Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Guld nanorod Assisterad Optisk Stimulering av nervceller

Published: April 27, 2015 doi: 10.3791/52566
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

Introduction

Nya studier har visat att den transienta upphettning i samband med absorption av infrarött ljus genom vatten (våglängd> 1400 nm) kan användas för att inducera aktionspotentialer i nervvävnad 1 och intracellulära kalcium transienter i kardiomyocyter 2. Användningen av infrarött ljus har höjt stort intresse för applikationer inom neurala proteser, på grund av den potentiella finare rumsliga upplösningen, brist på direkt kontakt med vävnaden, minimering av stimulerings artefakter, och avlägsnande av behovet att genetiskt modifiera cellerna före stimulering ( såsom krävs i optogenetik) 1. Trots alla dessa fördelar, nyligen utvecklade termiska modeller föreslog att målet vävnaden / cellerna kan påverkas av kumulativa uppvärmningseffekter, när flera stimulans webbplatser och / eller höga repetitionsfrekvenser används 3,4.

Som svar på dessa utmaningar, har forskare insett potentialen att använda yttre absormarna för nervstimulering för att producera mer lokala uppvärmningseffekter i vävnaden. Huang et al. Visade denna princip genom att använda superpara ferrit nanopartiklar för att fjärraktivera de temperaturkänsliga TRPV1 kanaler i HEK 293 celler med en radiofrekvent magnetfält 5. Även om denna teknik kan möjliggöra djupare penetration (magnetfält samverkar relativt svagt med vävnad) var synpunkterna endast noterats under perioder av sekunder, snarare än de millisekund löptider som krävs i Bionic enheter 5. Likaså Farah et al. Visade elektrisk stimulering av råtta kortikala neuron med svarta mikropartiklar in vitro. De visade cellnivå precision i stimulering med hjälp pulsvaraktig på order av hundratals ps och energier i intervallet μJ, potentiellt möjliggör snabbare repetitionsfrekvenser 6.

Användningen av yttre absorbenter har även tillämpats för att induceramorfologiska förändringar in vitro. Ciofani et al., Visade en ökning av neuronal cell utväxt ~ 40% med hjälp av piezoelektriska bornitrid nanorör upphetsade av ultraljud 7. På liknande sätt har endocyteras järnoxidnanopartiklar i PC12-celler rapporterats öka neurite differentiering på ett dos-beroende sätt, på grund av aktivering av cellvidhäftningsmolekyler med järnoxiden 8.

Nyligen har intresset för yttre absorbatorer att hjälpa nervstimulering också fokuserat på användningen av guld nanopartiklar (Au NP). Au NP har förmågan att effektivt absorbera laserljus vid plasmoniska topp och att avleda det till den omgivande miljön i form av värme 9. Bland alla tillgängliga partikelformer, den optiska absorptionen av guld nanostavar (Au ​​NR) matchar lämpligen det terapeutiska fönstret av biologiska vävnader (nära infraröd - NIR, våglängd mellan 750-1,400 nm) 10. Dessutom i fortsext av neural stimulering, användandet av Au NR ger relativt gynnsam biokompatibilitet och ett brett utbud av ytfunktionalisering alternativ 11. Nyligen genomförda studier har visat att en stimulerande effekt på differentiering kan induceras efter löpande laser exponeringar av Au NR i NG108-15 neuronala celler 12. Likaså var intracellulära kalcium transienter inspelad i nervceller odlade med Au NR efter laserstrålning modulerad med variabla frekvenser och pulslängder 13. Cell membrandepolarisering registrerades också efter NIR laser belysning av Au NR i primära kulturer av spiral ganglieneuroner 14. Den första in vivo ansökan med bestrålad Au NR har visats nyligen. EOM och medarbetare exponerades Au NR på deras plasmoniska topp och spelade in en sexfaldig ökning av amplituden av förening nervaktionspotentialer (CNAPs) och en tre-faldig minskning i tröskelstimulering i råttischiasnerver. Den svEnhanced svar skrevs närvärmeeffekter till följd av excitation av NR plasmoniska topp 15.

I föreliggande dokument är protokoll för att undersöka effekterna av laserstimulering i NG108-15 neuronala celler odlade med Au NR anges. Dessa metoder ger en enkel, men ändå kraftfullt, sätt att bestråla cellpopulationer in vitro med användning av standardbiologiska tekniker och material. Protokollet är baserat på en fiberkopplad laserdiod (LD) som möjliggör säker drift och repeterbar uppriktning. De Au NR beredning och laserprov bestrålningstjänster metoder kan utökas ytterligare till olika partikel former och neuronala cellkulturer, förutsatt att de specifika syntes och kultur protokollen är kända, respektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Au NR Framställning

Anm: Au NR kan syntetiseras genom ett antal recept 16, eller köpas från kommersiella leverantörer.

  1. Mät den initiala optiska densiteten (OD) för Au NR lösningen via UV-Vis-spektroskopi, genom att registrera absorptions- värden från 300 nm till 1000 nm med en upplösning av 0,5-2 nm. Variera volymen av lösningen som skall användas med den tillgängliga kyvetten.
  2. Utvärdera den inledande NP molkoncentration med en lämplig teknik 17 (t.ex. UV-Vis-spektroskopi, enda partikel induktivt kopplad plasma masspektrometri, transmissionselektronmikroskopi) eller använd de koncentrationsvärden som tillhandahålls av säljaren.
  3. Bered en 5 ml förrådslösning genom utspädning av initiala Au NR provet att nå en OD = 1. För bästa repeterbarhet, hålla OD konstant för alla de testade proverna. Följ den kommersiella säljarens protokoll för sammansättningen av den utspädande lösningsmedlet. Om osäkerAnvänd avjoniserat vatten.
  4. Centrifug 1 ml av Au NR lösningen två gånger under 15 minuter vid 7.800 xg för att avlägsna någon kemisk överskott från lösningen. Centrifugecykler kan variera i kraft och tid (t.ex. 20 min vid 5.600 × g) 18.
  5. Ta supernatanterna och slamma NRS i avjoniserat vatten. Som åter suspenderade partiklar kan bilda aggregat i lösning, förbereda dem dagligen för att ha de bästa resultaten. Alternativt butik i ett kylskåp i högst 1 vecka. Får ej frysas.
  6. Före användning enligt cellodlingsbetingelser, Sonikera Au NR lösning för 5 min och sedan sterilisera med UV-ljus under 30 minuter (UV-strålningsintensiteten inte är mindre än 400 mW ∙ m -2 vid 254 nm).

2. NG108-15 Neuronal cellinje kultur och differentiering

  1. För cellodlingsmediet, förbereda 500 ml steril Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) innehållande 10% (vikt / vol) fetalt kalvserum (FCS), 1% (vikt / volym) L-glutamin, 1%(Vikt / volym) penicillin / streptomycin och 0,5% (vikt / volym) amfotericin B.
    Obs: Kosttillskott kan alikvoteras, förvaras vid -20 ° C och sattes till media på dagen krävs. Cellodlingsmediet kan kylas i ett sterilt tillstånd för högst en månad.
  2. För celldifferentieringsmedium, förbereda 50 ml sterilt DMEM innehållande 1% (vikt / volym) L-glutamin, 1% (vikt / volym) penicillin / streptomycin och 0,5% (vikt / volym) amfotericin B.
  3. Väx NG108-15 neuronala celler i 10 ml cellodlingsmedium i T75-kolvar av polystyren i en inkubator med fuktad atmosfär (5% CO2 vid 37 ° C). Normalt utsäde 1,5-2 x 10 5 celler i varje kolv ska vara klar i 3-4 dagar. Ändra cellodlingsmedium varannan dag.
    Obs: För att förhindra genetiska drivor eller variation, använd inte celler äldre än passagen 21 för experiment.
  4. När 70-80% sammanflytande i kultur, ändra mediet med varma färskt cellkulturmedium. Mekaniskt loss cellerna genom att försiktigt knockung botten av konfluenta kolven. Använd inte trypsin.
  5. Centrifugera cellsuspensionen under 5 min vid 600 xg och återsuspendera cellpelleten i 2 ml varm celldifferentieringsmedium.
  6. Seed 2 × 10 4 celler / cm2 i en vävnadskulturpolystyren 96 brunnar med 200 pl celldifferentiering medium. Inkubera experimentet under 1 dag vid 5% CO 2/37 ° C.
  7. Lägg mellan 3,2 × 10 9 -4,2 × 1 0 10 partiklar / ml av Au NR lösning på dag 2 och inkubera det för ytterligare 24 timmar. Lägg inte till partiklarna för kontrollexperiment.
    Obs: Som alternativ kontroll, kan Au NP med en väl differentierad topp absorptionsvåglängd användas för jämförelser 14. För en mer konsekvent cellens beteende, hålla celltätheten konstant och inte ändrar den väl ytan före cellsådd.

3. neuritutväxt Enhancement

  1. Parlasern med en optisk singelmodfiber (numerisk apertur = 0,13) och avsluta den med en fiberkontaktdon (FC-kontakter är bekvämt och allmänt tillgänglig). Mät utgångslasereffekt med en vanlig effektmätare. För att få de mest effektiva resultat, matcha topp våglängd lasern till plasmonresonans toppen av NR.
  2. På dag 3 efter NR inkubation, fixa FC kontakten till brunnen. Bestråla prover och kontroller vid RT under 1 minut i kontinuerlig våg, för olika lasereffekter. Låt kulturen fortskrida under ytterligare 3 dagar vid 5% CO 2/37 ° C. Upprepa laserbestrålning för ett minimum av tre oberoende mätningar.
    OBS: Olika bestrålningstider och pulsfrekvenser kan väljas, beroende på tillämpning.
  3. Karakterisera lasern i termer av stråldiameter och laser irradians (W ∙ cm -2).
    1. För en vanlig enkelmodfiber, använd NA = n ∙ sin θ,där n är brytningsindex hos mediet i användning och θ är den halv-vinkel av könen av ljus som lämnar fibern (se figur 1A). Från trigonometri, r = tan θ ∙ d, där r är strålradie och d är avståndet mellan fibern och provet. FC kontakten passar diametern av brunnen, därför belysa provet på ett avstånd d = 2.70 ± 0,20 mm. Ljus lämnar fibern i vatten (n = 1,33), vilket ger r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d.
    2. Använda den senare ekvationen, beräkna laserstrålen radien, motsvarande balkområdet och den genomsnittliga laser irradians (lasereffekt dividerat med strålen område) vid målet (se exempel grafen i figur 1B). Dessa värden representerar den genomsnittliga irradiansen över det belysta området.
    3. Utvärdera felen för mätningar med den allmänna teorin för felutbredning.
      Obs: Avståndet bÅren FC-kontakt och provet kan mätas med fotografier av den experimentella arrangemanget och efterbearbetning av bilden med användning av lämplig mjukvara (t.ex. ImageJ).
  4. Vid dag 5, avlägsna celldifferentieringsmedium från experimenten och fixera proverna med 3,7% (volym / volym) formaldehydlösning under 10 min, sedan permeabilisera cellerna med 0,1% (volym / volym) Triton X-100 under 20 min.
  5. Lägg 3% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA) till proverna för 60 min för att blockera oreagerade proteinbindningsställen. Märk proverna för anti-βIII-tubulin över natten (5 | ig / ml i PBS kompletterad med 1% BSA) vid 4 ° C.
  6. Inkubera cellerna i 90 minuter i mörker med en lämplig sekundär antikropp (t.ex. TRITC-konjugerad anti-mus-IgG-antikropp) genom att använda en koncentration av 0,4-2 | ig / ml i 1% BSA i PBS. Märka cellkärnor med DAPI (0,1 ^ g / ml i avjoniserat vatten) under 10 min.
    OBS: Antikropps konjugering och koncentration might variera beroende på företagets protokollet. Tvätta prover med PBS två gånger i 5 min efter varje färgning skede.
    Figur 1
  7. Bild prover av epifluorescence eller konfokalmikroskopi använder åtminstone en 20 × objektiv. Välj mikroskopet filtrerar således till den sekundära antikroppen. Välj ett DAPI filter (λ EX = 358 nm, λ EM = 488 nm) för att visualisera cellkärnorna.
  8. Analysera bilderna genom att bedöma: i) den högsta neurite längd (rekord längden från spetsen av neurite till början av cellkroppen), ii) antalet neuriter per neuronal cell (summera alla neuriter per cell) och iii) procentandelen celler med neuriter (dela upp det totala antalet celler som uttrycker βIII-tubulin med det totala antalet celler med ett positivt färgade kärna) 19.

4. laserinducerad intracellulära Ca2 + Imaging

Bered en 20% (vikt / volym) stamlösning av Pluronic F-127 genom att lösa 2 g löst ämne i 10 ml vattenfri dimetylsulfoxid (DMSO). Värm lösningen av Pluronic F-127 vid 40 ° C under ca 20 min för att öka lösligheten. Förbered det i förväg om den förvaras vid RT.
  • På dag 3 efter NR inkubation, förbereda en balanserad saltlösning (BSS; 135 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 5,6 mM glukos och 10 mM HEPES, pH 7,4), och kompletterade ansökan med 5 iM av Fluo-04:00 i DMSO och 0,1% (vikt / volym) Pluronic F-127-lösning.
    Obs: BSS-lösning kan beredas i förväg och förvaras i kylskåp i högst 1 månad. Lägg tilläggen (Fluo-4:00 och Pluronic F-127) på dagen för experimentet.
  • Ta bort celldifferentiering medium och ersätta det med det kompletterade BSS-lösning. För att uppnå bästa resultat med ett inverterat konfokalmikroskop, inkubera cellerna i en mikro-slide väl.
  • Last NG108-15 celler med Fluo-4:00under 30 min i mörker vid 5% CO 2/37 ° C. Efter inkubationstiden, tvätta proverna två gånger med BSS att avlägsna eventuellt extracellulära obelastat fluorofor.
  • Par lasern med en optisk singelmodfiber och klyva spetsen med användning av standardtekniker. Notera vilken spetsen under ett optiskt mikroskop, för att säkerställa en hög kvalitet yta (dvs spetsen bör vara vinkelrät mot fiberaxeln och platt vid mikroskopi inspektion).
    1. Mät utgångslasereffekt med en vanlig effektmätare. Sätt ljuset leverans fibern in i en optisk fiberhållare och sätt fast den på en micropositioner. Se Brown et al. 20 för mer information om förberedelse och positionering optisk fiber.
      Varning: Följ allmänna regler för lasersäkerhet under mätningen av lasereffekt (t.ex. inte titta direkt in laserstrålen, bära laserskyddsglasögon vid hantering, förhindra ströljus exponering för andra lab användare) <./ Li>
  • Anslut ett oscilloskop till den bärbara laser för att övervaka den optiska modulering. Använd en binär signal med variabla frekvenser (0,5-2 Hz) och pulslängder (20-100 ms). Anslut lasern använder modulationssignalen som transistor-transistorlogik (TTL) ingång för mikroskopet, efter installationen visas i Paviolo et al. 13.
    1. Placera cellerna under ett inverterat konfokalmikroskop och placera ljusleveransfiber 250 ± 50 pm ifrån målcellen i transmissionsbelysningsläge. På detta avstånd, använd ekvation presenteras i 3.3.1 att beräkna balkradien vid målet.
  • Använd en argonjonlaser (488 nm) för att excitera interna Fluo-04:00 färgämne (λ EX = 494 nm; λ EM = 516 nm) och den synkroniserade LD för excitation av de endocyteras NR. Utför avbildning vid RT av prover och kontroller med hjälp av åtminstone en 40 × objektiv genom att samla tidsserie skannarmed 256 × 256 pixlar / bildupplösning i retur-läge med en frekvens på minst 4 Hz. Utför en inspelning utan LD excitation att identifiera eventuella argonjonlaser interferens (baslinje brus).
  • Ta bort bakgrunden från data med hjälp av adaptivt viktade straffas minsta kvadratalgoritmer 21. Rita de inducerade Ca 2 + variationer som en funktion av tiden. Analysera transienta toppar i fluorescensintensiteten med hjälp bild efterbehandling programvara genom tröskling på en nivå tre gånger standardavvikelsen för baslinjen brus (3σ).

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Genom att använda protokollen 1, 2 och 3 som beskrivs här, var en stimulerande effekt på differentiering observerats i NG108-15 neuronala celler odlade med Au NP (Au NR, poly (styrensulfonat) -belagda Au NR och kiselbelagd Au NR) efter laser exponeringar mellan 1,25 och 7,5 W · cm -2. Konfokala bilder av rhodamineB-märkt Au NR visade att partiklarna var intern från dag 1 av inkubation 12. Lokaliseringen ades observerades främst i cellens cytoplasma, vilket tyder på att den föredragna mekanismen för upptag var via cellkroppen membranet 12. De huvudsakliga morfologiska förändringar som upptäcks efter att inducera differentiering i NG108-15 neuronala celler var gripandet av proliferation, uttrycket av βIII-tubulin protein och utväxt av neuriter, vilket analyserades med avseende på maximal längd och antal 22.

    Prover odlade med NR visade en ökning neurite längd vid laser irradiringsnivåer uppmätta här (mellan 1,25 och 7,5 W · cm -2). Kontrollprover (celler odlade utan NPS och bestrålade med samma lasereffekt) visade ingen signifikant förändring i längd. Använda en strålningsdos om 7,5 W · cm -2, den slutliga neurite längd NG108-15 odlade med Au NR var ungefär 36% högre (p <0,01) än de icke-laser-bestrålat prover. Det här beteendet blev inte specifikt kopplat till ytkemi av NR. Dessa värden var nästan 20% högre än de neuriter utvecklats av NG108 -15 ensam och utsätts för samma värde av laserexponering (p <0,05) 12. Dessa resultat är i linje med tidigare publicerade studier på PC12 neuronala celler odlade med piezoelektriska nanorör och bestrålade med ultraljud strålning 7.

    Kontrollexperiment utan Au NR visade också några stimulerande effekterna av den 780 nm ljus uttryckt i procent av nervceller med neuriter och antal neurites per neuron. Denna stimulering var effektivare vid lägre lasereffekter (1,25 W ∙ cm -2) med en efterföljande minskning på högsta laserenergi (7,5 W ∙ cm -2) 12. En måttlig stimulering som orsakas av de nationella parlamenten utan laser bestrålning (poly (styrensulfonat) -belagda och kiselbelagd enbart) detekterades i andelen nervceller med neuriter 12. Dessa resultat är i linje med nyligen publicerade observationer att guldnanopartiklar kan öka neuronal aktivitet in vitro 23,24. Figur 2 visar ett exempel på epifluorescence bilder av differentierade NG108-15 neuronala celler odlade enbart (Figur 2A) eller med Au NR (Figur 2B ) och bestrålades med olika lasereffekter (indikeras i figuren).

    Potentialen för fotogenererade intracellulär Ca2 + frisättning utvärderades med hjälp pulsad NIR ljus enligt protokollen 1, 2, och4. Kalciumjoner spelar en viktig roll i olika cellulära aktiviteter, såsom mitos, muskelkontraktion och neuritförlängning 25,26. Som svar på ett stimulus, Ca2 + ökar, oscillerar och minskar, vilket leder till aktivering, modulering eller avslutande av en specifik cellfunktion. Nyligen har Ca2 + transienter också observerats som en följd av IR-laserexponering i kardiomyocyter. I det arbetet har Ca2 + svar framkallade efter IR exponering uppvisade lägre amplituder och snabbare återhämtning gånger än de spontana Ca 2 + transienter 2. Figur 3 visar ett exempel på NG108-15 neuronala celler laddade med Fluo-4:00 och avbildas med en konfokalt mikroskop. Fluo-04:00 observerades att komma in i cellmembranet på ett icke-störande sätt, vilket resulterar i en generellt enhetlig fördelning av indikatorn över cellcytoplasman. Endast mindre kärnkraft eller cytoplasmatisk organell färgning upptäcktes. Såsom tidigare indikeratsAdes NR förväntas vara placerad intracellulärt 12. NG108-15 ensamma neuronala celler eller odlade med Au NR och poly (styrensulfonat) -belagda-Au NR utsattes därefter för laser irradiances mellan 0,07 J ∙ cm -2 och 370 J ∙ cm -2, med laserfrekvensmodule i intervallet av 0,5-2 Hz.

    Figur 4 visar representativa exempel på hur amplituden av svaren kartlades som en funktion av tiden. Amplituden för den Ca2 + respons varierar med strålningsexponering (Figur 4A - C) och observerades inte att konsekvent utlösas av laserpulserna (Figur 4C) 13. De mest troliga förklaringar var övergående utarmning av intracellulära Ca2 + butiker skrivs ofullständig Ca2 + laddar 2 eller annan effektivitet NR interna i nervceller. När NR inte användes i culture (kontrollexperiment, figur 4D), en stimulerande effekt på 780 nm ljus observerades också. Men producerade denna lägre fluorescens amplitudtoppar och lägre sannolikhet för aktivering (upptäcktes i endast 16% av de analyserade proverna). Sammantaget var en 48% sannolikhet för NR laser-inducerad cellaktivering uppnås och trots bakgrundshändelser på grund av 780 nm ljus, exponering av NR-behandlade celler visade högre stimulering effektivitet med lägre laserenergi och högre toppar i svar 13. I själva verket var den kalciumsvaret befunnits topp på 0,33 J ∙ cm -2 i NR-behandlade cellerna. Detta tillskrevs termisk inhibition 13. Under experimenten, inga tecken på blåsbildning eller någon annan form av cellmembranet störningar upptäcks, vilket överensstämmer med resultaten från Huang et al. Som rapporterade cellulär fotodestruktion med en relativt hög effekttäthet på 19 W ∙ cm -2 ansökt om 4 min 27. Ingen spontan aktivitet i NR-behandlade cellerna registrerades utan laserexponering.

    Figur 1
    Figur 1: Fiber experimentuppställning (A) och de genomsnittliga laser irradiances som en funktion av lasereffekt för en laserstråle arean uppgår till 0,4 mm 2 (B). Beam parametrar är (A): den halv-vinkel av den maximala kon av ljus som lämnar fibern (θ), bommen radien (r) och avståndet mellan den optiska fibern och provet (d).

    Figur 2
    Figur 2: Exempel på epifluorescence bilder av differentierade NG108-15 neuronala celler odlade enbart (A) eller med Au NR (B) och bestrålas med olika laser befogenheter (anges i figuren). Prover var jagncubated för en dag före laserbestrålning. Celler fixerades och märkt för anti-β-III tubulin (röd) och DAPI (blå) tre dagar efter laserstrålning. Skalstrecken är 100 | im.

    Figur 3
    Figur 3: Exempel på differentierade NG108-15 neuronala celler laddade med Fluo4-AM Ca 2 + indikator Bilden togs med hjälp av en inverterad konfokalmikroskop med 40X oljeimmersionsobjektiv..

    Figur 4
    Figur 4: Representativa exempel på laserinducerade Ca 2 + variationer som en funktion av tiden i NG108-15 neuronala celler odlade i serumfria betingelser i tre dagar med (A) poly (styrensulfonat) -Au NR, (B, C) au NR, och (D) utan NR (kontrollprov). Dessa resultat varerhålls med laserpulser av 100 ms (A, C, D) och 50 msek (B). De frekvenser som används för experimenten (streckade vertikala linjer) var 1 Hz (A - C) och 0,5 Hz (D). De beräknade strålande exponeringar var 69,4 J ∙ cm -2 (A), 34,7 J ∙ cm -2 (B), 0,37 J ∙ cm -2 (C) och 138,87 J ∙ cm -2 (D). F max / F 0 anger den maximala ökningen fluorescens detekteras i NG108 -15 neuronala celler, från kalibrering med ionomycin (återges med tillstånd 13).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De protokoll som beskrivs i denna presentation beskriver hur kulturen, differentiera och optiskt stimulera nervceller använder yttre absorbenter. NR egenskaperna (till exempel dimensioner, form, plasmonresonans våglängd och ytkemi) och laserstimuleringsparametrarna (såsom våglängd, pulslängd, repetitionshastighet etc.) kan varieras för att passa olika experimentella behov. Effekterna på cellbeteende kan övervakas med användning av standard biologiska analyser och material. Övergripande metod ger en enkel, men ändå kraftfullt, sätt att bestråla cellpopulationer in vitro och kan utvidgas till primära celler, vävnadsprover och in vivo-studier.

    De viktigaste kraven som Au NR måste uppfylla för att användas för biologiska tillämpningar är stabilitet (både kemiska och fysikaliska) och biokompatibilitet. Det senare är särskilt kritisk, på grund av närvaron av ett katjoniskt ytaktivt medel (gemensamtly CTAB) på ytan av Au. CTAB är känt för att framkalla cytotoxicitet både in vitro 28 och in vivo 29 och det är vanligt förekommande under syntesprocessen för att driva NR-formen bildning 30. Stabilitet och biokompatibilitet ofta förbättras genom att deponera ytterligare beläggningar på Au NR ytan (t.ex. polyetylenglykol, kiseldioxid) 31. För att bedöma biokompatibilitet, kan olika analyser användas in vitro (t.ex. levande / döda, MTS, MTT, etc.) medan histologisk analys utförs ofta under vävnadsexperiment 7,8,12,15.

    En annan utmaning att möta när man arbetar med nanomaterial är svårigheten att korrekt fastställa deras molkoncentration. Den enorma mängd NP i termer av form, storlek och kemiska egenskaper gör teknikerna tillgängliga lämpliga för endast vissa klasser av partiklar. Till exempel, standard dynamisk ljus scattering metod utgår från att NP har en sfärisk form och sprider ljus isotropiskt 17. Därför tillämpning av denna metod till Au NRS resultat i avvikelser mellan uppmätta koncentrationen och den riktiga. Frågan om NP koncentrationen är särskilt problematiskt om anknytning till nanomedicin fältet, där koncentrationen administrerade måste noggrant kontrolleras för att maximera effekten av processen (t.ex. för drug delivery-program) och minimera toxiciteten av nanomaterial 17. I de studier som rapporteras här, den optiska densiteten användes gav goda resultat i termer av cellviabilitet och partikelantalet.

    På grund av deras inneboende absorptionsegenskaper, är Au NP används ofta i kombination med en laserkälla. Under exponeringen, absorption och spridning är de två huvudprocesser som kan förväntas uppstå på ytan av de nationella parlamenten. Om laservåglängd matchar plasmonresonans våglängd, absorption oftaföreträde framför spridning, spännande ledningselektroner vid NP ytan. Dessa bildar en elektron gas som rör sig bort från sitt jämviktsläge och skapar en resonans sammanhängande svängning kallas lokaliserade ytplasmonresonans (LSPR). Energin överförs sedan till NP kristallgittret som värme, som därefter avleds snabbt in i den omgivande miljön 32. Eftersom värme är den huvudsakliga effekten observerades efter excitation av NR LSPR, är det lämpligt att övervaka cellviabiliteten efter laserexponering.

    Det har antagits att de observerade effekterna på neuritutväxt och den intracellulära Ca2 + väg berodde på övergående värme som uppstår excitation av LSPR. Denna hypotes är i linje med aktiveringen av temperaturkänsliga TRPV1 kanalen efter magnetisk exponering av ferrit NP 5. Denna process är också överens med observationer som värmekänsliga TRPV4 kanaler PLAy en viktig roll i infrarött nervstimulering 33. På molekylär nivå, har det nyligen visat att TRPV4 är värmekänsligt först efter interaktionen av fosfoinositid -4,5 -biphosphate (PIP 2) med kanalen 34. Därför är det möjligt att den transienta värme uppkommit efter NR excitation kunde tjäna till att accelerera och / eller inducerar öppnandet av TRPV4 kanalerna. Denna hypotes kan bekräftas genom framtida Ca2 + experiment med hjälp Ca2 + - medium och / eller molekylära kontroller över PIP 2 utarmning.

    Olika grupper har också visat att små temperaturgradienter över fysiologiska temperaturområdet kan användas för att framkalla andra svar, såsom neuronal tillväxt konen vägledande 25 eller depolariserande strömmar i humana embryonala njurceller 35. Yong och medarbetare noterade en betydande ökning i elektrisk signalaktivitet i primär hörselneuroner kulteras med kiselbelagda Au NR efter laserstrålning av NR på LSPR. Uppvärmningen produceras av laserbestrålade partiklar mättes med patch-clamp teknik 14. Mer nyligen EOM et al. Registreras en ökning av amplituden hos CNAPs efter laserexponering av 3,4 x 10 9 Au NR vid kontinuerlig perfusion i närheten av höljet av nervknippet på en råtta ischiasnerven 15.

    Den stimulerande effekten av 780 nm laserdiod observerats under experimenten var inte kopplad till värme som alstras av vattenabsorption, eftersom detta är känt för att vara försumbar vid 780 nm 36. Tidigare publicerade resultat har också rapporterat stimulerande effekterna av 780 nm ljus på neuronal vävnad in vivo 37,38. In vitro studier har visat att medverkan av reaktiva syreradikaler i processen 39. Men de detaljerade mekanismer genom vilka NIR stimulering påverkar gen transcription och andra cellulära aktiviteter är för närvarande olöst. Nuvarande data tyder samspelet mellan olika effekter i stimuleringen, inklusive fotonabsorption inom kromoforer i mitokondrierna (nästan 50% av energin vid 780 nm kan absorberas av cytokrom c oxidas) 37,39-41, förändringar i membranpermeabiliteten till kalcium 37 och hämning av inflammatorisk aktivitet i cellerna 37.

    De resultat som presenteras i detta manuskript visar att nanopartiklar dämparna är mycket lovande för framtida tillämpningar inom optisk stimulering av nervceller. Den huvudsakliga fördelen ligger i förmågan hos NIR ljus att tränga djupt in i vävnader (terapeutiskt fönster). Dessa resultat visar också att nanopartiklar dämparna kan förstärka och / eller byt processen med infraröd neural stimulering baserad på vattenabsorption. För framtida tillämpningar inom neurala proteser, skulle det vara av intresse att undersöka annan yta functionalizatjoner med kemisk affinitet för neuronala axoner, som är de viktigaste målen för många optiska stimuleringsapplikationer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Författarna vill tacka för NanoVentures Australien för resor finansieringsstöd och Prof. John Haycock för att ha delvis värd denna forskning vid University of Sheffield och Ms Jaimee Mayne för hennes hjälp under inspelningen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Au NR Sigma Aldrich 716812
    NG108-15 Sigma Aldrich 8811230
    DMEM Sigma Aldrich D6546
    FCS Life Technologies 10100147
    L-glutamine Sigma Aldrich G7513
    Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140122
    Amphotericin B Life Technologies 15290018
    Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
    Triton X-100 BDH T8532
    BSA Sigma Aldrich A2058
    Anti-βIII-tubulin Promega G7121
    TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody Sigma Aldrich T5393
    DAPI Invitrogen D1306
    Fluo-4 AM Invitrogen F14201
    DMSO Sigma Aldrich 472301
    Pluronic F-127 Invitrogen P6867
    UV-Vis spectrometer Varian Medical Systems Inc. Cary 50 Bio
    Mini centrifuge Eppendorf Mini Spin
    Sonic bath Unisonics Australia FPX 10D
    Cell culture incubator Kendro Hera Cell 150
    Cell culture centrifuge Hettich Rotofix 32A
    Laser diode Optotech 780 nm single mode fibre - coupled LD
    Optical fiber Thorlabs 780 HP
    Power meter Coherent Laser Check
    ImageJ http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
    Epifluorescent microscope Axon Instruments ImageX-press 5000A
    μ-slide well Ibidi 80826
    Inverted confocal microscope Carl Zeiss Microscopy Ltd. LSM 510 meta-confocal microscope
    Oscilloscope Tektronix TDS210

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).
    2. Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).
    3. Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).
    4. Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).
    5. Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles. Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).
    6. Farah, N., et al. Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation. J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).
    7. Ciofani, G., et al. Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation. ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).
    8. Kim, J. A., et al. Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).
    9. Myroshnychenko, V., et al. Modelling the optical response of gold nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).
    10. Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods. Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).
    11. Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging. Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).
    12. Paviolo, C., et al. Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth. Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).
    13. Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients. J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).
    14. Yong, J., et al. Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons. Adv. Healthcare Mater. , (2014).
    15. Eom, K., et al. Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods. Small. , (2014).
    16. Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L. M., Mulvaney, P. Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications. Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).
    17. Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration. Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).
    18. Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. Shape separation of gold nanorods using centrifugation. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).
    19. Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function. Glia. 59 (5), 734-749 (2011).
    20. Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation. JoVE. (77), (2013).
    21. Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra. J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).
    22. Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
    23. Jung, S., et al. Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain. PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).
    24. Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity. J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).
    25. Ebbesen, C. L., Bruus, H. Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance. J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).
    26. Iwanaga, S., et al. Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells. Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).
    27. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles. Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).
    28. Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
    29. Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat. Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).
    30. Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L., Mulvaney, P. Gold nanorods: synthesis, characterization and applications. Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).
    31. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).
    32. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).
    33. Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).
    34. Garcia-Elias, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).
    35. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), (2012).
    36. Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Müller, G. Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm. J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).
    37. Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).
    38. Wu, X., et al. 810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord. Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).
    39. Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. 780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species. Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).
    40. Wong-Riley, M. T. T., et al. Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase. J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).
    41. Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach. Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).

    Tags

    Neuroscience guldnanostavar extern absorbator neural stimulering laserexcitation optisk stimulering neuronala celler,
    Guld nanorod Assisterad Optisk Stimulering av nervceller
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Paviolo, C., McArthur, S. L.,… More

    Paviolo, C., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (98), e52566, doi:10.3791/52566 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter