzamelen van tijdreeksen scansmet 256 × 256 pixels / frameresolutie in rondreis mode met een frequentie van ten minste 4 Hz. Voer een opname zonder LD excitatie aan een argon-ion laser interferentie (baseline ruis) te identificeren.
  • Verwijder de achtergrond uit de gegevens met behulp van adaptief gewogen bestraft kleinste kwadraten algoritmen 21. Plot de geïnduceerde Ca2 + variaties in functie van de tijd. Analyseer de kortstondige pieken in de fluorescentie-intensiteit met behulp van het post-processing software door drempeling op een niveau drie maal de standaardafwijking van de basislijn ruis (3σ).

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Door Protocollen 1, 2 en 3 beschreven, werd een stimulerend effect op differentiatie waargenomen in NG108-15 neuronale cellen gekweekt met Au NP (Au NRs, poly (styreensulfonaat) -gecoate Au NRs en met siliciumdioxide beklede Au NRs) na de laser blootstellingen tussen 1,25 en 7,5 W · cm -2. Confocale beelden van rhodamineB gelabelde Au NRs aangetoond dat de deeltjes internalisatie van dag 1 van incubatie 12. De lokalisatie werd voornamelijk waargenomen in het cytoplasma, wat aangeeft dat de voorkeur mechanisme van opname was via het cellichaam membraan 12. De belangrijkste morfologische veranderingen waargenomen na het induceren van differentiatie in NG108-15 neuronale cellen waren de arrestatie van proliferatie, de uitdrukking van βIII-tubuline eiwit en de uitgroei van neurieten, die in termen van maximale lengte en nummer 22 werden geanalyseerd.

    Monsters gekweekt met NRs een neurieten lengtetoename de laser irradi toondekomstig niveaus hier gemeten (tussen 1,25 en 7,5 W · cm -2). Controlemonsters (cellen gekweekt zonder NP en bestraald met dezelfde laservermogen) geen significante verandering in lengte. Met een stralingsdosis van 7,5 W · cm -2, de uiteindelijke neurieten lengte van NG108-15 gekweekt met Au NRs was ongeveer 36% hoger (p <0,01) dan de niet-laser-bestraalde monsters. Dit gedrag werd niet specifiek gekoppeld aan de oppervlakte chemie van de NRS. Deze waarden waren bijna 20% hoger dan de neurieten ontwikkeld NG108 -15 alleen en blootgesteld aan dezelfde waarde van laserbelichting (p <0,05) 12. Deze resultaten zijn in lijn met eerder gepubliceerde studies over PC12 neuronale cellen gekweekt met piëzo-elektrische nanobuisjes en bestraald met ultrasone straling 7.

    Controle-experimenten zonder Au NRs toonde ook enkele stimulerende effecten van de 780 nm licht in termen van het percentage van neuronen met neurieten en het aantal neurites per neuron. Deze stimulatie was effectiever bij lagere laservermogens (1,25 W ∙ cm -2) met een volgende daling op het hoogste laserenergie (7,5 W ∙ cm -2) 12. Een gematigde stimulatie door de NP zonder laserbestraling (poly (styreensulfonaat) -gecoate en met siliciumdioxide beklede alleen) werd gedetecteerd in het percentage van neuronen met neurieten 12. Deze resultaten zijn in lijn met de recent gepubliceerde waarnemingen die gouden nanodeeltjes neuronale activiteit in vitro 23,24 kan verhogen. Figuur 2 toont een voorbeeld van epifluorescentie beelden van gedifferentieerde NG108-15 neuronale cellen alleen gekweekt (Figuur 2A) of met Au NRs (Figuur 2B ) en bestraald met verschillende laservermogens (in de figuur aangegeven).

    Het potentieel voor foto-gegenereerde intracellulaire Ca2 + afgifte werd gemeten met gepulseerd NIR licht overeenkomstig de Protocollen 1, 2, en4. Calcium-ionen spelen een belangrijke rol in verschillende cellulaire activiteiten, zoals mitose, spiercontractie en neurietverlenging 25,26. In reactie op een stimulus, Ca2 + toeneemt, oscilleert en vermindert, wat leidt tot de activering, modulatie of beëindiging van een specifieke cel functie. Onlangs hebben Ca2 + transiënten ook waargenomen als gevolg van infrarood laser exposure in cardiomyocyten. In dat werk, de Ca2 + responsen opgewekt na IR blootstelling vertoonden lagere amplitudes en snellere hersteltijden dan de spontane Ca2 + transiënten 2. Figuur 3 toont een voorbeeld van NG108-15 neuronale cellen geladen met Fluo-4 AM afgebeeld met een confocale microscoop. Fluo-04:00 waargenomen aan het celmembraan voeren op niet-storende wijze, waardoor een in hoofdzaak uniforme verdeling van de indicator in het cel cytoplasma. Slechts een kleine nucleaire of cytoplasmatische organellen kleuring werd gedetecteerd. Zoals eerder aangegeven, NRs werd verwacht dat intracellulair 12 bevinden. NG108-15 neuronale cellen alleen of gekweekt met Au NRs en poly (styreensulfonaat) -gecoate-Au NRs werden vervolgens blootgesteld aan laser intensiteiten tussen 0,07 ∙ J cm -2 en 370 ∙ J cm -2, met de laser frequentie gemoduleerd in het gebied van 0,5-2 Hz.

    Figuur 4 toont representatieve voorbeelden van hoe de amplitude van de responsen in kaart gebracht als functie van de tijd. De amplitude van de Ca2 + respons varieerde de bestralingsdosis (Figuur 4A - C) en werd niet waargenomen consequent veroorzaakt de laserpulsen (figuur 4C) 13. De meest waarschijnlijke uitleg was de voorbijgaande depletie van intracellulaire Ca2 + winkels toegeschreven onvolledige Ca2 + belading 2 of de verschillende efficiëntie van NR internalisering in de neuronale cellen. Toen NRs niet werden gebruikt in culture (controle-experimenten, Figuur 4D), werd een stimulerend effect van de 780 nm licht ook waargenomen. Echter produceerde lagere fluorescentie amplitude pieken en kleinere kans activatie (gedetecteerd in slechts 16% van de geanalyseerde monsters). Kortom, een 48% kans NR laser geïnduceerde celactivatie gerealiseerd en ondanks de achtergrond gebeurtenissen door het 780 nm licht, blootstelling van NR-behandelde cellen toonden hogere stimulatie rendement en de laserenergie en hogere pieken respons 13. In feite werd de calciumrespons gevonden piek bij 0,33 ∙ J cm -2 in de NR-behandelde cellen. Dit werd toegeschreven aan thermische remming 13. Tijdens de experimenten geen aanwijzingen blebbing of andere vormen van celmembraan verstoring gedetecteerd, hetgeen consistent is met de resultaten van Huang et al. Dat cellulaire photodestruction gerapporteerd met een relatief hoge vermogensdichtheid van 19 W ∙ cm -2 aangevraagde 4 min 27. Geen spontane activiteit in de NR-behandelde cellen werd opgenomen zonder laserbelichting.

    Figuur 1
    Figuur 1: Optische vezel experimentele opstelling (A) en gemiddelde laser intensiteiten als functie van het laservermogen voor een laserbundel gebied gelijk aan 0,4 mm2 (B). Beam parameters (A): de halve hoek van de maximale lichtkegel de vezel (θ), de bundel radius (r) en de afstand tussen de optische vezel en het monster (d) verlaat.

    Figuur 2
    Figuur 2: Voorbeelden van epifluorescentie beelden van NG108-15 gedifferentieerde neuronale cellen alleen (A) gekweekt of Au NRs (B) en bestraald met verschillende laservermogens (in de figuur aangegeven). Monsters werden incubated voor één dag voor laser bestraling. Cellen werden gefixeerd en gemerkt anti-β-III tubuline (rood) en DAPI (blauw) drie dagen na laserbestraling. Schaal bars zijn 100 micrometer.

    Figuur 3
    Figuur 3: Voorbeeld van gedifferentieerde NG108-15 neuronale cellen geladen met Fluo4-AM Ca 2+ indicator Het beeld werd genomen met behulp van een omgekeerde confocale microscoop met een 40X olie-immersie objectief..

    Figuur 4
    Figuur 4: Representatieve voorbeelden van door laser geïnduceerde Ca2 + variaties in functie van de tijd in NG108-15 neuronale cellen gekweekt in serum-vrije omstandigheden gedurende drie dagen (A) poly (styreensulfonaat) -AU NRs, (B, C) Au NRs, en (D) zonder NRs (controlemonster). Deze resultaten warenverkregen met laserpulsen van 100 msec (A, C, D) en 50 msec (B). De frequenties die voor de experimenten (gestippelde verticale lijnen) werden 1 Hz (A - C) en 0,5 Hz (D). De berekende stralende blootstellingen waren 69,4 J ∙ cm -2 (A), 34,7 J ∙ cm -2 (B), 0,37 J ∙ cm -2 (C) en 138,87 J ∙ cm -2 (D). F max / F 0 geeft de maximale fluorescentie toename gedetecteerd in NG108 -15 neuronale cellen, uit kalibratie met ionomycine (overgenomen met toestemming 13).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De in deze presentatie protocollen beschrijven hoe de cultuur, differentiëren en optisch stimuleren neuronale cellen met behulp van extrinsieke dempers. De NR kenmerken (bv afmetingen, vorm, plasmon resonantie golflengte en oppervlaktechemie) en de laser stimulatieparameters (zoals golflengte, pulslengte, herhalingssnelheid, enz.) Kan worden gevarieerd om verschillende experimentele behoeften. De effecten op celgedrag kan worden gecontroleerd met behulp van standaard biologische bepalingen en materialen. De benadering biedt een eenvoudige, maar krachtige manier om celpopulaties te bestralen in vitro en kan worden uitgebreid tot primaire cellen, weefselmonsters en in vivo studies.

    De voornaamste eisen die Au NRs moeten voldoen om te worden gebruikt voor biologische toepassingen zijn stabiliteit (zowel chemisch en fysisch) en biocompatibiliteit. Het laatste is bijzonder kritisch, vanwege de aanwezigheid van een kationische oppervlakteactieve stof (gemeenschappelijkely CTAB) op het oppervlak van de Au. CTAB is bekend cytotoxiciteit induceren zowel in vitro 28 en in vivo 29 en wordt vaak gebruikt tijdens het syntheseproces de NR-vormige formatie 30 rijden. Stabiliteit en biocompatibiliteit worden vaak verbeterd door afzetten extra coatings op de Au NR oppervlak (bijvoorbeeld polyethyleenglycol, silica) 31. De biocompatibiliteit beoordelen kunnen verschillende assays worden gebruikt in vitro (bijv levend / dood, MTS, MTT, etc.) terwijl histologische analyse wordt vaak uitgevoerd in weefsel experimenten 7,8,12,15.

    Een andere uitdaging te staan ​​bij het werken met nanomaterialen is de moeilijkheid van het correct bepalen van hun molaire concentratie. De grote verscheidenheid van NP in vorm, grootte en chemische eigenschappen maakt de technieken die momenteel mogelijk geschikt voor alleen bepaalde klassen deeltjes. Bijvoorbeeld, het standaard dynamisch licht scattering methode gaat ervan uit dat de NP's hebben een sferische vorm en licht verstrooien isotroop 17. Daarom is de toepassing van deze methode Au NRs resultaten verschillen tussen de gemeten concentratie en de echte. De kwestie van NP concentratie vooral problematisch als verband met het gebied nanomedicine, waarbij de concentratie toegediend moet nauwkeurig worden beheerst om de efficiëntie van het proces (bijvoorbeeld voor geneesmiddelafgifte toepassingen) maximaliseren en minimaliseren van de toxiciteit van nanomaterialen 17. In de hier gerapporteerde onderzoeken, de extinctie gebruikte gaf goede resultaten in termen van cellevensvatbaarheid en deeltjesaantal.

    Vanwege hun intrinsieke absorptie-eigenschappen worden Au NP vaak gebruikt in combinatie met een laserbron. Tijdens de belichting, absorptie en verstrooiing zijn de twee hoofdprocessen waarschijnlijker op het oppervlak van het NP. Als de laser golflengte overeenkomt met de plasmon resonantie golflengte absorptie vaakprevaleert boven verstrooiing, spannend de geleidingselektronen bij de NP oppervlak. Deze vormen een elektron gas dat weg beweegt van haar evenwichtspositie en creëert een resonerende coherent oscillatie genoemd de gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie (LSPR). De energie wordt dan overgebracht naar de NP kristalrooster als warmte, die daarna snel wordt gedissipeerd in de omringende omgeving 32. Aangezien warmte is het belangrijkste effect waargenomen na de excitatie van de NR LSPR, is het raadzaam om cellevensvatbaarheid na blootstelling laser controleren.

    Er is verondersteld dat de waargenomen effecten op de uitgroei van neurieten en de intracellulaire Ca2 + route waren vanwege de tijdelijke verwarming gevolg van excitatie van de LSPR. Deze hypothese is in overeenstemming met de activatie van de temperatuurgevoelige TRPV1 kanaal na blootstelling magnetische ferriet NP 5. Dit proces is ook in overeenstemming met de waarnemingen die warmtegevoelig TRPV4 kanalen play een belangrijke rol in het infrarood zenuwstimulatie 33. Op moleculair niveau, is onlangs aangetoond dat TRPV4 is warmtegevoelige na de interactie van fosfoinositide -4,5 -biphosphate (PIP2) met het kanaal 34. Daarom is het mogelijk dat de tijdelijke verwarming die na NR excitatie kunnen dienen te versnellen en / of induceren de opening van de TRPV4 kanalen. Deze hypothese kan worden bevestigd door toekomstige Ca 2+ experimenten met behulp van Ca 2+ - vrij medium en / of moleculaire controles op de PIP-2 uitputting.

    Verschillende groepen hebben ook aangetoond dat kleine temperatuurgradiënten via fysiologische temperatuurgebied kan gebruikt worden om andere reacties, zoals neuronale groeikegel geleiden 25 of depolariserende stromen in humane embryonale niercellen 35 induceren. Yong en collega's een forse toename van de elektrische signaal activiteit in de primaire auditieve neuronen cultreerd met silica gecoate Au NRs na de laser bestraling van de NRS bij de LSPR. De verwarming door de laser bestraalde deeltjes werd gemeten met patch-clamp technieken 14. Recenter Eom et al. Een toename van de amplitude van CNAPs na laserbelichting van 3,4 x 10 9 Au NRs indien continu geperfundeerd in de nabijheid van de mantel van de zenuwbaan van een rat heupzenuw 15.

    Het stimulerende effect van de 780 nm laserdiode waargenomen tijdens de experimenten niet gekoppeld aan warmte die door waterabsorptie, zij bekend is verwaarloosbaar bij 780 nm 36. Eerder gepubliceerde resultaten hebben ook gemeld stimulerende effecten van 780 nm licht op neuronaal weefsel in vivo 37,38. In vitro studies hebben de betrokkenheid van zuurstofradicalen in het proces 39 aangetoond. Echter, de gedetailleerde mechanismen die NIR stimulatie beïnvloedt gen transcription en andere cellulaire activiteiten zijn nog niet opgelost. Huidige gegevens suggereren de wisselwerking tussen verschillende effecten in de stimulatie, zoals foton absorptie binnen chromoforen in de mitochondria (bijna 50% van de energie bij 780 nm kan worden opgenomen door cytochroom c oxidase) 37,39-41, veranderingen in membraanpermeabiliteit calcium 37 en remming van inflammatoire activiteit in de cellen 37.

    De in dit manuscript resultaten demonstreren dat nanodeeltjes absorptiemiddelen veelbelovend voor toekomstige toepassingen in optische stimulatie van neuronale cellen. Het belangrijkste voordeel ligt in het vermogen van NIR licht diep in weefsels (therapeutisch). Deze resultaten tonen ook dat absorberende nanodeeltjes kunnen verbeteren en / of vervangen proces infrarood zenuwstimulatie basis van waterabsorptie. Voor toekomstige toepassingen in neurale prothesen, zou het interessant zijn om verschillende oppervlakte functionalizat onderzoekenionen met chemische affiniteit voor neuronale axonen, die de belangrijkste doelstellingen voor vele optische stimulatie toepassingen zijn.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    De auteurs willen graag NanoVentures Australië voor reis financiële steun en Prof. John Haycock erkennen voor het feit dat gedeeltelijk gehost dit onderzoek aan de Universiteit van Sheffield en mevrouw Jaimee Mayne voor haar hulp tijdens het filmen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Au NR Sigma Aldrich 716812
    NG108-15 Sigma Aldrich 8811230
    DMEM Sigma Aldrich D6546
    FCS Life Technologies 10100147
    L-glutamine Sigma Aldrich G7513
    Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140122
    Amphotericin B Life Technologies 15290018
    Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
    Triton X-100 BDH T8532
    BSA Sigma Aldrich A2058
    Anti-βIII-tubulin Promega G7121
    TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody Sigma Aldrich T5393
    DAPI Invitrogen D1306
    Fluo-4 AM Invitrogen F14201
    DMSO Sigma Aldrich 472301
    Pluronic F-127 Invitrogen P6867
    UV-Vis spectrometer Varian Medical Systems Inc. Cary 50 Bio
    Mini centrifuge Eppendorf Mini Spin
    Sonic bath Unisonics Australia FPX 10D
    Cell culture incubator Kendro Hera Cell 150
    Cell culture centrifuge Hettich Rotofix 32A
    Laser diode Optotech 780 nm single mode fibre - coupled LD
    Optical fiber Thorlabs 780 HP
    Power meter Coherent Laser Check
    ImageJ http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
    Epifluorescent microscope Axon Instruments ImageX-press 5000A
    μ-slide well Ibidi 80826
    Inverted confocal microscope Carl Zeiss Microscopy Ltd. LSM 510 meta-confocal microscope
    Oscilloscope Tektronix TDS210

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).
    2. Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).
    3. Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).
    4. Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).
    5. Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles. Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).
    6. Farah, N., et al. Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation. J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).
    7. Ciofani, G., et al. Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation. ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).
    8. Kim, J. A., et al. Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).
    9. Myroshnychenko, V., et al. Modelling the optical response of gold nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).
    10. Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods. Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).
    11. Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging. Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).
    12. Paviolo, C., et al. Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth. Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).
    13. Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients. J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).
    14. Yong, J., et al. Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons. Adv. Healthcare Mater. , (2014).
    15. Eom, K., et al. Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods. Small. , (2014).
    16. Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L. M., Mulvaney, P. Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications. Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).
    17. Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration. Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).
    18. Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. Shape separation of gold nanorods using centrifugation. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).
    19. Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function. Glia. 59 (5), 734-749 (2011).
    20. Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation. JoVE. (77), (2013).
    21. Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra. J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).
    22. Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
    23. Jung, S., et al. Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain. PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).
    24. Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity. J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).
    25. Ebbesen, C. L., Bruus, H. Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance. J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).
    26. Iwanaga, S., et al. Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells. Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).
    27. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles. Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).
    28. Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
    29. Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat. Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).
    30. Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L., Mulvaney, P. Gold nanorods: synthesis, characterization and applications. Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).
    31. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).
    32. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).
    33. Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).
    34. Garcia-Elias, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).
    35. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), (2012).
    36. Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Müller, G. Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm. J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).
    37. Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).
    38. Wu, X., et al. 810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord. Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).
    39. Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. 780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species. Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).
    40. Wong-Riley, M. T. T., et al. Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase. J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).
    41. Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach. Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).

    Tags

    Neurowetenschappen goud nanorods externe absorber zenuwstimulatie laserexcitatie optische stimulatie neuronale cellen,
    Goud nanorod-bijgestaan ​​Optische Stimulatie van neuronale cellen
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Paviolo, C., McArthur, S. L.,… More

    Paviolo, C., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (98), e52566, doi:10.3791/52566 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter