Introduction
丝状真菌是优秀的模型系统的发育过程的研究。他们提供了几个实验的优惠，如廉价的种植，高数量的后代遗传的可访问性。最后一点是转化的允许调查迄今为止在非特异基因的各种细胞机制的重要建设特别重要的。丝状真菌是有助的几个元件和蜂窝质量控制通路像为异常蛋白，线粒体动力学的降解蛋白酶活性的机制的阐明对维持线粒体的完整性和自噬用于去除过剩和/或不正常的细胞成分和用于维持细胞活力在饥饿1,2,3次。
有可用于自噬在丝状真菌2该研究的几个实验技术：空泡（ⅰ）调查我˚F它们含有致密的自噬体时的蛋白酶是由透射电子显微镜4的抑制作用，（ⅱ）自噬体通过经由荧光显微镜5,6和（iii）检测酸化autophagosomal结 构监测GFP-ATG8灶通过使用荧光染料monodansyl尸胺可视7。
这里，一个新的增长的产黄青霉菌对自噬的研究方法。主要元素是'饥饿垫“，这只是由琼脂糖溶解在无菌自来水中的1％。另外的化合物（ 例如，压力源，清除剂，自噬调制器）可以使用，只要它们不显示自发荧光加至垫。该垫位于显微镜载玻片包含一个浅中心空腔。此衬垫在接种要么用孢子悬浮液，或以小的菌丝体片段。后者是可取的，如果所关注的菌株不能sporulatË有效（ 例如，ΔATG1株8）。将载玻片放置在湿室（这些可以很容易地构造使用空枪头框），以防止样品的干燥和在室温下孵育。P.黄青霉能够生长在这些条件下几天。自噬可以通过显微镜液泡增大其是阳性标志物的真菌自噬被观察到。在这方面的贡献，一个P. chrysogenum菌株（威斯康星54-1255）用于形成是受它的C-末端“SKL笔顺9靶向过氧化物酶体绿色荧光蛋白。因此，可以监测过氧化物酶的降解。它是通过使用适当的定位信号也以标记细胞（ 例如，线粒体）的其他车厢，并分析它们的降解是可行的。虽然从数据P.黄青霉 Ws54-1255（GFP-SKL）在这里介绍，这当然是可能的使用'饥饿垫“的方法也可用于其它丝状真菌（ 例如，粗糙脉孢菌，Sordaria macrospora，曲霉菌属等 ）。
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Protocol
1.准备P.的黄青霉的饥饿实验
- 如果P.感兴趣的产黄青霉株保持对水稻（“绿色大米”），将布满菌丝孢子到1.5 ml离心管2-3米粒。它用500μlYGG（10克/升氯化钾20克/升葡萄糖，10g / l酵母氮碱，5克/升K 2 HPO 4 20克/升酵母提取物）填充。
- 涡管30秒，使孢子可从水稻分离效率。
- 孵育管中1天，在室温（ 例如 ，20至25℃）。
- 准备一个1/50稀释这种孢子悬浮液中无菌自来水，搅拌均匀。
- 如果P.感兴趣chrysogenum菌株被保持在琼脂平板上（ 例如 ，YGG琼脂板），转移小块菌丝到含有400微升无菌自来水和大约100毫克GL 1.5ml微量离心管屁股珠用无菌牙签或枪头。
- 涡管2分钟，使菌丝体变得支离破碎。立即使用该管的内容物。
为培育P. 2预备步骤黄青霉对饥饿垫
- 接通加热板，并将其设定为约60℃。
- 溶解2克琼脂糖在100毫升由烹调在微波炉中的溶液自来水。请注意，这个解决方案是加热后完全清楚。如果不是，再次煮直到琼脂糖完全溶解。让琼脂糖溶液冷却至约60℃，使用前。
- 填充的1.5 ml离心管（2-4，这取决于样品的数量）用400μl无菌自来水（不添加额外的化合物），每个或400-X微升（除了x的微升在步骤2.5化合物溶液），并把它们到加热板为至少1分钟，以使笏呃内得到温暖。
- 放置显微镜载玻片包含一个中心腔到加热板至少1分钟。
- 琼脂加入400微升2％至1.5 ml离心管和涡简要的解决方案。在此步骤之后，如果需要的话，加入另外的化合物（ 即，1μM的雷帕霉素）。如果这样做，涡旋后短暂每个附加物质被吸向管。放管放回加热表，以防止过早固化。
注：在离心管中的总量应该是800微升。
3.准备显微镜载玻片的含饥饿垫
- 吸管140微升琼脂糖溶液到显微镜载玻片的腔（其仍位于加热板）。尽量避免，如果可能，气泡。
- 立即将盖玻片上的琼脂糖溶液。
注意：这将导致在一个平面上。 - 把微范围滑动到实验台上大约4分钟，使琼脂糖垫巩固。
- 小心地用拇指或食指的帮助下滑动它关闭删除琼脂糖垫盖玻片（戴手套，以避免污染！）。
- 放置与垫显微镜载玻片成湿腔室，以防止干燥。建议：使用一个空的提示框，仍然有插入举办的枪头。加入无菌水到盒使得底部被覆盖。放置在显微镜载玻片上的插入件并关闭对话框。
4.接种饥饿垫与P.黄青霉和孵化
- 吸移管将5μl的1/50稀释孢子（如果培养物生长在水稻）或5微升含有片段的菌丝体（如培养物生长在琼脂平板上）上饥饿垫的中心的未稀释溶液组成。
- 关闭湿室，把它包在一个塑料袋（这作为额外的保护，防止饥饿垫干燥）。要小心，不要将箱子太大，否则接种滴会受到干扰。
- 分析样品之前，存储在RT包装的盒子进行至少20小时。
该样品5显微分析
- 20小时温育后，将样品准备显微镜分析;放在干燥的纸巾显微镜载玻片（底部趋于湿）。
- 吸取小体积的水（约50微升）到饥饿垫。把盖玻片上垫挤掉多余的水分。用纸巾去除多余的水。
- 把载玻片上的荧光显微镜的观察表。为了让菌丝生长的概述，用20倍的目标。使用63X或100X目标研究GFP的本地化的菌丝。为了防止试样的逐渐干燥不分析样品为前长于15分钟把它们放回湿室。
- 重复5.3定期（ 例如 ，40小时和60小时生长后）。
注：样品可以放回湿室中。这是没有必要除去盖玻片，因为它不影响菌丝生长。
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Representative Results
为了证明在P.上述过氧化物酶降解详细介绍了协议的效用chrysogenum菌株Ws54-1255（GFP-SKL）进行了分析。在这株GFP-SKL通常被导入到过氧化物酶体9。这导致多个球形的外观，当样品通过荧光显微镜进行分析。如果发生自噬，空泡放大。 GFP-SKL成为自噬（pexophagy）并入空泡。由于这一事实，即GFP是通过液泡蛋白酶降解抗性它所标记这些细胞器10。因此这两个参数，观察自噬（pexophagy）在这株，液泡扩大和GFP-SKL的本地化空泡，方便用荧光显微镜监测。
在20小时温育的，GFP是从来没有在液泡（ 图1）观察到的。此外，液泡扩大不发生。然而，在40小时的生长GFP标记液泡成为在某些菌丝的可见，表明自噬（pexophagy）成为有效（ 图1）。在60小时的生长的GFP标记液泡的量进一步增加。作为阴性对照P的ΔATG1突变黄青霉被利用（ΔATG1（GFP-SKL））（ 图2）。既不放大也不GFP标记液泡可以在该菌株中被观察到。作为阳性对照，所述自噬刺激药物雷帕霉素被使用（ 图3）。 40小时生长后GFP标记液泡变得可见。在60小时后，将菌丝完全充满巨大含有GFP-液泡（ 图3）。这一发现表明，正如所料，巨大的自噬发生在这里。总的来说，这些结果表明的实验装置的有效性。
图2：GFP-SKL在ΔATG1（GFP-SKL）栽培饥饿垫本地化过程中在指定的时间，生长在饥饿垫文化用荧光显微镜进行分析。代表性的图像示于每个时间点。相应的亮场区域中显示的每个荧光下方通道图像。比例尺：10微米。 
图3：GFP-SKL在Ws54-1255（GFP-SKL）与雷帕霉素对自噬的诱导处理本地化在指定的时间培养物生长在补充有1μM的雷帕霉素饥饿垫用荧光显微镜进行分析。代表性的图像示于每个时间点。相应的亮场区域中显示的每个荧光通道图像的下方。白色的“V”：GFP-SKL定位于液泡表明过氧化物酶的降解。比例尺：10微米。
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Discussion
这里介绍的方法允许自噬在P.方便和可重复的研究黄青霉 。例如，它可用于筛选各种化合物的功效它们是否能够调节这种真菌与否的自噬反应。雷帕霉素的研究结果表明，抑制TOR信令导致明显的诱导自噬在体育黄青霉这也被证明对其他生物体11。
它可以使用在更复杂的显微镜（ 例如 ，共聚焦激光扫描显微镜）上生长饥饿焊盘用于分析菌丝。不要紧样品是否放在下面的目标以上的目标（倒置显微镜）。针对某些隔室不同的荧光蛋白可以用来监控不同细胞器的自体吞噬过程中的命运（ 例如，线粒体- > mitophagy;内质řeticulum - > ER-phagy 等 ）。总之，这里所描述的技术延伸方法的光谱显微镜研究真菌12。
该协议通常是简单，易于使用。然而，这是非常重要的是，饥饿焊盘永不变干，因为这将导致伪像和细胞死亡。因此，强烈建议（ⅰ）含有静止液体琼脂糖溶液在显微镜载玻片从加热板上立即删除（步骤3.3），（ii）该盖玻片用于使平坦表面从饥饿垫后除去最大的5分钟（步骤3.3和3.4），（iii）该显微镜载玻片总是保持在湿室中时不进行分析（步骤3.5和5.4）和（ⅳ），该显微镜分析没有考虑超过15分钟（步骤5.3）。另一个重要的方面是，孢子或菌丝体片段的吸移到饥饿垫的起始量应当不太高或太低。这可以通过稀释的股票被容易地控制通过使用无菌自来水。在1.1.3中描述的1/50稀释行之有效的P.黄青霉孢子悬浮液。这是我们的真菌使用推荐的稀释，但可能需要一些调整。
该方法的限制是，它是不可取的延时成像实验超过15分钟。这是由于在饥饿垫的逐渐干燥，一旦它从湿室中取出。如果需要较长的观察时间是可能的少量的无菌自来水添加到饥饿垫的边缘，尽管这并不妨碍在垫的中央地区的部分干燥。另一个限制是，该方法是不严格的定量。在单细胞生物是可能的得分每个细胞事件（ 例如 ，含有绿色荧光蛋白在液泡细胞的量）。与此相反， 第黄青霉作为丝状真菌是characte由多细胞结构授权的。细胞通过septae含有一个中心孔，它允许细胞质和细胞器的通过划分。因此可将样品仅分析“半定量”（ 例如 ，含有GFP菌丝局限于空泡数）。为了达到它的意义是非常重要的分析菌丝的数量是足够高（至少80％的时间点和条件进行测试，但更多的是明确优选）。
饥饿垫自噬研究的利用可以很容易地适应于其他丝状真菌中使用。因此这里提出的协议不仅限于P.黄青霉 。它也应当能够适应它用于与单细胞真菌， 即酵母。该协议高等生物（ 如线虫）转让可能需要更专业的调整。这将是有趣的，看看在这项工作中所描述的方法是否也发现它在其他领域使用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
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