Introduction
De huid is het grootste orgaan van het lichaam. Het creëert een barrière tussen de externe omgeving en de interne organen. Bovendien is de huid beschermt het lichaam tegen vochtverlies, milieu-invloeden, verwondingen en infecties en helpt om de lichaamstemperatuur 1 reguleren. Door zijn open ligging, wordt de huid vaak beïnvloed door mechanische, thermische of chemische trauma. Hoewel de huid is over het algemeen in staat zichzelf te repareren, kan meerdere lokale factoren zoals infectie, zuurstof, en veneuze toereikendheid leiden tot verstoorde wondgenezing. Wondgenezing kan worden gestoord door systemische factoren zoals obesitas, alcoholisme, roken, medicatie, voeding en ziekten zoals diabetes. 2
Het proces van wondgenezing kan worden verdeeld in 3 fasen: (i) de ontstekingsfase, (ii) de proliferatieve en (iii) remodelleringsfase. Bij schade aan de huid, een complex signaal cascade begint, waardoor de sluiting van de wond. 3Na een blessure, wordt de wond bloeden en een bloedstolsel wordt gevormd. Fibroblasten verhuizen naar het bloedstolsel en vervang het door nieuw weefsel dat vervolgens wordt verbouwd door de jaren heen.
Het huidige begrip van de biologische processen onderliggende huid herstel beperkt. Kleine dieren en varken modellen zijn gebruikt om wondgenezing te bestuderen. Echter, deze resultaten niet direct worden overgedragen op de mens als gevolg van species-specifieke verschillen. Naast deze in vivo modellen, kunnen bepaalde aspecten van wondgenezing worden bestudeerd door een gewikkelde toestand gesimuleerd door krassen in vitro monolaag kweken gebaseerd op geïmmortaliseerde cellijnen of primaire cellen. 4 Deze krassen modellen zijn zeer gestandaardiseerd, maar onvoldoende weerspiegelen de in vivo fysiologie. 5 Naast tweedimensionale modellen, zijn driedimensionale humane huid equivalenten ontwikkeld voor dermatologisch onderzoek. De dermale deel van deze modellen zijn gevergoede met behulp van diverse steigers inclusief gedecellulariseerde dermis, 6 collageen hydrogels, 7,8 glycosaminoglycanen 9 of synthetische materialen. 10 Gebruikmakend van deze huid equivalenten, de rol van epitheliale-mesenchymale interacties 11, de re-epithelialisatie, de cellulaire overspraak tussen fibroblasten en keratinocyten en de invloed van verschillende groeifactoren kunnen worden bestudeerd. Bovendien zijn deze modellen zijn nuttig om nieuwe kennis over hoe fibroblasten migreren naar de gewonde gebied en hoe chemotactische factoren beïnvloeden weefselregeneratie te krijgen. 12
Niet alleen genereren van de wondgenezing model zelf is uitdagend, maar ook om vast te stellen een zeer gestandaardiseerde wond model problematisch. Gebruikte technieken om te creëren wonden zijn krastesten, 13 brandwonden, 14 tape slijtage, 15 thermisch letsel, 16 zuig blaren, 17 vloeibare stikstof, 18 lasers, 19 18 meshers 6 en biopsie stoten. 20 De meeste van deze methoden hebben dezelfde valkuilen. Blessures handmatig geïmplementeerd zijn moeilijk te standaardiseren en te reproduceren tussen meerdere tests. Grootte, vorm en diepte van de wond variëren tussen de studies en daarmee afbreuk doen aan de kwaliteit van de onderzoeksgegevens. Het gebruik van laser voor gedefinieerde huid verwonden kan relatief eenvoudig worden gestandaardiseerd, maar leidt tot een situatie nabootsen van brandwonden. Heat van laser toegepast kan eiwitdenaturatie, bloedplaatjes aggregatie of vaartuigen vernauwing, wat kan leiden tot necrotisch weefsel.
In een alternatieve benadering, een geautomatiseerde verwonding apparaat (AWD), die ons in staat stelt om te definiëren en de huidwonden onder steriele omstandigheden te genereren ontwikkelden we. Verwonding parameters, zoals diepte en snelheid van penetratie en toerental van de boorkop kan worden geregeld. In deze studie hebben we gecombineerd de AWD met in eigen huis ontwikkelde volledige dikte van de huid equivalenten (ftSE) die vergelijkbaar zijn met een protocol gepubliceerd door Gangatirkar et al. 8 de dermale laag van de huid equivalent uit humane dermale fibroblasten (HDF), die zijn ingebed in een collageen I hydrogel. Op de huid laag, humane epidermale keratinocyten (HEK) zijn gezaaid. Binnen twee weken aan de lucht-vloeistof-interface van de HEK opbouwen van een epidermis bestaat uit meerdere vitale cel lagen en een hoornlaag. Naast de generatie van dit model, deze studie toont het gebruik van de AWD te definiëren en de wonden te creëren in de FTSE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het protocol is ontworpen voor de productie van 24 volledige dikte huid equivalenten. Humane dermale fibroblasten en epidermale keratinocyten werden geïsoleerd uit huidbiopsies volgens een eerder gepubliceerde protocol. 21,22 Informed consent werd vooraf verkregen en de studie werd goedgekeurd door de institutionele ethische commissie op de menselijke onderzoek van het Julius-Maximilians-Universität Würzburg (182 stemmen / 10).
1. De productie van Dermal Component
- Los collageen met 0,1% azijnzuur tot een eindconcentratie van 6 mg / ml. Voor de gel neutralisatieoplossing, meng 232,5 2x ml DMEM, 7,5 ml foetaal kalfsserum, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml chondroïtinesulfaat (5 mg / ml). Houd gel neutralisatieoplossing en collageen oplossing op ijs. Bereken 500 pi gel per insert / huid equivalent.
OPMERKING: Als de gel neutralisatie oplossing zal worden gemengd met twee delen van collageen oplossing preparre dubbele hoeveelheid collageen. - Plaats 24 inserts in een 24 well plaat.
- Resuspendeer humane dermale fibroblasten (HDF) in 10 ml DMEM, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 270 xg en tel de cellen. Extraheer de benodigde hoeveelheid HDF (5 x 10 4 cellen per 500 ul collageen gel) en centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 270 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de HDF voorzichtig in 4 ml gekoelde gel neutralisatieoplossing zonder dat luchtbellen. Vanaf deze stap zorg ervoor om zo snel mogelijk te werken om voortijdig stollen van de collageengels voorkomen.
- Resuspendeer de oplossing met 8 ml collageenoplossing.
- Neem de collageen-cel-mengsel met een multistep-pipet en vul snel 500 pi van mengsel in elke insert. Incubeer de gels gedurende 20 minuten in een incubator (37 ° C, 5% CO2) om de gels opstijven.
- Dompel de gels in 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% foetaal kalfsserum (FCS) per putjeen incubeer het voor 24 uur in een incubator (37 ° C, 5% CO2).
2. Toevoeging van humane epidermale keratinocyten (HEK)
- Verwijder medium na 24 uur. Los fibronectine humaan eiwit met ultrazuiver water tot een eindconcentratie van 50 ug / ml. Bedek elk dermale equivalent ten 25 pl fibronectine oplossing. Incubeer de gels gedurende 30 minuten in een incubator (37 ° C, 5% CO2).
- Ondertussen resuspendeer de Hek 10 ml KGM-2 en zet celconcentratie 1 x 10 6 cellen / ml met KGM-2 klaar + 5% FCS. Zaad 1 x 10 5 hek op elke gel. Incubeer gels gedurende 45 min in de incubator (37 ° C, 5% CO2) om cellen te hechten.
- Onderdompelen de gels met KGM-2 klaar + 5% FCS en kweken ervan in de incubator (37 ° C, 5% CO2).
3. Cultuur van de volledige dikte van de huid equivalenten (FTSE)
- Cultuur FTSE voor 6-7 dagenaflopend FCS-concentratie (5%, 2% en 0% FCS). Verander het medium om de 2-3 dagen met de volgende lagere FCS concentratie. Voor deze, volledig te verwijderen het medium en voeg 1,6 ml vers medium.
- Op dag 7, verwijder medium volledig.
OPMERKING: Sluit de FTSE oppervlak niet aan met de punt van de pipet terwijl doen. - Plaats elke voegen in 1 put van een 6 wells plaat met een steriel pincet. Voeg 1,5 ml luchtbrug medium per well, ervoor te zorgen dat u de FTSE oppervlak nat. Veranderen medium om de 2-3 dagen voor een extra 14 dagen.
Opmerking: Het niveau van het medium aan de meniscus van de FTSE.
4. Histologische analyse
- Vaststelling en paraffine-inbedding van de FTSE
- Verwijder kweekmedium overdragen inzetstukken verse platen met 24 putjes en vast weefsel door toevoeging van 1,6 ml van 4% paraformaldehyde aan elk putje en incubeer de weefsels gedurende 2 uur bij KT. Let op! Paraformaldehyd is giftig, te bewerken onder zuurkast. Overdrachtde FTSE een weefselverwerkingsproces cassette. Verwijder resterende fixatief door wassen met water en uitdrogen van het weefsel met behulp van oplopende ethanolconcentraties.
- Verdeel de huid gelijk door een verticale snede in het midden. Leg de twee stukken in een paraffine gevulde metalen voet vorm met snijvlakken naar beneden. Voeg de weefselcassette bovenop de mal als rug.
- Snijd 3-5 micrometer plakjes en drijven ze op een 40 ° C waterbad voor straighten, monteren op geschikte microscoop dia dia's. Droge plakjes grondig.
- Hematoxyline & eosine (H & E) en immunohistochemische (IHC) kleuring
- Plaats glijdt in rek en incubeer 1 uur bij 60 ° C. Zorg ervoor dat paraffine gesmolten. Vlek gerehydrateerde plakjes met H & E als een gestandaardiseerd overzicht vlekken.
- Voor H & E kleuring bereiden 4x glas kleuring cuvetten met xyleen, 3x met ethanol 96%, 2x met ethanol 70%, 1x met ethanol 50%, 4x gedemineraliseerd water, 1x hematoxylin, 1x HCl-ethanol (13,7 ml 1 M HCl ad 200 ml 50% ethanol), 1x tabblad water, 1x eosine (1 g eosine in 100 ml gedemineraliseerd water) en 2x 2-propanol.
- Plaats de glaasjes 10 min in xyleen I en 10 min in xyleen II bij deparaffinize en rehydrateren glijbanen. Dip glijdt 3x in ethanol 96% I, 3x in ethanol 96% II, 3x in ethanol 70% en 3x in ethanol 50%. Draai dia's in gedemineraliseerd water. Om hematoxylin dye, dip 2x in HCl-ethanol te differentiëren. Spoelen met gedemineraliseerd water. Voor blauwen, plaats schuift 5 min in tabblad water. Voor eosinekleuring, plaats schuift 1 min in eosine en was daarna in gedeïoniseerd water. Voor dehydratatie, dip slides 2x in ethanol 70%, 2x in ethanol 96% en plaats ze gedurende 5 min in 2-propanol I, gedurende 5 min in 2-propanol II, 5 minuten in xyleen I en 5 min in xylol II. Na H & E kleuring, zijn celkernen gekleurd in blauw, cytoplasma en extracellulaire matrix zijn gekleurd in het rood.
- Voor antigen retrieval, verwijderen paraffine met xyleen en rehydrateren plakjes voor het kleuren. Plaats plakjesin de stoomkoker en kook gedeparaffineerde en gehydrateerd plakken voor 20 min in voorverwarmde 10 mM citraat buffer (pH 6).
- Plaats de glaasjes in wassen (PBS-buffer + 0,5% polysorbaat 20) en cirkel plakken met een vloeistof afstotende dia viltstift of diamant stylus.
- Plaats dia's in een vocht kamer. Blokkeren endogene peroxidase, met toevoeging van 100 pi 3% waterstofperoxide-oplossing op elke plak. Let op! Zeer gevaarlijk in geval van huid- en oogcontact. Handvat met persoonlijke beschermingsmiddelen. Wassen glijdt bij het wassen buffer.
- Breng primair antilichaam en incubeer gedurende 1 uur bij KT. Was dia driemaal met wasbuffer. Vanaf hier moeten de monsters in het donker worden bewaard.
- Met biotine-streptavidine detectiesysteem voor detectie van antigeen-antilichaambinding.
- Tegenkleuring kernen met hematoxyline gedurende 1 minuut. Uitdrogen en mount dia's.
- Afbeelding monsters met behulp van een omgekeerde microscoop.
- Bereid de AWD door het desinfecteren van de werkplek met 70% ethanol en ultraviolet licht. Zorg ervoor dat de boorkop van de gewenste grootte (bijvoorbeeld 1 mm) wordt bevestigd.
- Plaats huid equivalenten in aangewezen gebieden van de geautoclaveerd monster draagplaat met behulp van een steriel pincet. Plaats het monster draagplaat in de aansluiting onder de boorkop.
- Gebruik de besturingssoftware te verwonden parameters in te stellen als volgt: rotatie snelheid: 15.000 rpm; penetratie: 1,5 mm; aandrijving: 100 Hz. Deze parameters moeten worden gedefinieerd voor elk monster afzonderlijk. Transfer verwonden parameters tot de AWD.
- Start verwonden procedure. Verwijder monster draagplaat uit het stopcontact. Transfer gewonde FTSE terug in inserts gebruikt voor cultuur met behulp van een steriel pincet.
- Ga verder met de cultuur van de gewonden FTSE in de incubator (37 ° C, 5% CO 2), voor onderzoek naar regeneratie. Alternatively, gebruikt de modellen voor histologische analyse op elk moment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De geïsoleerde HDF en HEK verschillen zowel in morfologie en in de expressie van de typische markers. De HDF toonde typische spindel-vormige morfologie, terwijl de morfologie van Hek kan worden beschreven door een geplaveide morfologie. De cellen werden gekarakteriseerd door immunohistochemische kleuring (figuur 1) alvorens ze voor FTSE. De HDF zijn positief voor vimentine (figuur 1A), een marker voor fibroblasten. Primaire HEK zeer uiten vroege differentiatie eiwit cytokeratine-14 (Figuur 1B), maar bijna geen late keratinocytdifferentiatie eiwit cytokeratine-10 (figuur 1C).
Volgende primaire cultuur, we los van de cellen van de celkweek kolven en gebruikte ze voor het genereren van FTSE. De FTSE werden gedurende 7 dagen onder dompelpompen medium omstandigheden (figuur 2A), gevolgd door een 14 dagen kweek in de lucht-vloeistof interface (Figuur 2B). Tijdens dit proces, de fTse contract aanzienlijk. Binnen 21 dagen na de HEK zijn prolifererende (figuur 2C-E). Door de gemiddeld niveau zodanig dat het oppervlak van de modellen wordt blootgesteld aan lucht en door het verhogen calciumconcentratie, de HEK gestimuleerd om te differentiëren in een meercellige epidermis die bestaat uit verschillende vitale cellagen van keratinocyten in verschillende differentiatie toestanden en een stratum corneum (figuur 2E).
Vergelijking van de Hematoxyline & Eosine kleuring FTSE (figuur 2E) met natieve humane huid (figuur 2F) wordt het duidelijk dat ftse nabootst histologische structuur van de huid. Dit kan verder worden aangetoond door immunohistochemische kleuringen (figuur 3). De HDF in het collageen I hydrogel kan worden gekleurd met primaire antilichamen tegen vimentine (figuur 3A, E). Keratinocyten vormen een epidermale laag bestaat uit cytokeratine-14 positive cellen (Figuur 3B, F) en de late differentiatie cytokeratine-10 wordt uitgedrukt in de supra-basale lagen (Figuur 3C, G). Bovendien, de stratum corneum is positief voor filaggrine (Figuur 3D, H).
Na 21 dagen cultuur periode werd de AWD gebruikt om huidwonden in de FTSE genereren. Zoals getoond in figuur 4A, wordt de AWD uitgevoerd als een gesloten systeem te garanderen steriele omstandigheden. In figuur 4B is een schematische tekening van het verwonden bewees. De FTSE zijn bevestigd op een steekproef draagplaat. Het gehele verwonding, inclusief de instelling van parameters als daalsnelheid en omwentelingen van de boorkop (figuur 4D) en de penetratiediepte wordt gecontroleerd computerondersteunde. De verwondend procedure kan optisch worden gecontroleerd via een raam of door een hoge resolutie camera die alle stappen registreert tijdens het verwonden procedure. Grootte, vorm en diepte van de wond letsel kan individueel worden aangepast (Figuur 4C).
Figuur 1. Karakterisering van cellen voor de constructie van volledige dikte huid equivalenten. Immunohistochemische kleuring van primaire humane dermale fibroblasten voor vimentine (A) en epidermale keratinocyten van de vroege differentiatie keratine filament cytokeratine-14 (B) en de late differentiatie filament cytokeratine -10 (C). Positieve kleuring wordt getoond door bruine kleur. Schaal balken geven 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
6 / 52576fig2.jpg "/>
Figuur 2. Wijziging van de voorwaarden en de rijping van de volledige dikte van de huid equivalenten cultuur. Macroscopische foto's van de volledige dikte van de huid equivalenten 7 dagen gekweekt onder dompelpompen voorwaarden (A) en 14 dagen in de lucht-vloeistof interface (B). Vergelijking van Haematoxyline & eosinekleuring van volledige dikte van de huid equivalenten in verschillende ontwikkelingsstadia: Na 7 dagen (C), 14 dagen (7 dagen in de lucht-vloeistof-interface, D) en 21 dagen (14 dagen in de lucht-vloeistof-interface, E). Haematoxyline & Eosine kleuring van natuurlijke menselijke huid (F). Schaal balken geven 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
pg "/>
Figuur 3. Karakterisering van de volledige dikte van de huid equivalenten Vergelijking van immunohistochemische kleuring van volledige dikte van de huid equivalenten. (A - D) en inheemse menselijke huid (E - H) voor vimentine (A, E), cytokeratine-14 (B, F), cytokeratine-10 (C, G) en filaggrin (D, H). Schaal balken geven 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Automatische Verwonden Device voor gecontroleerde verwonding op volledige dikte van de huid equivalenten. De geautomatiseerde verwonden apparaat (AWD) biedt steriele conditions tijdens de gecontroleerde verwonding procedure (A). Een aangesloten computer (CPU) regelt de AWD. De volledige dikte van de huid equivalenten (ftSEs) worden op het monster draagplaat (SCP) geplaatst, zijn afwijkingen in de steekproef van de morfologie geëgaliseerd door een fotocel (LB), die de verwonding procedure triggers. De wondvorm afhankelijk van het gebruikte boorkop (DH). De diameter varieert van 1 mm (C, bovenste afbeelding) tot 2 mm (C, onderste afbeelding). Het verwonden procedure wordt gecontroleerd en kan worden opgenomen voor documentatie en kwaliteitsmanagement (D). Hematoxyline & eosine gekleurde dwarsdoorsnede van een volledige dikte huidequivalent geslagen met geautomatiseerde verwonding apparaat via een 1 mm boorkop (E). Alle schaal balken geven 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro cellen gewoonlijk uitgebreid tweedimensionale celculturen, waarbij cellen hechten aan kunststof oppervlakken. Echter, deze kweekomstandigheden niet de fysiologische driedimensionale omstandigheden waarbij cellen groeien in vivo. Onder driedimensionale omstandigheden kunnen cellen natuurlijke cel-cel en cel-matrix aanhangsels samen en migreren in drie dimensies. Vooral in de cutane wondgenezing de gelijkenis van de in vivo situatie is cruciaal om zinvolle gegevens te genereren, zoals cel migratie en matrix generatie zijn belangrijke elementen van de wondgenezing.
Om deze omstandigheden ontwikkelden we ftse die bestaan uit humane primaire cellen nabootsen en weerspiegelen zowel de dermale en epidermale laag van de huid. Gedurende twee weken kweken in de lucht-vloeistof-interface, het hek vormen een epidermis bestaat uit verschillende lagen van keratinocyten in verschillende differentiatie fasen en een stratum corneum. Furthermore, wordt de huid laag bestaat uit HDF, die zijn ingebed in een collageen I hydrogel. In de kweektijd, de HDF verbouwen de dermale component, waardoor een aanzienlijke krimp van de modellen (figuur 2B).
Reproduceerbare en gestandaardiseerde wonden te bereiden, ontwikkelden we een AWD. De computergestuurde machine kan definiëren en de cutane verwondingen (figuur 4) ingesteld. Afhankelijk van het beoogde onderzoek, diepte, vorm en grootte van de schade kan worden aangepast. Echter, als gevolg van de technische specificaties van de AWD en de morfologie van de FTSE, is het raadzaam om een minimale penetratie van 100 micrometer reproduceerbaarheid ingesteld. De AWD werkt onder steriele omstandigheden in een gesloten doos-systeem en alle onderdelen kunnen worden gesteriliseerd in een autoclaaf, desinfectie oplossingen of ultraviolet licht. In voorbereiding op het verwonden procedure moeten de monsters worden overgebracht naar een monster draagplaat. Deze plaat faciliteert eenexacte positie van de monsters. Verder is de adhesie tussen monster en het monster draagplaat is voldoende om de monsters in plaats te houden tijdens het verwonden procedure. Het verwonden procedure zelf kan optisch worden gecontroleerd via een raam of door een hoge resolutie camera die alle stappen van een close-up positie registreert. In tegenstelling tot andere systemen die lasers gebruiken om weefsel te graven om een wond te genereren, de AWD maakt gebruik van een draaiende boor. Aldus, wordt geen warmte toegepast gedurende de procedure, die een essentiële Perquisite mechanische wonden onderzoeken. Bovendien, specifieke vorm van de boorkop zorgt voor een afname van de wond kanaal. Met empirisch bepaald boven de verwonding procedure genoemde verwonding parameters kunnen worden aangepast aan specifieke fysiologische eigenschappen van ofwel de FTSE of natieve huid monsters voldoen. Op deze manier eventuele ongewenste bijwerkingen, zoals onbedoeld losraken van epidermale lagen kan worden geminimaliseerd en reproduceerbare verwonden uitgevoerd met een slagingspercentage90%.
Deze studie toont aan dat de ontwikkelde FTSE gedeeltelijk de in vivo situatie van de huid nauwkeurig nabootsen en kan dus worden gebruikt als een model voor wondgenezing studies. Hoewel belangrijke aspecten van het wondgenezingsproces zoals het effect van de vasculatuur, het bloedstolsel en het immuunsysteem ontbreken in het model, wordt de epidermale-mesenchymale en cel-matrix interacties gekaderd driedimensionale zeer gestandaardiseerde omgeving. Daarnaast konden wij aantonen dat de AWD genereert gestandaardiseerde wonden in de huid modellen. In combinatie kunnen beide technieken worden gebruikt om wondheling en het effect van stoffen en geneesmiddelen die het genezingsproces ondersteunen onderzoeken. Om de in vivo situatie beter nabootsen, kan de FTSE worden uitgebreid door andere cellen zoals melanocyten, huid tumorcellen of microvasculaire endotheelcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
References
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A.
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H.
- Cory, G.
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).
- Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).
- Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).
- Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).
- Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).
- El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).
- Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).
- Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).
- Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).
- Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).
- Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).
- Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).
- Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).
- El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).
- Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).
- Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).
- Bell, E., et al.
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
