Introduction
Huden är det största organ i kroppen. Den skapar en barriär mellan den yttre miljön och de inre organen. Dessutom skyddar huden kroppen från vätskeförlust, miljöpåverkan, skador och infektioner och hjälper till att reglera kroppstemperaturen 1. På grund av dess utsatta läge, huden påverkas ofta av mekanisk, termisk eller kemisk trauma. Även huden vanligen kan självreparation, kan flera lokala faktorer såsom infektion, syresättning och venös tillräcklighet leda till försämrad sårläkning. Sårläkning kan också störas av systemiska faktorer som fetma, alkoholism, rökning, medicinering, kost och sjukdomar som diabetes. 2
Processen för sårläkning kan delas in i tre faser: (i) den inflammatoriska fasen, (ii) den proliferativa och (iii) remodellering fas. Vid skada på huden, startar en komplex signal-kaskad, vilket leder till nedläggning av såret. 3Efter skada såret blödning och en blodpropp bildas. Fibroblaster flyttar in i blodpropp och ersätta det med ny vävnad som därefter ombyggd under åren.
Den nuvarande förståelse av biologiska processer underliggande kutan reparation är begränsad. Små djur och gris modeller har använts för att studera sårläkning. Dessa resultat kan inte direkt överföras till människor på grund av artspecifika skillnader. Förutom dessa in vivo-modeller, kan vissa aspekter av sårläkning studeras genom att simulera en lindad situation genom repning av monoskikt in vitro kulturer baserat på odödliggjorda cellinjer eller primära celler. 4 Dessa skrapar modeller är mycket standardiserad men återspeglar inte tillräckligt den komplex in vivo fysiologi. 5 Förutom tvådimensionella modeller, har tredimensionella humana hudekvivalenter utvecklats för dermatologisk forskning. Den dermala delen av dessa modeller är GEnerated med olika ställningar inklusive decellulariserade dermis, 6 kollagen hydrogel, 7,8 glykosaminoglykaner 9 eller syntetiska material. 10 Anställa dessa hudekvivalenter, roll epiteliala-mesenkymala interaktioner 11, återpitelise, cell överhörning mellan fibroblaster och keratinocyter och kan studeras inverkan av olika tillväxtfaktorer. Dessutom är dessa modeller är användbara för att vinna ny kunskap om hur fibroblaster vandrar in de sårade området och hur kemotaktisk faktorer påverkar vävnadsregenerering. 12
Inte bara generationen av sårläkning modellen i sig är en utmaning, men också för att skapa en mycket standardiserad sår i en modell är problematiskt. Vanliga tekniker för att skapa sår är skraptest, 13 brännskador, 14 band nötning, 15 termisk skada, 16 sug blåsor, 17 flytande kväve, 18 lasrar, 19 18 meshers 6 och biopsi stansar. 20 De flesta av dessa metoder har samma fallgropar. Skador förs manuellt är svåra att standardisera och att reproducera mellan flera tester. Storlek, form och djup såret varierar mellan studier och därmed försämra kvaliteten på forskningsdata. Användningen av laser för definierad hud sårskada kan relativt enkelt standardiseras men leder till en situation härma brännsår. Värme tillämpas av laser kan orsaka proteindenaturering, trombocyter aggregering eller kärl sammandragning, vilket kan leda till nekrotisk vävnad.
I ett alternativt synsätt, utvecklade vi en automatiserad såra anordning (AWD), vilket ger oss möjlighet att skapa definierade och precisa kutana sår under sterila förhållanden. Såra parametrar, såsom djup och hastighet penetration samt varv av borrhuvudet kan regleras. I denna studie, vi kombinerat AWD med i egenutvecklade full tjocklek hudekvivalenter (ftSE) som är jämförbar med ett protokoll som publicerats av Gangatirkar et al. 8 Den dermala lagret av huden motsvarande består av humana dermala fibroblaster (HDF), vilka är inbäddade i en kollagen I hydrogel. På huden lagret, humana epidermala keratinocyter (HEK) är seedade. Inom två veckor på luft-vätskegränssnittet Hek bygga upp en epidermis består av flera vitala cellager och en hornlagret. Förutom generationen av denna modell, visar denna studie att använda AWD att skapa definierade och exakta sår i FTSE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Protokollet är utformat för produktion av 24 fulla tjocklek hudekvivalenter. Mänsklig dermala fibroblaster och epidermala keratinocyter isolerades från hudbiopsier enligt ett tidigare publicerat protokoll. 21,22 Informerat samtycke erhölls förväg och studien godkändes av institutionella etiska kommittén på människors forskning av Julius-Maximilians-University Würzburg (rösta 182 / 10).
1. Produktion av Dermal Component
- Lös kollagen med 0,1% ättiksyra till en slutlig koncentration av 6 mg / ml. För gelén neutralisering lösning, som blandas 232,5 ml 2x DMEM, 7,5 ml fetalt kalvserum, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml kondroitinsulfat (5 mg / ml). Håll gel neutralisering lösning och kollagenlösning på is. Beräkna 500 pl gel per insats / hudekvivalent.
OBS: Eftersom gelen neutralisering lösningen kommer att blandas med två delar kollagenlösning prepare dubbel mängd kollagen. - Placera 24 skär in i en 24 brunnar.
- Resuspendera humana dermala fibroblaster (HDF) i 10 ml DMEM, centrifugera i 5 minuter vid 270 xg och räkna cellerna. Extrahera den nödvändiga mängden av HDF (5 x 10 4 celler per 500 | il kollagengel) och centrifugera cellerna under 5 min vid 270 x g.
- Avlägsna supernatanten och försiktigt återsuspendera HDF i 4 ml kyld gel neutralisering lösning utan att producera luftbubblor. Från detta steg se till att arbeta så snabbt som möjligt för att undvika för tidig stel av kollagengeler.
- Resuspendera lösningen med 8 ml kollagenlösning.
- Ta kollagen-cell-blandning med en flerstegs-pipett och fyll snabbt 500 pl blandning i varje insats. Inkubera geler för 20 min i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) för att jell gelerna.
- Sänk gelerna i 2 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) + 10% fetalt kalvserum (FCS) per brunnoch inkubera det i 24 h i en inkubator (37 ° C, 5% CO2).
2. Tillsats av Human Epidermal keratinocyter (HEK)
- Ta bort mediet efter 24 timmar. Lös fibronektin humant protein med ultrarent vatten till en slutlig koncentration av 50 ug / ml. Täck varje dermal ekvivalent med 25 pl fibronektin lösning. Inkubera geler för 30 min i en inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Under tiden, resuspendera Hek i 10 ml KGM-2 och ställa cellkoncentrationen till 1 x 10 6 celler / ml med KGM-2 redo + 5% FCS. Seed 1 x 10 5 Hek på varje gel. Inkubera geler under 45 min i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2) för att tillåta cellerna att vidhäfta.
- Sänk ned geler med KGM-2 redo + 5% FCS och kultur dem i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2).
3. Kultur av full tjocklek hudekvivalenter (FTSE)
- Kultur FTSE för 6-7 dagari fallande FCS-koncentration (5%, 2%, och 0% FCS). Ändra mediet var 2-3 dagar med nästa lägre FCS koncentration. För detta, helt ta bort mediet och tillsätt 1,6 ml färskt medium.
- På dag 7, ta bort medel helt.
OBS: Rör inte FTSE ytan med spetsen på pipetten medan du gör det. - Placera varje infoga i 1 brunn på en 6 brunnar med steril pincett. Lägg 1,5 ml luftbro medium per brunn, se till att inte väta FTSE ytan. Ändra medel var 2-3 dagar för ytterligare 14 dagar.
OBS: fyllningsnivån för mediet är upp till menisken i FTSE.
4. Histologisk analys
- Fastställande och paraffin-inbäddning av FTSE
- Avlägsna odlingsmedium, överför skär i färska 24-brunnsplattor och fixa vävnader genom tillsats 1,6 ml 4% paraformaldehyd till varje brunn och inkubera vävnaderna under 2 h vid RT. Varning! Paraformaldehyd är giftigt, manipulera i dragskåp. ÖverföringFTSE till en vävnads inbäddning kassett. Avlägsna återstående fixativ genom att tvätta med vatten och torka vävnaden med hjälp stigande etanolkoncentrationer.
- Dela upp huden likvärdig av ett vertikalt snitt i mitten. Placera de två delarna i en paraffinfylld metallbasen mögel med snittytor nedåt. Lägg vävnadskassett ovanpå gjutformen som underlag.
- Skär 3-5 um skivor och flyta dem på en 40 ° C vattenbad under straitening, montera diabilder på lämpliga objektglas. Torra skivor noggrant.
- Hematoxylin & Eosin (H & E) och immunhistokemisk (IHC) färgning
- Placera glider in rack och inkubera i 1 timme vid 60 ° C. Kontrollera att paraffin smältes. Stain uppblött skivor med H & E som en standardiserad överblick färgning.
- För H & E färgning förbereda 4x glasfärgnings kyvetter med xylen, 3x med etanol 96%, 2x med etanol 70%, 1x med etanol 50%, 4x avjoniserat vatten, 1x hematoxylin, 1x HCI-ethanol (13,7 ml 1 M HCl ad 200 ml 50% etanol), 1x fliken vatten, 1x eosin (1 g eosin i 100 ml avjoniserat vatten) och 2x 2-propanol.
- Placera glider 10 min i xylol I och 10 min i xylol II Avparaffinera och rehydrera diabilder. Doppa glider 3x i etanol 96% Jag, 3x i etanol 96% II, 3x i etanol 70% och 3x i etanol 50%. Rotera bilder i avjoniserat vatten. För att skilja hematoxylin färgämne, dopp 2x i HCl-etanol. Skölj i avjoniserat vatten. För blånering, plats glider 5 min i fliken vatten. För eosin färgning, plats glider 1 min i eosin och tvätta efteråt i avjoniserat vatten. För uttorkning, dip diabilder 2x i etanol 70%, 2x i etanol 96% och placera dem i 5 min i 2-propanol I, i 5 min i 2-propanol II, 5 min i xylol I och 5 min i xylol II. Efter H & E färgning, är cellkärnor färgas i blått, cytoplasma och extracellulär matrix färgas i rött.
- För antigenåtervinning, ta bort paraffin med xylen och rehydrate skivor för färgning. Placera skivori ångkokaren och laga avparaffinerade och rehydrerade skivor i 20 min i förvärmda 10 mM citratbuffert (pH 6).
- Placera objektglasen i tvättbuffert (PBS-buffert + 0,5% Polysorbat 20) och cirkel segment med en flytande avvisande glidtuschpenna eller diamant pennan.
- Placera glasen i en fuktkammare. Blockera endogent peroxidas, genom att tillsätta 100 | il 3% väteperoxid lösning på varje skiva. Varning! Mycket farligt i fall av hud- och ögonkontakt. Handtag med personlig skyddsutrustning. Tvätta objektglasen i tvättbuffert.
- Applicera primär antikropp och inkubera i 1 timme vid RT. Tvätta objektglasen tre gånger med tvättbuffert. Från och med nu ska proverna förvaras i mörker.
- Använd biotin-streptavidin-detektionssystem för detektion av specifik antigen-antikroppsbindning.
- Motfärg kärnor med hematoxylin under 1 min. Torka och montera diabilder.
- Bild prover med ett omvänt mikroskop.
- Förbered AWD genom desinficering av arbetsområdet med 70% etanol och ultraviolett ljus. Se till borrhuvudet med önskad storlek (t.ex., 1 mm) är fäst.
- Placera hudekvivalenter i angivna områden av autoklaveprovhållaren plattan med steril pincett. Placera provet bärplattan i sockeln nedanför borrhuvudet.
- Använd kontroll programvara för att ställa såra parametrar enligt följande: spin hastighet: 15.000 rpm; penetration: 1,5 mm; framdrivning: 100 Hz. Dessa parametrar behöver definieras för varje provtyp individuellt. Överföring såra parametrar till AWD.
- Börja såra procedur. Ta prov bärplatta ur uttaget. Överföring sårade FTSE tillbaka in insatser som används för odling med sterila pincett.
- Fortsätt med kultur av sårade FTSE i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2) för undersökning av regenerering. Alnativt, använd modeller för histologisk analys helst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det isolerade HDF och Hek skiljer både i morfologi och i uttryck av typiska markörer. HDF visade typiska spindelform morfologi, medan morfologi Hek kan beskrivas med en gatsten morfologi. Cellerna karaktäriserades av immunhistokemisk färgning (Figur 1) innan du använder dem för FTSE. HDF är positiva för vimentin (Figur 1A), en markör för fibroblaster. Primär Hek uttrycker mycket tidig differentiering protein cytokeratin-14 (Figur 1B) men nästan ingen sen keratinocytdifferentieringen protein cytokeratin-10 (Figur 1C).
Efter primär kultur, fristående vi cellerna från cellodlingsflaskor och använde dem för alstring av FTSE. FTSE odlades under 7 dagar under submers mediumförhållanden (figur 2A), följt av en 14 dagar kultur vid luft-vätskegränssnittet (Figur 2B). Under denna process, den fTse kontrakt betydligt. Inom 21 dagar Hek breder (figur 2C-E). Genom att ändra medelnivå på ett sådant sätt att den yta av modellerna utsätts för luft och genom att öka kalciumkoncentration, är de Hek stimuleras att differentiera till en multi-cellulära epidermis som består av flera vitala cellskikt keratinocyter i olika differentieringstillstånd och ett stratum comeum (Figur 2E).
Jämföra Hematoxylin & Eosin-färgning av FTSE (Figur 2E) med nativt humant hud (Figur 2F) blir det uppenbart att FTSE härmar histologisk arkitektur av huden. Detta kan ytterligare demonstreras genom immunhistokemiska färgningar (Figur 3). HDF i kollagen I hydrogel kan färgas med primära antikroppar mot vimentin (Figur 3A, E). Keratinocyter bildar en epidermal skikt bestående av cytokeratin-14 positive-celler (figur 3B, F) och den sena differentieringsmarkör cytokeratin-10 uttrycks i de supra-basala skikten (figur 3C, G). Dessutom är stratum comeum positivt för filaggrin (figur 3D, H).
Efter 21 dagars odling period var AWD används för att generera kutana sår i FTSE. Såsom visas i figur 4A, är AWD konstruerad som en sluten låda-system för att säkerställa sterila förhållanden. I figur 4B är en schematisk ritning av sårande processen demonstreras. FTSE är fixerade på ett prov bärplatta. Hela såra processen, bland annat fastställa parametrar såsom sänkhastighet och revolutioner borrhuvudet (Figur 4D) samt penetrationsdjupet styrs datorstödd. Den såra förfarande kan övervakas optiskt via en framruta eller av en kamera med hög upplösning som registrerar alla steg under sårskada förfarande. Storlek, form och djup såret skadan kan justeras individuellt (Figur 4C).
Figur 1. Karakterisering av celler som används för konstruktion av fulla tjocklek hudekvivalenter. Immunohistokemisk färgning av primära humana dermala fibroblaster för vimentin (A) och epidermala keratinocyter för tidig differentiering keratin fila cytokeratin-14 (B) och den sena differentieringsglöd cytokeratin -10 (C). Positiv färgning visas av brun färg. Skala staplar indikerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6 / 52576fig2.jpg "/>
Figur 2. Förändringar av odlingsbetingelser och mognad av full tjocklek hudekvivalenter. Makroskopiska bilder av full tjocklek hudekvivalenter odlade under 7 dagar under submers förhållanden (A) och 14 dagar vid luft-vätska gränssnitt (B). Jämförelse av Haematoxylin & Eosin färgning av fulla tjocklek hudekvivalenter i olika utvecklingsstadier: Efter 7 dagar (C), 14 dagar (7 dagar vid luft-vätskegränssnittet, D) och 21 dagar (14 dagar vid luft-vätska gränssnitt, E). Hematoxylin & Eosin-färgning av nativ human hud (F). Skala staplar indikerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
pg "/>
Figur 3. Karakterisering av fulla tjocklek hudekvivalenter Jämförelse av immunhistokemisk färgning av full tjocklek hudekvivalenter. (A - D) och infödda mänsklig hud (E - H) för vimentin (A, E), cytokeratin-14 (B, F), cytokeratin-10 (C, G) och filaggrin (D, H). Skala staplar indikerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Automatisk såra Device för kontrollerad såra på full tjocklek hudekvivalenter. Den automatiserade såra anordning (AWD) ger steril conditions under kontrollerade såra förfarandet (A). En ansluten dator (CPU) styr AWD. De fullständiga tjocklek hudekvivalenter (ftSEs) placeras på provhållaren plattan (SCP), är avvikelser i prov morfologi utjämnas genom en ljusbarriär (LB), vilket utlöser sårande förfarandet. Såret form beror på den använda borrhuvudet (DH). Diametern varierar från 1 mm (C, övre bilden) till 2 mm (C, lägre bild). Den såra Förfarandet övervakas och kan spelas in för dokumentation och kvalitetsledning (D). Hematoxylin & Eosin färgade tvärsnitt av en full tjocklek hudekvivalent sårade med den automatiserade sårskada anordningen med användning av en 1 mm borrhuvud (E). Alla skal staplar indikerar 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro celler vanligen expanderas i tvådimensionella cellkulturer, i vilka celler vidhäftar till plastytor. Men dessa odlingsbetingelser inte speglar de fysiologiska tre-dimensionella förhållanden i vilka celler växer in vivo. Under tredimensionella förhållanden, kan cellerna bildar naturliga cell-cell och cell-matrix bilagor och migrera i tre dimensioner. Särskilt i kutan sårläkning likheten av situationen in vivo är avgörande för att skapa meningsfulla uppgifter, som cellmigration och matrisgenerering är viktiga inslag i sårläkning.
För att efterlikna dessa förhållanden som vi utvecklat FTSE som består av humana primära celler och reflektera både huden och epidermal lagret av huden. Under två veckors odling vid luft-vätskegränssnittet, hek bilda en epidermis bestående av flera lager av keratinocyter i olika differentierings faser och ett stratum comeum. Furthermore, är det dermala skiktet består av HDF, som är inbäddade i en kollagen I hydrogel. Under odlingstiden, HDF remodel den dermala komponenten, vilket resulterar i en signifikant krympning av modellerna (figur 2B).
För att förbereda reproducerbara och standardiserade sår, utvecklade vi ett AWD. Den datorstyrda maskinen kan ställa definierade och precisa kutana skador (Figur 4). Beroende på den avsedda forskningen, djup, form och storlek av skadan kan anpassas. Men på grund av de tekniska specifikationerna för AWD och morfologi FTSE, rekommenderas att ställa en minimal penetration av 100 nm reproducerbarhet. AWD arbetar under sterila förhållanden i slutna-systemet och alla komponenter kan steriliseras genom autoklavering, desinfektion lösningar eller ultraviolett ljus. Inför den skadade förfarandet måste överföras till en prov bärplatta proverna. Denna platta underlättar enexakt placering av proverna. Vidare vidhäftningen mellan provet och provhållaren plattan är tillräcklig för att hålla proverna på plats under sårande förfarandet. Proceduren såra sig kan övervakas optiskt via en framruta eller av en kamera med hög upplösning som registrerar alla steg från en närbild positionen. Till skillnad från andra system som använder laser för att gräva vävnad för att generera ett sår, AWD utnyttjar en roterande borr. Således är ingen värme appliceras under förfarandet, vilket är en viktig perquisite att undersöka mekaniska sår. Dessutom specifik form av borrhuvudet säkerställer borttagande av material från såret kanalen. Använda empiriskt bestämda sårskada parametrar som nämns ovan den såra procedur kan justeras för att möta specifika fysiologiska egenskaperna hos antingen FTSE eller nativa hudprover. Detta sätt oönskade biverkningar som oavsiktligt lossnar epidermala skikt kan minimeras och reproducerbar sårskada utförs med en framgångav 90%.
Denna studie visar att de utvecklade FTSE delvis efterlikna situationen för huden noggrant in vivo och därmed kan användas som en modell för sårläkning studier. Även viktiga aspekter av sårläkningsprocessen såsom effekten av kärl, blodpropp och immunsystemet saknas i modellen är epidermal-mesenkymala och cellmatris interaktion rekapituleras i en tredimensionell mycket standardiserad miljö. Dessutom kunde vi visa att AWD genererar standardiserade sår i huden modeller. I kombination kan båda teknikerna användas för att undersöka sårläkning och effekten av substanser och läkemedel som stödjer läkningsprocessen. För att härma in vivo-situationen närmare, kan FTSE förlängas med andra celler, såsom melanocyter, hud tumörceller eller mikro vaskulära endotelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
References
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. The wound healing process. Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).
- Cory, G. Scratch-wound assay. Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).
- Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).
- Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).
- Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).
- Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).
- El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).
- Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).
- Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).
- Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).
- Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).
- Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).
- Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).
- Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).
- El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).
- Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).
- Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).
- Bell, E., et al. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
