Introduction
الجلد هو أكبر عضو في الجسم. فإنه يخلق حاجزا بين البيئة الخارجية والأعضاء الداخلية. وعلاوة على ذلك، والجلد يحمي الجسم من فقدان السوائل، والتأثيرات البيئية والإصابات والالتهابات ويساعد على تنظيم درجة حرارة الجسم 1. نظرا لموقعها المكشوفة، وغالبا ما يتأثر الجلد عن طريق الصدمات الميكانيكية والحرارية أو الكيميائية. على الرغم من أن الجلد قادر عموما من إصلاح الذات، ويمكن لعوامل محلية متعددة مثل العدوى، والأوكسجين، والاكتفاء الوريدي يؤدي إلى ضعف التئام الجروح. ويمكن أيضا التئام الجروح أن تدخلت عوامل جهازية مثل السمنة، وإدمان الكحول، والتدخين، والأدوية، والتغذية، والأمراض مثل مرض السكري. 2
ويمكن تقسيم عملية التئام الجروح إلى 3 مراحل: (ط) المرحلة التهابات، (ب) والتكاثري و(ج) مرحلة التجديد. على إصابة الجلد، وتبدأ عملية معقدة إشارة الشلال، مما أدى إلى إغلاق الجرح. 3بعد الإصابة، الجرح ينزف ويتم تشكيل لتجلط الدم. الليفية تتحرك في تجلط الدم واستبدالها الأنسجة الجديدة التي تم تشكيلها في وقت لاحق على مدى سنوات.
الفهم الحالي للإصلاح الجلدي العمليات البيولوجية الكامنة محدودة. وقد استخدمت النماذج الحيوانية والخنازير الصغيرة لدراسة التئام الجروح. ومع ذلك، فإن هذه النتائج لا يمكن نقلها مباشرة إلى البشر يرجع إلى الاختلافات بين الأنواع محددة. وبالإضافة إلى هذه النماذج في الجسم الحي، وبعض جوانب التئام الجروح يمكن دراستها من خلال محاكاة الوضع الجرح عن طريق الخدش في المختبر الثقافات أحادي الطبقة على أساس خطوط الخلايا خلد أو الخلايا الأولية. 4 وهذه النماذج الخدش موحدة للغاية ولكن لا يعكس بما فيه الكفاية تعقيدا في الجسم الحي علم وظائف الأعضاء. 5 وإلى جانب النماذج ثنائية الأبعاد، وقد وضعت ثلاثية الأبعاد في حكمه الجلد البشري للأبحاث الأمراض الجلدية. الجزء الجلدي من هذه النماذج وجنرال الكتريكnerated باستخدام مختلف السقالات بما في ذلك الأدمة decellularized، 6 الهلاميات المائية الكولاجين، 7،8 الجليكوزامينوجليكان 9 أو المواد الاصطناعية. 10 توظيف هذه حكمه الجلد، ودور طلائي الوسيطة التفاعلات 11، وإعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري، والحديث المتبادل الخلوي بين الخلايا الليفية والخلايا الكيراتينية و تأثير عوامل النمو المختلفة يمكن دراستها. وعلاوة على ذلك، وهذه النماذج هي مفيدة لاكتساب معارف جديدة حول كيفية تهاجر الخلايا الليفية إلى منطقة الجرحى وكيف تؤثر عوامل الانجذاب الكيميائي تجديد الأنسجة. 12
ليس فقط جيل من التئام الجروح النموذج نفسه هو أمر صعب، ولكن أيضا لإنشاء الجرح موحد للغاية في النموذج هو إشكالية. التقنيات الشائعة لخلق الجروح هي اختبارات الصفر، 13 والحروق، 14 الشريط التآكل، و15 إصابة الحرارية، 16 بثور شفط والنيتروجين السائل 17، 18 أشعة الليزر، و19 18 meshers 6 و اللكمات الخزعة. 20 ومعظم هذه الطرق لها نفس المزالق. إصابات تنفيذها يدويا من الصعب توحيد وإعادة إنتاج بين اختبارات متعددة. حجم وشكل وعمق الجرح تختلف بين الدراسات، وبالتالي يؤثر سلبا على نوعية البيانات البحثية. استخدام الليزر لتعريف جرح الجلد يمكن موحدة بسهولة نسبيا ولكن يؤدي إلى حالة محاكاة حروق. الحرارة التي تطبقها ليزر يمكن أن يسبب البروتين تمسخ، الصفائح الدموية أو تجميع السفن انقباض، والتي يمكن أن تؤدي إلى الأنسجة الميتة.
في نهج بديل، قمنا بتطوير جهاز جرح الآلي (AWD)، والذي يسمح لنا لتوليد الجروح الجلدية محددة ودقيقة تحت ظروف معقمة. المعلمات إصابة، مثل عمق وسرعة الاختراق وكذلك الثورات من رأس الحفر يمكن تنظيمها. في هذه الدراسة، ونحن الجمع بين AWD مع في منزل وضعت سمك الكامل في حكمه الجلد (قدمSE) التي هي مماثلة لبروتوكول نشرتها Gangatirkar وآخرون. 8 طبقة الجلد ما يعادل الجلد يتكون من الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (اتش دي اف)، والتي هي جزء لا يتجزأ في الكولاجين I هيدروجيل. على طبقة الجلد، الكيراتينية البشرة الإنسان (كلوة) هي المصنفة. في غضون أسبوعين في واجهة الهواء السائل وكلوة بناء على البشرة يتألف من عدة طبقات الخلايا الحيوية والطبقة القرنية. إلى جانب جيل من هذا النموذج، وتظهر هذه الدراسة استخدام AWD لخلق جروح محددة ودقيقة في مؤشر فاينانشال تايمز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تصميم بروتوكول لإنتاج 24 كامل سماكة الجلد في حكمه. الخلايا الليفية الجلد والخلايا الكيراتينية البشرة الإنسان تم عزل من خزعات الجلد وفقا لبروتوكول نشرت سابقا. تم الحصول على موافقة 21،22 مطلعة مسبقا وتمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاق المؤسسية على البحوث الإنسان من يوليوس ماكسيميليان جامعة فورتسبورغ (التصويت 182 / 10).
1. إنتاج الجلدية مكون
- حل الكولاجين مع حمض الخليك بنسبة 0.1٪ إلى التركيز النهائي من 6 ملغ / مل. من أجل حل تحييد هلام، ومزيج 232.5 مل 2X DMEM، 7.5 مل مصل العجل الجنين، 7.5 مل 3 M HEPES، 2.5 مل كبريتات شوندروتن (5 ملغ / مل). تبقي جل حل تحييد وحل الكولاجين على الجليد. حساب 500 ميكرولتر من هلام في يعادل إدراج / الجلد.
ملاحظة: كما سوف تكون مختلطة الحل هلام تحييد مع جزأين من حل الكولاجين prepaإعادة مبلغ مزدوج من الكولاجين. - وضع 24 إدراج الى 24 لوحة جيدا.
- و resuspend الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (اتش دي اف) في 10 مل DMEM، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 270 x ج وعدد الخلايا. استخراج المبلغ اللازم من HDF (5 × 10 4 خلايا لكل 500 ميكرولتر الكولاجين هلام) وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 270 ز س.
- إزالة طاف وبعناية resuspend واتش دي اف في 4 مل تبريد هلام حل تحييد دون إنتاج فقاعات الهواء. من هذه الخطوة تأكد للعمل في أسرع وقت ممكن لتجنب ترسيخ السابق لأوانه المواد الهلامية الكولاجين.
- Resuspend وحل مع 8 مل من محلول الكولاجين.
- خذ الكولاجين خلية خليط مع ماصة متعددة الخطوات وملء بسرعة 500 ميكرولتر من الخليط في كل إدراج. احتضان المواد الهلامية لمدة 20 دقيقة في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2) لالهلام المواد الهلامية.
- غمر المواد الهلامية في 2 مل Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) + 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) لكل بئرواحتضان لمدة 24 ساعة في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2).
2. إضافة رايتس والبشرة الخلايا الكيراتينية (كلوة)
- إزالة المتوسطة بعد 24 ساعة. حل البروتين البشري فبرونيكتين مع الماء عالى النقاء لتركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل. تغطية كل الجلد ما يعادل 25 ميكرولتر من محلول فبرونيكتين. احتضان المواد الهلامية لمدة 30 دقيقة في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2).
- في غضون ذلك، resuspend وكلوة في 10 مل KGM-2 ووضع تركيز خلية إلى 1 × 10 6 خلية / مل مع KGM-2 جاهزة + 5٪ FCS. البذور 1 × 10 5 كلوة على كل هلام. احتضان المواد الهلامية لمدة 45 دقيقة في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2) للسماح للخلايا الالتزام.
- Submerse المواد الهلامية مع KGM-2 جاهزة + 5٪ FCS والثقافة لهم في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2).
3. ثقافة الكاملة حكمه سماكة الجلد (FTSE)
- ثقافة مؤشر فاينانشال تايمز لمدة 6-7 أيامفي تنازلي FCS-التركيز (5٪ و 2٪ و 0٪ FCS). تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام مع انخفاض تركيز FCS المقبل. لهذا، وإزالة تماما على المدى المتوسط وإضافة 1.6 مل من المتوسط الطازجة.
- في يوم 7، وإزالة المتوسطة تماما.
ملاحظة: لا تلمس سطح FTSE مع غيض من ماصة أثناء القيام بذلك. - ضع كل إدراجها في 1 بئر من لوحة 6 جيدا مع ملقط معقم. إضافة 1.5 مل النقل الجوي المتوسطة لكل بئر، وضمان عدم الرطب سطح FTSE. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام لمدة 14 يوما إضافية.
ملاحظة: مستوى ملء المتوسط هو ما يصل الى الغضروف المفصلي للمؤشر فاينانشال تايمز.
4. تحليل النسيجي
- تحديد والبارافين التضمين من مؤشر فاينانشال تايمز
- إزالة مستنبت، ونقل إدراج في طازجة 24 لوحات جيدة وإصلاح الأنسجة بإضافة 1.6 مل من 4٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر واحتضان الأنسجة لمدة 2 ساعة على RT. الحذر! Paraformaldehyd غير سامة، والتعامل معها تحت غطاء الدخان. نقلمؤشر FTSE إلى كاسيت تضمين الأنسجة. إزالة ما تبقى تثبيتي عن طريق الغسيل بالماء ويذوى الأنسجة باستخدام تركيزات الإيثانول تصاعدي.
- تقسيم ما يعادل الجلد عن طريق خفض العمودي في الوسط. ضع قطعتين في قاعدة معدنية العفن مليئة البارافين مع قطع السطوح أسفل. إضافة كاسيت الأنسجة على رأس القالب بمثابة الدعم.
- قطع 3-5 ميكرون شرائح وتطفو منهم على 40 ° C حمام الماء لstraitening، جبل الشرائح على الشرائح المجهر مناسبة. شرائح جافة تماما.
- الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) والمناعى (IHC) تلطيخ
- مكان الشرائح في رف واحتضان لمدة 1 ساعة على 60 درجة مئوية. تأكد من أن البارافين وذاب. وصمة عار ممهى شرائح مع H & E كما لمحة تلطيخ موحد.
- لH & E تلطيخ إعداد 4x وcuvettes الزجاج تلطيخ مع زايلول، 3X مع الايثانول 96٪، 2X مع الايثانول 70٪، 1X مع الايثانول 50٪، 4X الماء منزوع الأيونات، 1X الهيماتوكسيلين، 1X حمض الهيدروكلوريك الإلكترونيthanol (13.7 مل 1 M حمض الهيدروكلوريك الإعلان 200 مل 50٪ من الإيثانول)، 1X التبويب المياه، 1X يوزين (1 غرام يوزين في 100 مل من الماء منزوع الأيونات) و2X 2-بروبانول.
- مكان الشرائح 10 دقيقة في زايلول I و 10 دقيقة في زايلول الثاني لdeparaffinize وترطيب الشرائح. تراجع الشرائح 3X في الإيثانول 96٪ I، 3X في الإيثانول 96٪ II، 3X في الإيثانول 70٪ و3X في الايثانول 50٪. تدوير الشرائح في الماء منزوع الأيونات. التفريق صبغ الهيماتوكسيلين، 2X تراجع في حمض الهيدروكلوريك الإيثانول. شطف في الماء منزوع الأيونات. لblueing، ومكان الشرائح 5 دقائق في الماء التبويب. ليوزين تلطيخ مكان الشرائح 1 دقيقة في يوزين ويغسل بعد ذلك في الماء منزوع الأيونات. للجفاف، والشرائح تراجع 2X في الإيثانول 70٪، 2X في الإيثانول 96٪ ووضعها لمدة 5 دقائق في 2-بروبانول الأول، لمدة 5 دقائق في 2-بروبانول II، 5 دقائق في زايلول I و 5 دقائق في زايلول II. بعد H & E تلطيخ، هي ملطخة نوى الخلايا في الزرقاء، والسيتوبلازم والمصفوفة خارج الخلية هي ملطخة باللون الأحمر.
- لاسترجاع مستضد، وإزالة البارافين مع الزيلين وترطيب شرائح للتلطيخ. شرائح مكانفي طنجرة البخار وطهي شرائح deparaffinized وممهى لمدة 20 دقيقة في مرحلة ما قبل ساخنة 10 ملي العازلة سيترات (الرقم الهيدروجيني 6).
- مكان الشرائح في غسل العازلة (PBS عازلة + 0.5٪ Polysorbat 20) وشرائح دائرة مع السائل الشريحة طارد علامة من ركلة جزاء أو الماس القلم.
- وضع الشرائح في غرفة الرطوبة. منع البيروكسيداز الذاتية، وذلك بإضافة 100 ميكرولتر 3٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين على كل شريحة. الحذر! خطرة جدا في حالة الجلد والعين للإتصال به. التعامل مع معدات الحماية الشخصية. غسل الشرائح في غسل العازلة.
- تطبيق الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. غسل الشرائح ثلاث مرات مع غسل العازلة. من هنا، يجب أن تبقى العينات في الظلام.
- استخدام نظام كشف البيوتين streptavidin للكشف عن معين ملزم مستضد الضد.
- مباين نوى مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة. يذوى وجبل الشرائح.
- عينات الصورة باستخدام مجهر معكوس.
- إعداد AWD من قبل تطهير منطقة العمل مع 70٪ من الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية. تأكد من أن رؤساء الحفر من الحجم المطلوب (على سبيل المثال، 1 مم) والمرفقة.
- ضع حكمه الجلد في مناطق معينة من لوحة الناقل عينة تعقيمها باستخدام ملقط معقم. وضع لوحة الناقل عينة في المقبس تحت الرأس الحفر.
- استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لتعيين المعلمات اصابة النحو التالي: تدور سرعة: 15،000 دورة في الدقيقة. الاختراق: 1.5 مم؛ الدفع: 100 هرتز. وتحتاج هذه المعلمات إلى تعريف لكل نوع عينة على حدة. نقل جرح المعلمات إلى AWD.
- بدء اصابة الإجراء. إزالة عينة لوحة الناقل من المقبس. جرح نقل FTSE مرة أخرى إلى إدراج تستخدم للثقافة باستخدام ملقط معقم.
- المضي قدما ثقافة FTSE الجرحى في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2) للتحقيق في التجدد. آلternatively، استخدام نماذج للتحليل النسيجي في أي وقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وHDF معزولة وكلوة تختلف سواء في التشكل والتعبير عن علامات نموذجية. أظهرت HDF نموذجي المغزل شكل التشكل، في حين مورفولوجية كلوة يمكن وصفها من قبل التشكل المرصوفة بالحصى. واتسمت الخلايا عن طريق تلطيخ المناعى (الشكل 1) قبل استخدامها لFTSE. وHDF إيجابية لفيمنتين (الشكل 1A)، وهي علامة للحصول على الخلايا الليفية. كلوة الابتدائية تعبير عن درجة عالية من أوائل البروتين التمايز cytokeratin-14 (الشكل 1B) ولكن ما يقرب من أي أواخر القرنية البروتين التمايز cytokeratin 10 (الشكل 1C).
وعقب ثقافة الأولية، فإننا فصل الخلايا من قوارير زراعة الخلايا واستخدمها لتوليد FTSE. وكان مؤشر فاينانشال تايمز تربيتها لمدة 7 أيام تحت الظروف submers المتوسطة (الشكل 2A)، يليه ثقافة 14 يوما في واجهة الهواء السائل (الشكل 2B). وخلال هذه العملية، وعقد تسي بشكل كبير. في غضون 21 يوما من كلوة تنتشر (الشكل 2C-E). عن طريق تغيير مستوى متوسط في مثل هذه الطريقة التي السطح من النماذج يتعرض للهواء وزيادة تركيز الكالسيوم، يتم تحفيز كلوة على التمايز إلى البشرة متعددة الخلايا التي تتألف من عدة طبقات الخلايا الحيوية من الخلايا الكيراتينية في الدول التمايز مختلفة والطبقة القرنية (الشكل 2E).
مقارنة Haematoxylin ويوزين تلطيخ مؤشر فاينانشال تايمز (الشكل 2E) مع الجلد البشري الأصلي (الشكل 2F) يصبح من الواضح أن يقلد FTSE العمارة النسيجية من الجلد. هذا يمكن زيادة يتبين من stainings المناعى (الشكل 3). وHDF في I هيدروجيل الكولاجين يمكن ملطخة الأجسام المضادة الأولية ضد فيمنتين (الشكل 3A، E). الكيراتينية تشكل طبقة البشرة تتألف من cytokeratin-14 ايجابياتوأعرب عن خلايا ه (الشكل 3B، F) والتفريق أواخر cytokeratin 10 علامة في طبقات فوق القاعدية (الشكل 3C، G). وعلاوة على ذلك، فإن الطبقة القرنية هو إيجابي لfilaggrin (الشكل 3D، H).
وبعد فترة ثقافة 21 يوم، تم استخدام AWD لتوليد الجروح الجلدية في مؤشر فاينانشال تايمز. كما هو مبين في الشكل 4A، يتم إنشاء AWD على شكل مربع النظام المغلق لضمان ظروف معقمة. في الشكل 4B، ويتجلى رسم تخطيطي لعملية جرح. يتم إصلاحها مؤشر فاينانشال تايمز على لوحة الناقل العينة. والكمبيوتر التي تسيطر عليها بمساعدة العملية برمتها جرح، بما في ذلك وضع المعلمات مثل خفض السرعة والثورات من رأس الحفر (الشكل 4D)، وكذلك عمق الاختراق. يمكن رصد الإجراء اصابة بصريا عبر النافذة الأمامية أو بواسطة كاميرا عالية الدقة التي تسجل جميع الخطوات خلال جرح الإجراء. حجم وشكل وعمق الإصابة الجرح يمكن تعديلها بشكل فردي (الشكل 4C).
الشكل 1. توصيف الخلايا المستخدمة لبناء كامل في حكمه سماكة الجلد. تلطيخ المناعى من الخلايا الليفية الجلدية الإنسان الأساسية لفيمنتين (A) والخلايا الكيراتينية البشرة لالتمايز في وقت مبكر الكيراتين خيوط cytokeratin-14 (B) والراحل التمايز خيوط cytokeratin -10 (C). ويظهر تلطيخ إيجابي من قبل اللون البني. الحانات النطاق تشير إلى 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
6 / 52576fig2.jpg "/>
الشكل 2. تغيرات الظروف ثقافة ونضوج كامل سماكة الجلد في حكمه. الصور ترى بالعين المجردة والكامل الجلد سمك مكافئات مثقف لمدة 7 أيام في ظل ظروف submers (A) و 14 يوما في واجهة الهواء السائل (B). مقارنة Haematoxylin ويوزين تلطيخ من مكافئات الجلد سمك الكامل في مراحل النمو المختلفة: بعد 7 أيام (C)، 14 يوما (7 أيام في واجهة الهواء السائل، D) و 21 يوما (14 يوما في واجهة الهواء السائل، E). Haematoxylin ويوزين تلطيخ من الجلد البشري الأصلي (F). الحانات النطاق تشير إلى 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
خريج "/>
الشكل 3. توصيف كامل المعادل سماكة الجلد مقارنة تلطيخ المناعى من حكمه الجلد سمك الكامل. (A - D) والجلد البشري الأصلي (E - H) للفيمنتين (A، E)، cytokeratin-14 (B، F)، cytokeratin-10 (C، G) وfilaggrin (D، H). الحانات النطاق تشير إلى 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. التلقائي إصابة جهاز لجرح تسيطر على كامل سماكة الجلد في حكمه. الجهاز جرح الآلي (AWD) يوفر شرطا معقمنانوثانية أثناء إجراء جرح رقابة (A). كمبيوتر المرفقة (CPU) يسيطر على AWD. يتم وضع مكافئات سماكة الجلد الكاملة (ftSEs) على لوحة الناقل العينة (SCP)، وتعادل انحرافات في عينة التشكل بحاجز الضوء (LB)، والذي يتسبب في جرح الإجراء. شكل الجرح يعتمد على رأسه الحفر المستخدمة (DH). ويتراوح قطرها من 1 ملم (C، الصورة العليا) إلى 2 ملم (C، الصورة السفلى). ويتم رصد الإجراء جرح ويمكن تسجيل للتوثيق وإدارة الجودة (D). الهيماتوكسيلين ويوزين الملون المقطع العرضي من كامل يعادل سمك الجلد أصيب الجهاز جرح الآلي باستخدام 1 ملم رأس الحفر (E). جميع الحانات النطاق تشير 2 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الخلايا في المختبر عادة ما يتم توسيع في مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد، في الخلايا التي تلتزم الأسطح البلاستيكية. ومع ذلك، هذه الشروط الثقافة لا تعكس الظروف ثلاثية الأبعاد الفسيولوجية التي تنمو الخلايا في الجسم الحي. في ظل ظروف ثلاثية الأبعاد، يمكن للخلايا تشكل خلية خلية وخلية مصفوفة إرفاق ملفات الطبيعية والهجرة في ثلاثة أبعاد. خصوصا في الجرح الجلدي شفاء تشابه الوضع في الجسم الحي هو محوري لتوليد بيانات ذات مغزى، وهجرة الخلايا وتوليد مصفوفة عناصر رئيسية في التئام الجروح.
من أجل تقليد هذه الشروط وضعنا مؤشر فاينانشال تايمز التي تتكون من الخلايا الأولية الإنسان وتعكس كلا من الجلد وطبقة البشرة من الجلد. خلال أسبوعين للثقافة في واجهة الهواء السائل، وكلوة تشكيل البشرة تتكون من عدة طبقات من الخلايا القرنية في مراحل مختلفة التمايز والطبقة القرنية. Furthermore، وتتكون طبقة الجلد من HDF، والتي هي جزء لا يتجزأ في الكولاجين I هيدروجيل. خلال فترة والثقافة، واتش دي اف يعيد المكون الجلد، مما يؤدي الى انكماش كبير من نماذج (الشكل 2B).
لإعداد الجروح استنساخه وموحدة، وضعنا على AWD. آلة الكمبيوتر التي تسيطر عليها يمكن أن يحدد الإصابات الجلدية محددة ودقيقة (الشكل 4). اعتمادا على المقصود البحوث، والعمق، وشكل وحجم الإصابة يمكن تكييفها. ولكن نظرا للمواصفات الفنية للAWD ومورفولوجية مؤشر فاينانشال تايمز، فمن المستحسن لتحديد الحد الأدنى من الاختراق من 100 ميكرون التكاثر. وAWD تعمل تحت ظروف معقمة في مربع النظام المغلق وجميع مكونات يمكن تعقيمها بواسطة التعقيم والحلول التطهير أو الأشعة فوق البنفسجية. استعدادا لإجراء جرح في حاجة إلى عينات ليتم تحويلها إلى لوحة الناقل العينة. هذه لوحة تسهل علىالموضع الدقيق للعينات. وعلاوة على ذلك الالتصاق بين العينة والناقل لوحة عينة كافية للحفاظ على العينات في مكان أثناء إجراء جرح. الإجراء جرح نفسه يمكن رصد بصريا عبر النافذة الأمامية أو بواسطة كاميرا عالية الدقة التي تسجل جميع الخطوات من موقف عن قرب. على عكس الأنظمة الأخرى التي تستخدم أشعة الليزر لحفر الأنسجة لتوليد الجرح، وAWD توظف حفر دوارة. وبالتالي، لا يتم تطبيق أي الحرارة خلال هذا الإجراء، الذي هو من المتطلبات الأساسية الحيوية للتحقيق الجروح الميكانيكية. بالإضافة إلى ذلك، شكل معين من الرأس الحفر يضمن إزالة المواد من قناة الجرح. باستخدام معلمات جرح تحدد تجريبيا المذكورة أعلاه الإجراء اصابة يمكن تعديلها لتلبية الخصائص الفسيولوجية محددة إما FTSE أو عينات من الجلد الأصلي. بهذه الطريقة أي آثار جانبية غير مرغوب فيها مثل مفرزة غير المتعمدة من طبقات البشرة يمكن التقليل من وإجراء جرح استنساخه مع نسبة نجاحمن 90٪.
توضح هذه الدراسة أن مؤشر فاينانشال تايمز المتقدمة تحاكي جزئيا الوضع في الجسم الحي من الجلد بدقة، وبالتالي يمكن أن تستخدم كنموذج لالتئام الجروح الدراسات. على الرغم من جوانب هامة من عملية التئام الجروح مثل تأثير الأوعية الدموية، تجلط الدم والجهاز المناعي تعاني من نقص في هذا النموذج، وتلخيصها على البشرة-الوسيطة وخلية مصفوفة التفاعل في بيئة موحدة عالية ثلاثية الأبعاد. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا يمكن أن تظهر أن AWD يولد الجروح موحدة في نماذج الجلد. في الجمع، على حد سواء تقنيات يمكن استخدامها لتحقيق التئام الجروح وتأثير المواد والعقاقير التي تدعم عملية الشفاء. من أجل تحاكي الوضع في الجسم الحي بشكل وثيق، مؤشر فوتسي يمكن تمديدها من قبل خلايا أخرى مثل الخلايا الصباغية، والخلايا السرطانية الجلد أو الخلايا البطانية-الأوعية الدموية الصغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
References
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. The wound healing process. Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).
- Cory, G. Scratch-wound assay. Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).
- Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).
- Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).
- Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).
- Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).
- El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).
- Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).
- Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).
- Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).
- Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).
- Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).
- Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).
- Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).
- El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).
- Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).
- Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).
- Bell, E., et al. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
