Introduction
Huden er den største organ i kroppen. Det skaber en barriere mellem det eksterne miljø og de indre organer. Desuden huden beskytter kroppen mod væsketab, miljømæssige påvirkninger, skader og infektioner og hjælper med at regulere kropstemperaturen 1. På grund af sin udsatte beliggenhed, huden ofte påvirket af mekanisk, termisk eller kemisk traume. Selvom huden er generelt i stand til selv-reparation, kan flere lokale faktorer såsom infektion, iltning, og venøs tilstrækkelighed føre til forringet sårheling. Sårheling kan også blive forstyrret af systemiske faktorer som fedme, alkoholisme, rygning, medicin, ernæring og sygdomme som diabetes. 2
Processen af sårheling kan opdeles i 3 faser: (i) den inflammatoriske fase, (ii) den proliferative og (iii) remodeling fase. Ved skade på huden, starter en kompleks signal-kaskade, der fører til lukning af såret. 3Efter skade, er såret blødning og en blodprop dannes. Fibroblaster flytte ind i blodprop og erstatte det med nyt væv, som efterfølgende ombygget i år.
Den nuværende forståelse af biologiske processer underliggende kutan reparation er begrænset. Små dyr og svin modeller er blevet anvendt til at undersøge sårheling. Men disse resultater kan ikke direkte overføres til mennesker på grund af artsspecifikke forskelle. Ud over disse in vivo modeller kan nogle aspekter af sårheling studeres ved at simulere et sår situationen via skrabe af in vitro monolagskulturer baseret på udødeliggjorte cellelinjer eller primære celler. 4 Disse skrabe modeller er meget standardiseret men ikke i tilstrækkelig grad afspejler kompleks in vivo fysiologi. 5 Udover to-dimensionelle modeller er blevet udviklet tredimensionale humane hudækvivalenter til dermatologisk forskning. Den dermale del af disse modeller er genereres ved hjælp af forskellige platforme, herunder decellulariseret dermis, 6 collagen hydrogeler, 7,8 glycosaminoglycaner 9 eller syntetiske materialer. 10 Anvender disse hudækvivalenter, rolle epitel-mesenchymale interaktioner 11, re-epitelialisering, den cellulære krydstale mellem fibroblaster og keratinocytter og påvirkning af forskellige vækstfaktorer kan studeres. Desuden er disse modeller er nyttige til at få ny viden om, hvordan fibroblaster vandre over i den sårede område, og hvordan kemotaktisk faktorer påvirker væv regenerering. 12
Ikke kun generation af sårheling selve modellen er udfordrende, men også at etablere en meget standardiseret sår i en model er problematisk. Almindelige teknikker til at skabe sår er scratch test, 13 brandsår, 14 tape slid, 15 termisk skade, 16 suge vabler, 17 flydende nitrogen, 18 lasere, 19 18 meshers 6 og biopsi slag. 20 De fleste af disse metoder har samme faldgruber. Skader, der gennemføres manuelt er vanskelige at standardisere og at reproducere mellem flere tests. Størrelse, form og dybde af såret variere mellem undersøgelser og dermed forringe kvaliteten af forskning data. Brugen af laser til definerede hud såret kan relativt let standardiseret men fører til en situation efterligne brandsår. Heat anvendes af laser kan forårsage proteindenaturering, blodplader aggregering eller fartøjer konstriktion, som kan føre til nekrotisk væv.
I en alternativ fremgangsmåde, vi har udviklet et automatiseret såret enhed (AWD), som giver os mulighed for at generere definerede og præcise kutane sår under sterile forhold. Sårede parametre, ligesom dybden og hastigheden af penetration samt omdrejninger af borehovedet kan reguleres. I denne undersøgelse har vi kombineret den AWD med i hus udviklede fuld tykkelse hudækvivalenter (ftSE), som er sammenlignelig med en protokol offentliggjort af Gangatirkar et al. 8 dermale lag af huden ækvivalent er sammensat af humane dermale fibroblaster (HDF), der er indlejret i en collagen I hydrogel. På den dermale lag, humane epidermiskeratinocytter (HEK) er seedet. Inden for to uger ved luft-væske-grænsefladen HEK opbygge en epidermis består af flere vitale cellelag og stratum corneum. Udover generation af denne model, denne undersøgelse viser brugen af AWD at skabe afgrænsede og præcise sår i FTSE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Protokollen er designet til produktion af 24 fuld tykkelse hud ækvivalenter. Menneskelig dermale fibroblaster og epidermiskeratinocytter blev isoleret fra hudbiopsier ifølge en tidligere offentliggjort protokol. 21,22 Informeret samtykke blev opnået på forhånd, og undersøgelsen blev godkendt af institutionelle etiske komité på menneskers forskning af Julius-Maximilians-Universitetet Würzburg (afstemning 182 / 10).
1. Produktion af Dermal Component
- Opløs collagen med 0,1% eddikesyre til en endelig koncentration på 6 mg / ml. For gel neutralisering opløsning blandes 232,5 ml 2x DMEM, 7,5 ml føtalt kalveserum, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml chondroitinsulfat (5 mg / ml). Hold gel neutralisering opløsning og kollagen opløsningen på is. Beregn 500 pi gel pr insert / hud tilsvarende.
BEMÆRK: Da gelen neutralisering løsning vil blive blandet med to dele af kollagen løsning prepare dobbelt mængde collagen. - Placer 24 skær i en 24-brønds plade.
- Resuspender humane dermale fibroblaster (HDF) i 10 ml DMEM, centrifugeres i 5 minutter ved 270 xg og tælle cellerne. Uddrag den nødvendige mængde af HDF (5 x 10 4 celler pr 500 pi kollagengel) og centrifuger cellerne i 5 minutter ved 270 x g.
- Fjern supernatanten og omhyggeligt resuspenderes HDF i 4 ml afkølet gel neutralisering opløsning uden at frembringe luftbobler. Fra dette trin sørg for at arbejde så hurtigt som muligt for at undgå for tidlig størkning af kollagengeler.
- Resuspender opløsning med 8 ml af kollagen opløsning.
- Tag collagen-celle-blanding med en flertrins-pipette og fyld hurtigt 500 pi blandingen i hver indsats. Inkuberes gelerne i 20 minutter i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) at stivne gelerne.
- Nedsænkes geler i 2 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% føtalt kalveserum (FCS) prog inkubere det i 24 timer i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
2. Tilsætning af humane epidermale keratinocytter (HEK)
- Fjern mediet efter 24 timer. Opløs fibronectin humant protein med ultrarent vand til en slutkoncentration på 50 ug / ml. Dæk hver ækvivalent med 25 pi fibronectin løsning dermal. Inkuberes gelerne i 30 minutter i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- I mellemtiden resuspender HEK i 10 ml KGM-2 og sæt cellekoncentration til 1 x 10 6 celler / ml med KGM-2 klar + 5% FCS. Seed 1 x 10 5 HEK på hver gel. Inkuber geler i 45 minutter i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2) for at tillade cellerne at adhærere.
- Submerse gelerne med KGM-2 klar + 5% FCS og kultur dem i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2).
3. Kultur af fuld tykkelse hudækvivalenter (FTSE)
- Kultur FTSE for 6-7 dagei faldende FCS-koncentration (5%, 2% og 0% FCS). Skift medium hver 2-3 dage med den næste lavere FCS koncentration. Til dette helt at fjerne mediet, og der tilsættes 1,6 ml frisk medium.
- På dag 7, fjerne medium helt.
BEMÆRK: Rør ikke ved FTSE overflade med spidsen af pipetten mens du gør det. - Placer hver indsætte i 1 brønd i en 6-brønds plade med en steril tang. Tilføj 1,5 ml luftbro medium per brønd, sikre ikke at FTSE overflade våd. Skift medium hver 2-3 dage for yderligere 14 dage.
BEMÆRK: påfyldningsniveau af mediet er op til menisken af FTSE.
4. Histologisk analyse
- Fastsættelse og paraffin-indlejring af FTSE
- Fjern kulturmediet, overføre skær i friske plader med 24 brønde og løse væv ved tilsætning af 1,6 ml 4% paraformaldehyd til hver brønd og inkuberes væv i 2 timer ved stuetemperatur. Forsigtig! Paraformaldehyd er giftigt, manipulere under emhætte. TransferFTSE til et væv-embedding kassette. Fjern resterende fiksativ ved vask med vand og dehydrere vævet med stigende ethanolkoncentrationer.
- Opdel huden ækvivalente af en lodret snit i midten. Læg de to stykker i en paraffin fyldt metal base mug med snitfladerne nedad. Tilføj vævet kassetten på toppen af formen som underlag.
- Skær 3-5 um skiver og flyde dem på en 40 ° C vandbad i straitening, montere dias på egnede objektglas. Tørre skiver grundigt.
- Hematoxylin & Eosin (H & E) og immunhistokemisk (IHC) farvning
- Place glider ind rack og inkuberes i 1 time ved 60 ° C. Sørg for, at paraffin er smeltet. Stain rehydreret skiver med H & E som en standardiseret overblik farvning.
- H & E farvning forberede 4x glas farvning kuvetter med xylol, 3x med ethanol 96%, 2x med 70% ethanol, 1x med ethanol 50%, 4x deioniseret vand, 1x hematoxylin, 1x HCI-ethanol (13,7 ml 1 M HCl ad 200 ml 50% ethanol), 1x fanen vand, 1x eosin (1 g eosin i 100 ml deioniseret vand) og 2x 2-propanol.
- Glassene anbringes 10 min i xylol I og 10 min i xylol II til afparaffiniser og rehydrere dias. Dip glider 3x i ethanol 96% I, 3x i ethanol 96% II, 3x i ethanol 70% og 3x i ethanol 50%. Roter objektglassene i deioniseret vand. For at differentiere hæmatoxylin farvestof, dip 2x i HCl-ethanol. Skyl i deioniseret vand. For blåning, sted glider 5 min i fanen vand. For eosinfarvning, sted glider 1 min i eosin og vaskes derefter i deioniseret vand. For dehydrering, dip slides 2x i ethanol 70%, 2x i ethanol 96% og placere dem i 5 minutter i 2-propanol I i 5 minutter i 2-propanol II, 5 min i xylol I og 5 min i xylol II. Efter H & E farvning, er cellekerner farves i blå, cytoplasma og ekstracellulære matrix farves rødt.
- For antigen hentning, fjerne paraffin med xylen og rehydrere skiver til farvning. Place skiveri damp komfur og kog afparaffinerede og rehydrerede skiver i 20 minutter i forvarmede 10 mM citrat (pH 6).
- Glassene anbringes i vaskebuffer (PBS-buffer + 0,5% polysorbat 20) og cirkel skiver med en væskeafvisende slide tusch eller diamant stylus.
- Glassene anbringes i et fugtighedskammer. Bloker endogen peroxidase, ved tilsætning af 100 pi 3% hydrogenperoxidopløsning på hver skive. Forsigtig! Meget farlig i tilfælde af hud og øjenkontakt. Håndtag med personlige værnemidler. Wash glider i vaskebuffer.
- Anvend primært antistof og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Wash slides tre gange med vaskebuffer. Herfra på, skal prøver opbevares i mørke.
- Brug biotin-streptavidin detekteringssystem til detektering af specifikke antigen-antistof-binding.
- Kontrastfarve kerner med hæmatoxylin i 1 min. Dehydrer og montere dias.
- Billede prøver under anvendelse af et omvendt mikroskop.
- Forbered AWD ved at desinficere arbejdsområdet med 70% ethanol og ultraviolet lys. Sørg for, at borehovedet af den ønskede størrelse (f.eks 1 mm) er fastgjort.
- Placer hudækvivalenter i udpegede områder af autoklaveret prøve bæreplade med sterile pincetter. Anbring prøven bærepladen i soklen under borehovedet.
- Brug kontrol software til at sætte sårede parametre som følger: spin-hastighed: 15.000 rpm; penetration: 1,5 mm; fremdrift: 100 Hz. Disse parametre skal defineres for hver prøvetype individuelt. Overførsel sårede parametre til AWD.
- Start sårede procedure. Fjern prøve bæreplade ud af stikkontakten. Overførsel sårede FTSE tilbage i skær, der anvendes til dyrkning med sterile pincetter.
- Fortsæt med kultur af sårede FTSE i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2) til undersøgelse af regenerering. Alternatively bruge modeller til histologisk analyse på ethvert tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det isolerede HDF og HEK adskiller både morfologi og i ekspression af typiske markører. HDF viste typiske spindel-form morfologi, mens morfologi HEK kan beskrives ved en brosten morfologi. Cellerne blev præget af immunhistokemisk farvning (figur 1), før du bruger dem til FTSE. HDF er positive for vimentin (figur 1A), en markør for fibroblaster. Primær HEK stærkt udtrykker tidlig differentiering protein cytokeratin-14 (figur 1B), men næsten ingen sent keratinocytdifferentiering protein cytokeratin-10 (figur 1C).
Efter primær kultur, vi løsrevet cellerne fra cellekultur kolber og brugte dem til generering af FTSE. FTSE blev dyrket i 7 dage under neddykkede medium betingelser (figur 2A) efterfulgt af 14 dages kultur ved luft-væske-grænsefladen (figur 2B). Under denne proces, ftse kontrakt betydeligt. Senest 21 dage HEK breder (figur 2C-E). Ved at ændre medium niveau på en sådan måde, at overfladen af modellerne er udsat for luft og ved at øge calciumkoncentration er hek- stimuleres til at differentiere til en multi-cellulære epidermis, som er sammensat af flere vitale cellelag i keratinocytter i forskellige differentiering tilstande og stratum corneum (Figur 2E).
Sammenligning af Hæmatoxylin & eosin farvning af FTSE (Figur 2E) med native menneskehud (figur 2F) bliver det tydeligt, at FTSE efterligner histologisk arkitektur af huden. Dette kan demonstreres yderligere ved immunohistokemiske farvninger (Figur 3). HDF i collagen I hydrogel kan farves med primære antistoffer mod vimentin (figur 3A, E). Keratinocytter danner en epidermal lag består af cytokeratin-14 positive-celler (figur 3b, F) og den sene differentieringsmarkør cytokeratin-10 er udtrykt i de overnationale basal lag (figur 3C, G). Endvidere stratum corneum er positive for filaggrin (figur 3D, H).
Efter 21 dage kultur periode blev AWD bruges til at generere kutane sår i FTSE. Som vist i figur 4A, er AWD konstrueret som en lukket kasse-system for at sikre sterile forhold. I figur 4B er en skematisk tegning af såret proces påvist. FTSE fastsættes på en prøve bæreplade. Hele såret, herunder fastsættelsen af parametre som sænke hastighed og omdrejninger af borehovedet (figur 4D) samt dybden af penetration styret computer assisteret. Den sårede procedure kan overvåges optisk via en front vindue eller ved en høj opløsning kamera, der registrerer alle trin i såret procedure. Størrelse, form og dybde af såret skade kan justeres individuelt (figur 4C).
Figur 1. Karakterisering af celler, der anvendes til opførelse af fuld tykkelse hudækvivalenter. Immunhistokemisk farvning af primære humane fibroblaster for vimentin (A) og af epidermiskeratinocytter til tidlig differentiering keratin glødetråd cytokeratin-14 (B) og den sene differentiering glødetråd cytokeratin -10 (C). Positiv farvning er vist ved brun farve. Scale søjler angiver 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
6 / 52576fig2.jpg "/>
Figur 2. Ændringer i dyrkningsbetingelser og modning af fuld tykkelse hudækvivalenter. Makroskopiske billeder af fuld tykkelse hudækvivalenter dyrket i 7 dage under neddykkede betingelser (A) og 14 dage ved luft-væske-grænsefladen (B). Sammenligning af Hæmatoxylin & eosin farvning af fuld tykkelse hudækvivalenter i forskellige udviklingsstadier: Efter 7 dage (C), 14 dage (7 dage ved luft-væske grænsefladen, D) og 21 dage (14 dage ved luft-væske grænsefladen, E). Hæmatoxylin & eosin-farvning af nativ human hud (F). Scale søjler angiver 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
pg "/>
Figur 3. Karakterisering af fuld tykkelse hudækvivalenter Sammenligning af immunhistokemisk farvning af fuld tykkelse hudækvivalenter. (A - D) og nativ human hud (E - H) for vimentin (A, E), cytokeratin-14 (B, F), cytokeratin-10 (C, G) og filaggrin (D, H). Scale søjler angiver 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Automatisk Anskydning Anordning til styret såret på fuld tykkelse hudækvivalenter. Den automatiserede såret enhed (AWD) giver steril conditions under kontrollerede såring procedure (A). En vedhæftet computer (CPU) styrer AWD. Den fulde tykkelse hudækvivalenter (ftSEs) er anbragt på prøven bærepladen (SCP) er afvigelser i prøven morfologi udlignet af en lysbarriere (LB), som udløser såring procedure. Såret form afhænger af den anvendte borehovedet (DH). Diameteren i området fra 1 mm (C, øverste billede) til 2 mm (C, nederste billede). Den sårede Proceduren overvåges og kan registreres for dokumentation og kvalitetsstyring (D). Hematoxylin & Eosin farves tværsnit af en fuld tykkelse hudækvivalent såret med den automatiserede sårdannelse enheden ved hjælp af en 1 mm borehoved (E). Alle skala søjler angiver 2 mm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro-celler er normalt udvidet i todimensionale cellekulturer, hvor cellerne klæber til plastoverflader. Men disse dyrkningsbetingelser ikke afspejler de fysiologiske tredimensionale betingelser hvor celler vokser in vivo. Under tredimensionale forhold kan celler danner naturlige celle-celle og celle-matrix vedhæftede filer og migrere i tre dimensioner. Især i den kutane sårheling ligheden af in vivo situationen afgørende at generere meningsfulde data, som celle migration og matrix generation er centrale elementer i sårheling.
For at efterligne disse betingelser vi udviklet FTSE der er sammensat af humane primære celler og afspejler både den dermale og epidermale lag af huden. I løbet af to ugers dyrkning ved luft-væske-grænsefladen, HEK danne en epidermis består af flere lag af keratinocytter i forskellige differentiering faser og et stratum corneum. Furthermore, er det dermale lag består af HDF, som er indlejret i en collagen I hydrogel. Under dyrkningen tid, HDF omforme den dermale komponent, hvilket resulterer i en betydelig krympning af modellerne (figur 2B).
For at forberede reproducerbare og standardiserede sår, vi udviklet en AWD. Computeren styrede kan indstille definerede og præcise kutane skader (figur 4). Afhængigt af den påtænkte forskning, dybde, form og størrelse af skaden kan tilpasses. På grund af de tekniske specifikationer for AWD og morfologi FTSE, anbefales det, at indstille en minimal indtrængning af 100 um reproducerbarhed. AWD opererer under sterile betingelser i en lukket kasse-system, og alle komponenterne kan steriliseres ved autoklavering, desinfektionsmidler eller ultraviolet lys. Som forberedelse til såret procedure skal overføres til en prøve bæreplade prøverne. Denne plade letter ennøjagtige position af prøverne. Endvidere vedhæftningen mellem prøven og prøven bærepladen er tilstrækkelig til at holde prøverne på plads under såring procedure. Den sårede selve proceduren kan overvåges optisk via en front vindue eller ved en høj opløsning kamera, der registrerer alle trin fra et nærbillede position. I modsætning til andre systemer, der anvender lasere til at udgrave væv til at generere et sår, AWD anvender et roterende bor. Således er ingen varme anvendes under proceduren, som er en afgørende perquisite at undersøge mekaniske sår. Derudover specifikke form af borehovedet sikrer en fjernelse af materiale fra såret kanal. Brug empirisk bestemt sårede parametre nævnt ovenfor sårede procedure kan justeres til at opfylde specifikke fysiologiske egenskaber enten FTSE eller indfødte hudprøver. På denne måde uønskede bivirkninger som utilsigtet frigørelse af epidermale lag kan minimeres og reproducerbar sårdannelse udført med en succesrate90%.
Denne undersøgelse viser, at de udviklede FTSE dels efterligne in vivo situation hud nøjagtigt og dermed kan anvendes som en model til sårheling studier. Selvom vigtige aspekter af sårhelingsprocessen såsom virkningen af vaskulaturen, blodproppen og immunsystemet mangler i modellen, er den epidermale-mesenchymal og celle-matrix interaktion sammenfattet i en tredimensional stærkt standardiseret miljø. Desuden kunne vi vise, at AWD genererer standardiserede sår i huden modeller. I kombination, kan begge teknologier anvendes til at undersøge sårheling og virkningen af stoffer og lægemidler, der understøtter helingsprocessen. For at efterligne in vivo-situationen nøjere kan FTSE udvides med andre celler, såsom melanocytter, hud tumorceller eller mikro-kar-endotelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
References
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. The wound healing process. Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).
- Cory, G. Scratch-wound assay. Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).
- Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).
- Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).
- Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).
- Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).
- El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).
- Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).
- Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).
- Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).
- Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).
- Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).
- Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).
- Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).
- El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).
- Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).
- Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).
- Bell, E., et al. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
