Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי החימום החולף הכרוכות בקליטה של אור אינפרא אדום על ידי מים (אורך הגל> 1,400 ננומטר) ניתן להשתמש כדי לגרום לפוטנציאל פעולה ברקמת עצב 1 וארעי סידן תוך תאי בשריר לב 2. השימוש באור אינפרא אדום העלה עניין רב עבור יישומים בתותבות עצביות, בשל הרזולוציה מרחבית עדינה הפוטנציאל, חוסר מגע ישיר עם הרקמות, מזעור של חפצי גירוי, והסרת הצורך לשנות גנטי את התאים לפני הגירוי ( כפי שנדרש בoptogenetics) 1. למרות כל היתרונות הללו, מודלים תרמיים שפותחו לאחרונה הציעו כי רקמת התאים / היעד עשויים להיות מושפעים מהשפעות מצטברות חימום, כאשר אתרי גירוי מרובים ו / או שיעורים גבוה חזרה משמשים 3,4.
בתגובה לאתגרים אלה, חוקרים זיהו את הפוטנציאל לשימוש חיצוני absorbers לגירוי עצב לייצר אפקטי חימום מקומיים יותר ברקמה. הואנג et al. הוכיח את העיקרון הזה על ידי שימוש בננו-חלקיקי פרית פאראמגנטי להפעיל מרחוק ערוצי TRPV1 רגיש לטמפרטורה בתאי HEK 293 עם תדר רדיו שדה מגנטי 5. למרות שטכניקה זו עשויה לאפשר לחדירה עמוקה יותר (שדות מגנטיים מגיבים יחסית חלש עם רקמה), התגובות נרשמו רק על פני תקופות של שניות, ולא המשכים אלפית השנייה הנדרשים במכשירי יונית 5. באופן דומה, פרח et al. גירוי חשמלי של תאי עצב בקליפת המוח הראה עכברוש עם מיקרו-חלקיקים שחורים במבחנה. הם הראו דיוק ברמת תא בגירוי באמצעות משכי דופק בסדר הגודל של מאות מייקרו-שני ואנרגיות בטווח של μJ, פוטנציאל המאפשרים לשיעורי חזרה מהירים יותר 6.
השימוש בבולמים חיצוניים גם הוחל לגרוםשינויים מורפולוגיים במבחנה. Ciofani et al. הראה עלייה ~ 40% בתולדת תאים עצביים באמצעות צינורות ניטריד בורון פיזואלקטריים נרגשים על ידי אולטרסאונד 7. בדומה לכך, חלקיקי תחמוצת ברזל endocytosed בתאי PC12 כבר דיווח על מנת לשפר את בידול neurite באופן תלוי מינון, בשל הפעלת מולקולות הידבקות תא עם תחמוצת ברזל 8.
לאחרונה, העניין בבולמים חיצוניים כדי לסייע גירוי עצבי גם התמקד בשימוש בננו-חלקיקי זהב (NPS Au). יש צירופים וAu היכולת לספוג ביעילות אור הלייזר בשיא plasmonic וכדי להפיג אותו לסביבה בצורה של חום 9. בין כל צורות חלקיקים הזמינות, הקליטה האופטית של ננו זהב (Au NRS) במקום נוח תואמת את החלון הטיפולי של רקמות ביולוגיות (ליד אינפרא אדום - ניר, גל בין 750-1,400 ננומטר) 10. יתר על כן, בהמשךשלוחה של גירוי עצבי, השימוש בAu NRS מספק biocompatibility נוח יחסית ומגוון רחב של אפשרויות functionalization משטח 11. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי השפעה ממריצה על בידול יכולה להיגרם לאחר חשיפת לייזר רציפה של Au NRS בNG108-15 תאים עצביים 12. באופן דומה, הארעיים סידן תוך תאי נרשמו בתאים עצביים תרבית עם Au NRS אחרי הקרנת הלייזר מווסתת עם תדרים ודופק משתנים אורכי 13. שלילת קוטביות קרום תא נרשמה גם לאחר תאורת לייזר NIR של Au NRS בתרבויות עיקריות של נוירונים הגנגליון ספירלה 14. הראשון ביישום vivo עם מוקרן Au NRS הודגם רק לאחרונה. משקיפים ועמיתים לעבודה נחשפו Au NRS בשיא plasmonic ונרשמו עלייה של פי שש במשרעת של פוטנציאל פעולה עצבי מתחם (CNAPs) וירידה של פי שלושה בסף הגירוי בעצבי sciatic חולדה. Enתגובה חל שיפורים יוחסה להשפעות חימום מקומיות כתוצאה מהעירור של שיא plasmonic NR 15.
בעבודה הנוכחית, פרוטוקולים לבודקים את ההשפעה של גירוי הלייזר בNG108-15 תאים עצביים תרבית עם NRS Au מפורטים. שיטות אלה מספקות, דרך פשוטה, אך רבת עוצמה כדי להקרין אוכלוסיות תאים במבחנה תוך שימוש בטכניקות ביולוגיות סטנדרטיים וחומרים. הפרוטוקול מבוסס על דיודות לייזר בשילוב סיבים (LD), המאפשרת הפעלה בטוחה ויישור הדיר. שיטות הקרנת הכנת מדגם ולייזר Au NR ניתן להאריך עוד יותר לצורות שונות של חלקיקים ותרביות תאים עצביים, ובלבד שפרוטוקולי הסינתזה והתרבות הספציפיים ידועים, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Au NRS הכנה
הערה: יכול להיות מסונתז Au NRS על ידי מספר המתכונים 16, או שנרכש מיצרנים מסחריים.
- למדוד את הצפיפות הראשונית האופטית (OD) של פתרון Au NR באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis, על ידי הקלטת ערכי הקליטה מ -300 ננומטר עד 1,000 ננומטר עם רזולוציה של 0.5-2 ננומטר. משתנה הנפח של הפתרון לשימוש עם קובט הזמינים.
- להעריך את הריכוז הראשוני NP טוחנת עם הטכניקה מתאימה 17 (ספקטרוסקופיה למשל UV-Vis, ספקטרומטריית מסת פלזמה בשילוב אינדוקטיבי חלקיק יחיד, מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים) או להשתמש בערכי הריכוז הניתנים על ידי הספק.
- הכן פתרון מניות 5 מיליליטר ידי דילול מדגם Au NR הראשוני להגיע OD = 1. לדירות הטובות ביותר, לשמור קבוע OD לכל הדגימות שנבדקו. עקוב הפרוטוקול של הספק המסחרי להרכב הממס המדלל. אם אינך בטוח, להשתמש במים ללא יונים.
- צנטריפוגה 1 מיליליטר של פתרון Au NR פעמיים במשך 15 דקות ב7,800 XG כדי להסיר כל עודף כימי מהפתרון. מחזורי צנטריפוגה יכולים להשתנות בכוח והזמן (למשל g × 20 דקות ב 5,600) 18.
- הסר את supernatants מחדש להשעות NRS במים ללא יונים. כחלקיקים מחדש מושעה עלולים ליצור אגרגטים בפתרון, להכין אותם מדי יום כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר. לחלופין, חנות במקרר לא יותר משבוע 1. לא להקפיא.
- לפני השימוש בתנאי תרבית תאים, sonicate פתרון Au NR למשך 5 דקות ולאחר מכן לחטא עם אור UV למשך 30 דקות (עוצמת קרינת UV לא פחות מ -400 mW ∙ m -2 ב 254 ננומטר).
תרבות קו 2. NG108-15 תאים עצביים ובידול
- למדיום תרבית תאים, להכין 500 מיליליטר של המדיום של Dulbecco סטרילי שונה נשר (DMEM) המכיל 10% (w / v) בסרום עגל עוברי (FCS), 1% (w / v) L- גלוטמין, 1%(W / v) (w / v) ב amphotericin פניצילין / סטרפטומיצין ו -0.5%
יכולים להיות aliquoted תוספי, מאוחסנים ב -20 ° C והוסיפו לתקשורת ביום נדרש: הערה. מדיום תרבות תא יכול להיות בקירור במצב סטרילי לתקופה מקסימלית של 1 חודש. - לבינוני התמיינות תאים, להכין 50 מיליליטר של DMEM סטרילי המכיל 1% (w / v) L- גלוטמין, 1% (w / v) (w / v) ב amphotericin פניצילין / סטרפטומיצין ו -0.5%
- לגדול NG108-15 תאים עצביים ב 10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים בצלוחיות T75 עשויים קלקר באינקובטור עם אווירת humidified (5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס). בדרך כלל, זרע 1.5-2 × 10 5 תאים בבקבוק אחד כדי להיות מוכן ב3-4 ימים. שנה בינוני תרבית תאים בכל יומיים.
הערה: כדי למנוע סחף או וריאציה גנטיים, לא משתמש בתאים מבוגרים יותר ממעבר 21 לניסויים. - כאשר ומחוברות 70-80% בתרבות, לשנות בינוניות עם בינוני תרבות תא חם וטריה. מכאני לנתק את התאים על ידי בעדינות knocהמלך התחתון של הבקבוק ומחוברות. אל תשתמש בטריפסין.
- צנטריפוגה ההשעיה התא במשך 5 דקות ב 600 XG מחדש להשעות את התא גלולה ב 2 מיליליטר של מדיום התמיינות תאים חם.
- 2 × 10 4 תאים / סנטימטר זרע 2 בצלחת גם קלקר תרבית רקמת 96 עם 200 μl של מדיום התמיינות תאים. דגירה הניסוי ליום 1 בשעה 5% CO 2/37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף בין 3.2 × 10 9 -4.2 × 1 0 10 / חלקיקי מיליליטר של תמיסת Au NR ביום 2 ודגירה אותו למשך 24 שעות נוספות. אל תוסיף את החלקיקים לניסויי שליטה.
הערה: כפי ששליטה חלופית, Au צירופים ועם אורך גל קליטת שיא היטב הבדיל יכולים לשמש למטרות השוואה 14. להתנהגות תא עקבית יותר, לשמור על צפיפות תאים קבועים ולא לשנות את פני השטח היטב לפני זריעת תאים.
3. neurite תולדה שיפור
- זוגהלייזר עם סיב אופטי מצב יחיד (צמצם המספרי = 0.13) ולסיים אותו עם מחבר סיבים (המחברים FC נוחים וזמינים בדרך כלל). מדוד את כוח לייזר פלט עם מד כוח סטנדרטי. כדי להשיג את התוצאות האפקטיביות ביותר, להתאים את אורך הגל לשיא של הלייזר לשיא תהודת plasmon של NRS.
- ביום 3 הדגירה NR הבאה, לתקן את מחבר FC לטוב. מכשיר את דגימות ובקרות בRT דקות 1 בגל רציף, לסמכויות לייזר שונות. לאפשר לתרבות כדי להמשיך במשך 3 ימים נוספים בבית 5% CO 2/37 מעלות צלזיוס. חזור על הקרנת הלייזר למינימום של 3 מדידות עצמאיות.
הערה: זמני הקרנה שונים ותדרי דופק ניתן לבחור, בהתאם ליישום. - לאפיין את הלייזר במונחים של קוטר האלומה וirradiance לייזר (W ∙ סנטימטרים -2).
- לסיבי מצב יחידים סטנדרטיים, להשתמש = n ∙ θ חטא NA,כאשר n הוא מקדמת השבירה של המדיום בשימוש וθ הוא זווית המחצית מחרוט אור יציאה מהסיבים (ראה איור 1 א). מטריגונומטריה, r = d θ ∙ שיזוף, שבו r הוא רדיוס הקורה וd הוא המרחק בין הסיבים והמדגם. מחבר FC תואם את הקוטר של באר, ולכן מאיר את המדגם במרחק d = 2.70 ± 0.20 מ"מ. אור יוצא הסיבים במים (n = 1.33), נותן r = tan (חטא-1 (NA / n)) ∙ ד.
- באמצעות המשוואה האחרונה, לחשב את רדיוס קרן לייזר, קרן האזור המתאים וirradiance הממוצעת הלייזר (כוח הלייזר מחולק באזור קרן) ביעד (ראה גרף הדוגמא באיור 1). ערכים אלה מייצגים irradiance הממוצעת מעל האזור המואר.
- להעריך את הטעויות למדידות עם התאוריה הכללית של התפשטות שגיאה.
הערה: b המרחקetween מחבר FC והמדגם ניתן למדוד בתצלומיו של ההסדר הניסיוני ולאחר העיבוד של התמונה באמצעות תוכנה מתאימה (למשל ImageJ).
- ביום 5, להסיר בינוני התמיינות תאים מהניסויים ולתקן את הדגימות עם 3.7% (v / v) פתרון פורמלדהיד במשך 10 דקות, ולאחר מכן permeabilize התאים עם 0.1% (v / v) טריטון X-100 עבור 20 דקות.
- להוסיף 3% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) על הדגימות עבור 60 דקות כדי לחסום את חלבון unreacted אתרי קישור. תווית הדגימות ללילה אנטי-βIII טובולין (5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS בתוספת 1% מBSA) בשעה 4 ° C.
- דגירה התאים למשך 90 דקות בחושך עם נוגדנים משני מתאימים (אנטי עכבר נוגדני IgG למשל TRITC-מצומדות) באמצעות ריכוז של .4-2 מיקרוגרם / מיליליטר בBSA 1% ב- PBS. תווית גרעין התא עם DAPI (0.1 מיקרוגרם / מיליליטר מים דה מיונן ב) במשך 10 דקות.
הערה: נטיית נוגדן ומיג ריכוזht להשתנות בהתאם לפרוטוקול החברה. לשטוף דגימות עם PBS פעמיים במשך 5 דקות לאחר כל שלב צביעה.
- דגימות תמונה על ידי epifluorescence או confocal באמצעות לפחות 20 × אובייקטיביים. בחר מיקרוסקופ מסננים בהתאם לנוגדנים משני. בחר מסנן DAPI (λ = 358 nm EX; λ EM = 488 ננומטר) כדי להמחיש את גרעין התא.
- לנתח את התמונות על ידי הערכה: i) האורך המרבי neurite (שיא האורך מקצה neurite לתחילת גוף התא), ii) מספר neurites לכל תא עצבי (לסכם את כל neurites לכל תא) וiii) את אחוז התאים עם neurites (לחלק את המספר הכולל של תאים לבטא βIII טובולין במספר הכולל של תאים בעלי גרעין מוכתם חיובי) 19.
4. בלייזר מושרה ההדמיה 2 + תאיים Ca
הערה: פתרון BSS יכול להיות מוכן מראש וקירור לתקופה מקסימלית של 1 חודש. הוסף את התוספים (Fluo-4 בבוקר וpluronic F-127) ביום של הניסוי.
- מדוד את כוח לייזר פלט עם מד כוח סטנדרטי. הכנס את סיבי משלוח האור לבעל סיבים אופטיים ולהדביק אותו לmicropositioner. עיין באל בראון ואח. 20 לפרטים נוספים על הכנת סיבים אופטית ומיצוב.
זהירות: בצע את הכללים לבטיחות לייזר במהלך המדידה של כוח הלייזר (למשל לא נראים ישירות לתוך קרן לייזר, לחבוש משקפי מגן בטיחות הלייזר במהלך טיפול, מניעת חשיפה לאור תועה למשתמשי מעבדה אחרים) <./ Li>
- מניחים את התאים תחת מיקרוסקופ confocal הפוך ולמקם את סיבי משלוח אור 250 ± 50 מיקרומטר מתא המטרה במצב תאורת שידור. במרחק זה, להשתמש במשוואות שהוצגו ב3.3.1 לחשב את רדיוס הקרן ביעד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על ידי שימוש בפרוטוקולים 1, 2, ו -3 שתוארו כאן, השפעה ממריצה על בידול נצפתה בNG108-15 תאים עצביים תרבותיים עם הצירופים וAu (NRS Au, פולי (styrenesulfonate) -coated Au NRS והמצופה סיליקה Au NRS) לאחר לייזר חשיפות בין 1.25 ו -7.5 W · סנטימטר -2. תמונות Confocal של NRS Au כותרת rhodamineB הראו כי החלקיקים הופנמו מיום 1 של דגירה 12. הלוקליזציה הייתה בעיקר שנצפתה בציטופלסמה התא, מצביעה על כך שהמנגנון המועדף של ספיגה היה דרך קרום תא בגוף 12. השינויים מורפולוגיים העיקריים אותרו לאחר גרימת בידול בNG108-15 תאים עצביים היו מעצרו של שגשוג, ביטוי חלבון βIII טובולין של והתולדה של neurites, שנותחו במונחים של אורך ומספר 22 מקסימום.
דוגמאות תרבותיות עם NRS הראו עליית אורך neurite בirradi הלייזררמות אהה נמדדו כאן (בין 1.25 ו -7.5 W · סנטימטרים -2). דגימות בקרה (תאים בתרבית ללא צירופים ומוקרנים באותו כוח הלייזר) לא הראו שינוי משמעותי באורך. שימוש במינון קרינה של 7.5 W · סנטימטר -2, אורך neurite הסופי של NG108-15 תרבותי עם Au NRS היה בערך 36% גבוה יותר (p <0.01) מאשר הדגימות שאינם הלייזר מוקרן. התנהגות זו לא במיוחד צמודה לכימיה של פני השטח NRS. ערכים אלו היו כמעט 20% יותר מאשר neurites שפותחה על ידי NG108 -15 לבד ונחשפה לאותו הערך של חשיפת לייזר (p <0.05) 12. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מחקרים שפורסמו בעבר בתאים עצביים PC12 תרבותיים עם צינורות פיזואלקטריים ומוקרנים בקרינת אולטרא-סאונד 7.
ניסויי שליטה ללא Au NRS גם הראו כמה תופעות גירוי של אור 780 ננומטר במונחים של אחוז של נוירונים עם neurites ומספר neurites לנוירון. גירוי זה היה יעיל יותר בסמכויות לייזר נמוכות יותר (1.25 W ∙ סנטימטרים -2) עם ירידה הבאה באנרגית הלייזר הגבוהה ביותר (7.5 W ∙ סנטימטרים -2) 12. גירוי מתון שנגרם על ידי הצירופים וללא כל הקרנת לייזר (פולי (styrenesulfonate) -coated ורק מצופה סיליקה) זוהתה בשיעור של נוירונים עם neurites 12. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם תצפיות שפורסמו לאחרונה כי חלקיקי זהב יכולים להגדיל את הפעילות עצבית במבחנה 23,24. איור 2 מציג דוגמא של תמונות epifluorescence של תאים עצביים הבדיל NG108-15 תרבית לבד (איור 2 א) או עם NRS Au (איור 2 ) ומוקרן עם סמכויות שונות לייזר (מצויינים באיור).
הפוטנציאל לשחרור Ca תאיים-תמונה שנוצרה 2 + הוערך באמצעות אור NIR פעם בהתאם לפרוטוקולים 1, 2, ו4. יוני סידן תפקיד חשוב בפעילות סלולרית שונה, כגון מיטוזה, התכווצות שרירים והארכת neurite 25,26. בתגובה לגירוי, Ca 2 + עליות, נע ויורד, שהובילו להפעלה, האפנון או ההפסקה של תפקוד תא ספציפי. לאחרונה, Ca 2 + ארעיים גם נצפה כתוצאה מהחשיפה לייזר IR בשריר לב. באותה יצירה, תגובות Ca 2 + עוררו לאחר חשיפת IR הציגה אמפליטודות והתאוששות פעמים מהר יותר מאשר Ca 2 + הארעיים הספונטני 2 נמוכות יותר. איור 3 מציג דוגמא של NG108-15 תאים עצביים עמוסים Fluo-4 בבוקר וצלמו עם מיקרוסקופ confocal. Fluo-04:00 נצפו להיכנס קרום התא באופן שאינו מפריע, וכתוצאה מכך, בדרך כלל, הפצה אחידה של המדד על פני ציטופלסמה התא. רק מכתים אברון גרעיני או cytoplasmic קטין אותר. כפי שצוין קודם לכן, NRS היו אמור להיות ממוקם intracellularly 12. NG108-15 תאים עצביים לבד או NRS תרבותי עם Au NRS ופולי (styrenesulfonate) -coated-Au נחשף לאחר מכן לirradiances לייזר בין 0.07 J ∙ סנטימטר -2 ו 370 J ∙ סנטימטר -2, עם תדר הלייזר המווסת בטווח של 0.5-2 הרץ.
איור 4 מראה דוגמאות מייצגות של איך את המשרעת של התגובות מופתה כפונקציה של זמן. האמפליטודה של תגובת Ca 2 + מגוונת עם החשיפה הזוהרת (איור 4 א - ג) ונצפתה שלא להיות מופעלת באופן עקבי על ידי פעימות הלייזר (איור 4C) 13. סביר להניח שההסברים היו הדלדול החולף של 2 + חנויות Ca תאיות המיוחסות לCa 2 + טעינה שלמה 2 או היעילות שונה של הפנמת NR בתאים עצביים. כאשר NRS לא היו בשימוש בculturדואר (ניסויים שליטים, איור 4D), אפקט של גירוי אור 780 ננומטר נצפה גם. עם זאת, זה מיוצר פסגות משרעת הקרינה נמוכות והסתברות נמוכה של הפעלה (זוהתה רק 16% מהדגימות ניתחו). בסך הכל, 48% הסתברות של הפעלת תא מושרה לייזר NR הושגה ולמרות אירועי רקע בשל אור 780 ננומטר, חשיפה של תאים שטופלו NR הפגינה יעילות גירוי גבוהה יותר עם אנרגיית לייזר נמוכה ופסגות גבוהות יותר של תגובה 13. למעשה, תגובת סידן נמצאה בשיא 0.33 J ∙ סנטימטר -2 בתאים שטופלו-NR. זה יוחס לעיכוב תרמי 13. במהלך הניסויים, אין עדות לblebbing או כל צורה אחרת של הפרעה קרום התא זוהתה, אשר עולה בקנה אחד עם התוצאות של הואנג et al., שדיווחו photodestruction הסלולרי עם צפיפות הספק גבוהה יחסי של 19 W ∙ סנטימטר -2 הגיש בקשה ל4 2 דקות7. אין פעילות ספונטנית בתאים שטופלו-NR נרשמה ללא חשיפת לייזר.
איור 1: סיבים אופטיים ניסיוני התקנה () וirradiances לייזר ממוצע כפונקציה של כוח הלייזר לקרן לייזר של אזור שווה 0.4 מ"מ 2 (ב). הפרמטרים Beam הם (א): זווית חצי של חרוט המרבי של אור יציאה מהסיבים (θ), רדיוס הקרן (r) ואת המרחק בין הסיבים האופטיים והמדגם (ד).
איור 2: דוגמאות של תמונות epifluorescence של תאים עצביים הבדיל NG108-15 תרבית לבד () או עם NRS Au (B) ומוקרן עם סמכויות שונות לייזר (מצויינים באיור). דגימות היו incubated ליום אחד לפני הקרנת לייזר. תאים היו קבועים ומתויגים לטובולין אנטי-β-III (אדום) וDAPI (כחול) שלושה ימים לאחר הקרנת לייזר. ברים סולם הם 100 מיקרומטר.
איור 3: דוגמא של תאים עצביים NG108-15 מובחנים עמוסים מחוון Fluo4-AM Ca 2 + התמונה צולמה באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך עם מטרת נפט טבילה 40X..
איור 4: דוגמאות מייצגות של וריאציות Ca 2 + מושרה לייזר כפונקציה של הזמן בNG108-15 תאים עצביים בתרבית בתנאי סרום ללא במשך שלושה ימים עם () פולי NRS -Au (styrenesulfonate), (B, C) NRS Au, ו( ד ') ללא NRS (מדגם שליטה). תוצאות אלו היושהושג עם פעימות לייזר של 100 אלפיות שני (A, C, D) ו- 50 אלפיות שני (B). התדרים המשמשים לניסויים (קווים אנכיים מקווקוים) היו 1 הרץ (- C) ושל 0.5 הרץ (D). החשיפות קורנות מחושבות היו 69.4 J ∙ סנטימטר -2 (א), 34.7 J ∙ סנטימטר -2 (B), 0.37 J ∙ סנטימטר -2 (C) ו138.87 J ∙ סנטימטר -2 (ד '). F מקסימום / F 0 מציין את הגידול המרבי הקרינה התגלה בNG108 -15 תאים עצביים, מכיול עם ionomycin (לשכפל באישור 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקולים מפורטים במצגת זו מתארים כיצד תרבות, להבדיל ואופטי לעורר תאים עצביים באמצעות בולמים חיצוניים. מאפייני NR (למשל ממדים, צורה, אורך גל תהודת plasmon וכימיה של פני השטח) ופרמטרי גירוי לייזר (כגון אורך גל, אורך הפולס, שיעור החזרה, וכו ') יכולים להיות מגוון כדי להתאים לצרכי ניסיוניים שונים. ההשפעות על התנהגות תא ניתן לנטר באמצעות מבחני סטנדרטיים וחומרים ביולוגיים. בסך הכל הגישה מספקת, דרך פשוטה, אך רבת עוצמה כדי להקרין אוכלוסיות תאים במבחנה עם אפשרות להארכה לתאים ראשוניים, דגימות רקמה ובמחקרי vivo.
הדרישות העיקריות שNRS Au צריך לספק לשמש ליישומים ביולוגיים הן יציבות (הן כימיות ופיסיים) וbiocompatibility. זו האחרונה היא קריטית במיוחד, בשל נוכחותם של חומרים פעילי שטח קטיוני (נפוצהly CTAB) על פני השטח של Au. CTAB ידוע לגרום cytotoxicity הן במבחנה 28 וin vivo 29 וזה משמש בדרך כלל בתהליך הסינתזה לנהוג היווצרות NR-צורת 30. יציבות וbiocompatibility משתפרים לעתים קרובות על ידי הפקדת ציפויים נוספים על פני השטח Au NR (גליקול למשל פוליאתילן, סיליקה) 31. כדי להעריך את ההתאמה הביולוגית, ניתן להשתמש בם מבחני שונים במבחנה (לדוגמא חי / מת, MTS, MTT, וכו '), בעוד שניתוח היסטולוגית מבוצע לעתים קרובות במהלך ניסויי רקמה 7,8,12,15.
אתגר נוסף להתמודד בעבודה עם ננו הוא הקושי בצורה נכונה קביעת הריכוז טוחנת שלהם. המגוון של צירופים והעצומים במונחים של צורה, גודל, ותכונות כימיות הופך את הטכניקות זמינות מתאימות כרגע רק סוגים מסוימים של חלקיקים. לדוגמא, scatt האור הדינמי הסטנדרטיering שיטה מניח כי יש לי צירופים וצורה כדורית ופיזור אור isotropically 17. לכן, יישום של שיטה זו לתוצאות Au NRS בפערים בין הריכוז הנמדד ואמיתי. הנושא של ריכוז NP הוא בעייתי במיוחד אם הקשורים לתחום ננו-הרפואה, שבו הריכוז מנוהל צריך להיות מבוקר בדיוק על מנת למקסם את היעילות של התהליך (למשל עבור יישומי משלוח סמים) ולמזער את הרעילות של ננו 17. במחקרים שדווחו כאן, הצפיפות האופטית המשמשת נתנה תוצאות טובות במונחים של כדאיות התא ומספר חלקיקים.
בשל מאפייני הקליטה הפנימיים שלהם, הצירופים וAu משמשים לעתים קרובות בשילוב עם מקור לייזר. במהלך החשיפה, קליטה ופיזור הם שני התהליכים העיקריים העשויים להתרחש על פני השטח של הצירופים ו. אם הלייזר באורך הגל מתאים לגל תהודת plasmon, קליטה לעתים קרובותגובר על פיזור, מרגש האלקטרונים הולכה על פני השטח NP. אלה יוצרים גז אלקטרונים שמתרחק ממצב שיווי המשקל שלה ויוצר תנודה קוהרנטית תהודה נקראת התהודה המקומית plasmon המשטח (LSPR). האנרגיה הוא הועבר לאחר מכן לסריג NP הגביש כחום, אשר מתפזר לאחר מכן במהירות לתוך הסביבה 32. מאז החום היא ההשפעה העיקרית שנצפתה לאחר העירור של LSPR NR, רצוי לעקוב אחר תא כדאיות לאחר חשיפת לייזר.
זה כבר שיערו כי ההשפעות שנצפו על התוצאה neurite ומסלול Ca 2 + תאיים היו בשל החימום החולף נובע מעירור של LSPR. השערה זו עולה בקנה אחד עם הפעלתו של ערוץ TRPV1 הטמפרטורה רגישה לאחר חשיפה מגנטית של צירופים ופרית 5. תהליך זה הוא גם עולה בקנה אחד עם תצפיות שPLA ערוצי TRPV4 רגישים תרמיy תפקיד חשוב בגירוי עצב אינפרא אדום 33. ברמה מולקולרית, זה הוכח לאחרונה TRPV4 שהוא thermosensitive רק לאחר האינטראקציה של phosphoinositide -4,5 -biphosphate (PIP 2) עם הערוץ 34. לכן, ייתכן שהחימום החולף נובע לאחר עירור NR יכול לשמש כדי להאיץ ו / או לגרום לפתיחת ערוצי TRPV4. השערה זו יכולה להיות מאושרת על ידי 2 + Ca ניסויים עתידיים באמצעות Ca 2 + - בינונית חופשי ו / או בקרות מולקולריות על דלדול PIP 2.
גם קבוצות שונות הראו כי טמפרטורה הדרגתיים קטנה על פני טווח הטמפרטורה הפיזיולוגי יכול לשמש כדי לגרום לתגובות אחרות, כגון חרוט צמיחה עצבי המנחה 25 או depolarizing זרמים בתאי כליה עובריים אנושיים 35. יונג ועמיתים לעבודה נרשמו עלייה משמעותית בפעילות אות חשמלית בתאי עצב פולחן שמיעתי ראשוניured עם NRS Au מצופה סיליקה לאחר הקרנת לייזר של NRS בLSPR. החימום המיוצר על ידי החלקיקים-מוקרן בלייזר נמדד תוך שימוש בטכניקות תיקון מהדק 14. לאחרונה, המשקיפים et al., רשמו עלייה במשרעת של CNAPs לאחר חשיפת לייזר של 3.4 × 10 9 Au NRS כאשר perfused ברציפות בקרבת הנדן של צרור העצבים של עצב משית עכברוש 15.
האפקט של גירוי דיודת לייזר 780 ננומטר נצפתה במהלך הניסויים לא היה קשור לחום שנוצר על ידי ספיגת מים, כפי שזה נקרא להיות זניח ב780 36 ננומטר. גם תוצאות שפורסמו בעבר דיווחו השפעות גירוי של 780 ננומטר אור על רקמות עצביות in vivo 37,38. במבחנה מחקרים הראו המעורבות של מיני חמצן פעילים בתהליך 39. עם זאת, המנגנונים מפורטים שבו גירוי NIR משפיע transcriptio הגןn ופעילויות סלולריות אחרות הם לא פתורים כרגע. הנתונים הנוכחיים מצביעים על יחסי הגומלין של תופעות שונות בגירוי, כוללים קליטת פוטונים בתוך chromophores במיטוכונדריה (כמעט 50% מהאנרגיה ב780 ננומטר עשויים להיקלט על ידי מונואמין ג ציטוכרום) 37,39-41, שינויים בחדירות קרום לסידן 37 ועיכוב של פעילות דלקתית בתאים 37.
התוצאות שהוצגו בכתב היד הזה מראים כי בולמי ננו-חלקיקים לקיים הבטחה גדולה עבור יישומים עתידיים בגירוי אופטי של תאים עצביים. היתרון העיקרי טמון ביכולת של אור NIR לחדור לעומק רקמות (חלון טיפולי). תוצאות אלו מראות כי גם בולמי ננו-חלקיקים יכולים לשפר ו / או להחליף את התהליך של גירוי עצבי תת-אדום המבוסס על ספיגת מים. עבור יישומים עתידיים בתותבות עצביות, זה יהיה העניין לחקור functionalizat משטח שונהיונים עם זיקה כימית לאקסונים עצבי, המהווה את היעד העיקרי ליישומים רבים גירוי אופטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות NanoVentures אוסטרליה לתמיכה במימון הנסיעות ופרופ 'ג'ון כובע על שארח באופן חלקי מחקר זה באוניברסיטת שפילד והגב' Jaimee Mayne על עזרתה בזמן הצילומים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre - coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
References
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).
- Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles. Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).
- Farah, N., et al. Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation. J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).
- Ciofani, G., et al. Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation. ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).
- Kim, J. A., et al. Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).
- Myroshnychenko, V., et al. Modelling the optical response of gold nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).
- Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods. Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).
- Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging. Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).
- Paviolo, C., et al. Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth. Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).
- Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients. J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).
- Yong, J., et al. Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons. Adv. Healthcare Mater. , (2014).
- Eom, K., et al. Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods. Small. , (2014).
- Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L. M., Mulvaney, P. Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications. Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).
- Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration. Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).
- Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. Shape separation of gold nanorods using centrifugation. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).
- Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function. Glia. 59 (5), 734-749 (2011).
- Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation. JoVE. (77), (2013).
- Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra. J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).
- Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
- Jung, S., et al. Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain. PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).
- Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity. J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).
- Ebbesen, C. L., Bruus, H. Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance. J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).
- Iwanaga, S., et al. Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells. Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles. Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat. Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).
- Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L., Mulvaney, P. Gold nanorods: synthesis, characterization and applications. Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).
- Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).
- Garcia-Elias, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), (2012).
- Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Müller, G. Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm. J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).
- Wu, X., et al. 810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord. Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).
- Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. 780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species. Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).
- Wong-Riley, M. T. T., et al. Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase. J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).
- Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach. Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).
