Introduction
İpliksi mantar gelişme işlemine çalışma için mükemmel bir model sistemleridir. Bunlar ucuz ekimi, döl ve genetik erişilebilirlik yüksek sayılar gibi birçok deneysel faydaları sunuyoruz. son nokta, çeşitli hücresel mekanizmalar için çok-çok uncharacterized genlerin önemini araştıran izin Transformantların yapımı için özellikle önemlidir. İpliksi mantar fazlası ve / veya işlevsel hücre bileşenlerinin çıkarılması için mitokondriyal bütünlüğü ve Otofaji sağlamak ve sürdürmek için çeşitli elemanlar ve anormal protein, mitokondriyal dinamikleri indirgenmesi için proteaz aktivitesi hücresel kalite kontrol yollarının mekanizmaların açıklanması için etkili olmuştur açlık 1,2,3 zamanlarında hücre canlılığı.
Ipliksi mantarlar 2 Otofaji çalışma için uygun bir çok deneysel teknik vardır: vaküol (i) inceleme ıproteazlar, transmisyon elektron mikroskopisi 4 tarafından önlendiği zaman f de yoğun otofajik organları içeren, (ii) flüoresan boya monodansyl kadavenn kullanılarak floresan mikroskop 5,6 ve asidifiye autophagosomal yapıları (iii) algılama ile GFP Atg8 odak izleyerek autophagosomes görselleştirme 7.
Burada, otofaji çalışmaları için penicillium chrysogenum büyüyen yeni bir yöntem sunulmaktadır. Ana unsur sadece agaroz sterilize musluk suyunda çözünmüş 1% oluşur 'açlık pedi' olduğunu. Ek bileşikler (örneğin, stres, temizleyiciler, otofaji modülatörleri) sürece otomatik floresan göstermez altlığınızda ilave edilebilir. ped sığ merkezi boşluğu ihtiva mikroskop slaytlar yer almaktadır. Bir spor süspansiyonu ile ya da küçük miselyum fragmanları ile aşılanır Bu ped. ilgi suşu sporulat başarısız olursa ikinci tavsiye ediliretkin bir şekilde, e (örneğin, Δ atg1 suşları 8). slaytlar numunenin kuruma önlemek için (bunlar kolayca boş pipet ucu kutuları kullanılarak inşa edilebilir) ve oda sıcaklığında inkübe ıslak odalarında konumlandırılmış. P. chrysogenum, bu koşullar altında bir kaç gün için büyümeye edebilmektedir. Otofaji mantar Otofaji için olumlu bir belirtecidir vakuolar genişleme ile mikroskobik edilebilir. Bu katkı, bir P. chrysogenum soyu (Wisconsin 54-1255) C-terminal 'SKL' dizisi 9 ile peroksisomlara hedeflenen yeşil floresan proteini oluşturan kullanılır. Bu nedenle, peroksizom bozulmasını izlemek mümkündür. Uygun lokalizasyon sinyallerini kullanarak, aynı zamanda hücrenin (örneğin, mitokondriya) 'in diğer bölmeleri etiket ve bozunmasını analiz etmek mümkündür. P. veri rağmen chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) kesinlikle mümkün, burada sunulmuşturDiğer ipliksi mantarlar için de 'açlık ped' yöntemi kullanmak (örneğin, Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus türleri, vb).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
P. hazırlanması 1. chrysogenum Açlık Deneyler için
- P. Eğer Çevrede chrysogenum suşu pirinç ('yeşil pirinç') tutulur, 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine miselyumu sporlanan ile kaplı 2-3 pirinç tanelerini yerleştirin. 500 ul YGG (10 g / l KCI, 20 g / l glukoz, 10 g / l maya azot baz, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l maya ekstresi) ile doldurun.
- Sporlar etkili bir pirinç ayrılacak şekilde 30 saniye için tüp karıştırın.
- Oda sıcaklığında 1 gün (örneğin, 20 ila 25 ° C) tüp inkübe edin.
- Steril musluk suyu bu spor süspansiyonu, bir 1/50 seyreltme hazırlanır, iyice karıştırın.
- P. Eğer Çevrede chrysogenum suşu bir agar plaka (örneğin, YGG agar) tutulur, 400 ul steril musluk suyu ve yaklaşık 100 mg gl içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine misel küçük parçalar aktarmaksteril bir kürdan veya pipet kullanarak eşek boncuk.
- Vortex 2 dakika süreyle tüp böylece misel parçalanmış olur. Hemen tüp içeriğini kullanın.
P. Yetiştiriciliği 2. Hazırlık Adımları Açlık Pedleri üzerinde chrysogenum
- Bir ısıtma plakası üzerinde açma ve yaklaşık 60 ° C'ye ayarlayın.
- Bir mikrodalga fırında pişirme çözümü ile musluk suyu ml 100'de agaroz 2 gr eritin. Bu çözüm ısıttıktan sonra tamamen açıktır özen gösterin. Değilse agaroz tamamen eriyene kadar, tekrar pişirin. Agaroz çözüm kullanılmadan önce yaklaşık 60 ° C'ye kadar soğumasını bekleyin.
- 400 ul steril musluk her (ek bileşikler eklenmiştir) su ya da (örneklerin sayısına bağlı olarak 2-4) 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri Dolgu 400 x ul (adım 2.5 bileşiği çözeltisi ul x ilaveli) ve koyun en az 1 dakika için ısıtma plakası üzerine bu yüzden water içinde ısınıyor.
- En az 1 dakika için ısıtma plakası üzerine bir merkezi boşluğu içeren mikroskop slayt yerleştirin.
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve girdap kısaca çözeltisine agaroz 400 ul% 2 ekleyin. Eğer istenirse bu adımdan sonra ilave bileşikler (yani, 1 uM rapamisin) ekleyin. Eğer bu yapılırsa, girdap her ek madde tüp pipetle kısaca sonra. Erken katılaşma önlemek için ısıtma masaya geri tüpleri koyun.
NOT: mikrosantrifüj tüpü içinde toplam hacim 800 ul olmalıdır.
Açlık Pedleri İçeren Mikroskop Slaytlar 3. Hazırlık
- (Hala ısıtma plakası üzerinde yer almaktadır) mikroskop lamı boşluğuna agaroz çözeltisi Pipet 140 ul. Mümkünse kabarcıkları yapmaktan kaçınmaya çalışın.
- Hemen agaroz çözeltisi üzerine bir kapak kayma yerleştirin.
Not: Bu, düz bir yüzeye yol açacaktır. - Mikro koyYaklaşık 4 dakika laboratuar tezgah üzerine kapsam slayt agaroz ped katılaşmaya izin.
- Dikkatlice başparmak veya işaret parmağı yardımı ile kaymasını agaroz ped lamel çıkarın (kirlenmeyi önlemek için eldiven giymek!).
- Kurumasını önlemek için bir ıslak odasına ped ile mikroskop lamı yerleştirin. Öneri: hala pipet uçları tutmak için ekleme sahip boş bir ipucu kutusunu kullanın. Alt tutulmasını sağlamak için, kutu, steril su eklenir. Insert üzerine mikroskop slaytlar yerleştirin ve kutusunu kapatın.
4. P. ile Açlık Pedleri aşılamak chrysogenum Kuluçka
- 1/50 spor (kültürler pirinç yetiştirilen olsaydı) seyreltme veya açlık pad merkezine üzerine (kültürler bir agar plaka üzerinde yetiştirilen olsaydı) misel parçalarını içeren sulandırılmamış çözeltinin 5 ul Pipet 5 ul.
- Bu şekilde hizmet vermektedir (ıslak odasına kapatın ve bir plastik torba içinde sarınaçlık yastıkları kuruma karşı ek koruma). Çok aksi aşılama damla rahatsız olacak, çünkü kutusunu taşımak için dikkatli olun.
- Örnekleri analiz etmek için en az 20 saat boyunca oda sıcaklığında sarılmış kutusunu saklayın.
Örneklerinde 5. mikroskobik analizi
- Inkübasyon 20 saat sonra numuneler mikroskobik analiz için hazır; Kuru kağıt mendil üzerine mikroskop lamı koyun (alt ıslak olma eğilimindedir).
- Açlık ped üzerine küçük bir su hacmi (yaklaşık 50 ul) pipetle. Ped üzerine bir lamel koyun ve fazla suyunu sıkın. Bir kağıt mendil ile fazla suyun çıkarın.
- Floresan mikroskop gözlem masaya mikroskop lamı koyun. Misel büyüme bir bakış elde etmek için, bir 20X objektif kullanın. Hif GFP lokalizasyonu incelemek için kullanın 63X veya 100X hedefleri. Için numune analiz yok numune kademeli kuruma önlemek içinuzun 15 dakika ıslak odasına geri koymadan önce.
- (40 saat ve büyüme 60 saat sonra, örneğin) düzenli aralıklarla 5.3 tekrarlayın.
NOT: Numune ıslak odasına geri konabilir. O Miseliyum büyümeyi etkilemez gibi lamel kaldırmak için gerekli değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
P. peroksizom bozulması yukarıda ayrıntılı protokol kullanılmasını göstermek için chrysogenum suşu Ws54-1255 (GFP-SKL) analiz edildi. Bu gerginlik GFP-SKL genellikle peroksizom 9 aktarılır. Örnek floresan mikroskobu ile analiz edildiğinde, bu çok sayıda küresel şekiller görünümüne yol açar. Otofaji oluşursa, vakuolleri büyütmek. GFP-SKL otofaji (pexophagy) tarafından vakuollerde dahil olur. Nedeniyle GFP vakuol proteazlar tarafından bozulmaya dirençli olduğu gerçeğini bu organellerin 10 etiketler. Bu nedenle vakuollerde Bu suş, vakuol genişleme ve GFP-SKL lokalizasyon Otofaji (pexophagy) gözlemlemek için iki parametre, uygun bir floresan mikroskobu ile izlenmektedir.
Inkübasyondan 20 saat sonra, GFP vaküol (Şekil 1) hiç görülmemektedir. Ayrıca, vakuol genişleme gerçekleşiyor değildir. Ancak, büyüme GFP-etiketli hücre arası boşlukların 40 saat sonraAktif (Şekil 1) olmak üzere otofaji (pexophagy) gösteren, hif bazı görünür hale gelir. Büyüme 60 saat sonra GFP-etiketli vaküol miktarı daha da artmıştır. Negatif bir kontrol olarak, P bir Δ atg1 mutant chrysogenum (Δ atg1 (GFP SKL)) (Şekil 2), kullanılmıştır. Ne büyütülmüş de GFP-etiketli vakuoller Bu soyda gözlenebilir. Bir pozitif kontrol olarak, otofaji uyarıcı madde rapamisin (Şekil 3) kullanılır. Büyüme 40 saat sonra GFP-etiketli vakuollerin hale gelir. 60 saat sonra, hif tamamen büyük GFP içeren vaküol (Şekil 3) ile doldurulur. Bu bulgu, beklendiği gibi, masif otofaji burada yer alır gösterir. Topluca, bu sonuçlar deneysel set-up geçerliliğini göstermektedir.
Şekil 2:. Açlık yastıkları üzerinde ekimi sırasında Δ atg1 GFP-SKL (GFP-SKL) lokalizasyonu belirtilen zamanlarda, açlık yastıkları üzerinde yetiştirilen kültürler floresan mikroskopi kullanılarak analiz edildi. Örnek görüntüler her zaman noktası için gösterilmiştir. Parlak bir alan ilgili alanlarda her floresan aşağıda gösterilmiştirKanal görüntüsü. Ölçek çubukları: 10 mikron. 
Şekil 3:. Otofaji uyarılması için rapamisin ile muamele Ws54-1255 (GFP SKL) GFP-SKL lokalizasyonu 1 uM rapamisin ile takviye açlık pedleri üzerinde büyümüş belirtilen katı kültürlerinden azından floresan mikroskobu kullanılarak analiz edilmiştir. Örnek görüntüler her zaman noktası için gösterilmiştir. Sorumlu parlak bir alan alanlar her floresan kanal görüntüsünün altında gösterilmiştir. Beyaz "v": GFP-SKL peroksisom bozulmasını gösteren vakuollerde lokalize. Ölçek çubukları: 10 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntem, P. otofaji uygun ve tekrarlanabilir çalışma sağlar chrysogenum. Örneğin, bu mantar ya da değil Otofaji tepkisini modüle edebilen olup çeşitli bileşiklerin etkinliğini taramak için kullanılabilir. rapamisin ile sonuçlar Devri sinyallemesinin engellenmesi P. otofaji belirgin bir indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir chrysogenum, diğer organizmalar 11 kanıtlanabildiği.
Daha karmaşık mikroskopları (örneğin, konfokal lazer tarama mikroskobu) analiz için açlık pedleri üzerinde büyümüş miselleri kullanmak mümkündür. Bu örnek objektif (ters mikroskop) Yukarıdaki amacı altında koymak farketmez. Bazı bölümlere hedeflenmesini çeşitli floresan proteinleri Otofaji sırasında farklı organellerin kaderi (örneğin, mitokondriya izlemek için kullanılabilir -> mitophagy; endoplazmik reticulum -> ER-phagy, vb.). Özetle, burada açıklanan tekniği mikroskobik mantar 12 eğitim yöntemleri spektrumunu genişletir.
protokol genellikle basit ve kullanımı kolaydır. Bununla birlikte, açlık yastıkları kalıntıların ve hücre ölümüne neden olur, bu şekilde birbirinden ayrılacak hiç çok önemlidir. Bu nedenle, güçlü bir, (i), yine de sıvı agaroz solüsyonu içeren mikroskop dilimleri üzerinde ısıtma plakasından hemen çıkarılır (adım 3.3), (ii) düz bir yüzey yapmak için kapak kayma bir süre sonra açlık pedi kaldırılır önerilmektedir analiz değilken 5 dakika (3.3 ve 3.4 adımları) maksimum, (iii) mikroskop lamı hep ıslak odasında tutulması (3.5 adımları ve 5.4) ve (iv) mikroskopik analiz en fazla 15 dk sürmüyor ki (adım 5.3). Bir başka önemli yönü açlık pedine pipetle sporlar veya misel parçalarının başlangıç miktarı çok yüksek olmadığı olmasıdır ya daçok düşük. Bu kolayca steril musluk suyu kullanılarak stok dilüsyonu ile kontrol edilebilir. 1.1.3 açıklanan 1/50 seyreltme P. iyi çalışır spor süspansiyonları chrysogenum. Bizim mantarlar ile kullanım için önerilen seyreltme ancak bazı ayarlamalar gerektirebilir.
Yöntemin bir sınırlama fazla 15 dakika zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için tavsiye edilmez olmasıdır. Islak bölmesinden çıkarılır sonra bu açlık pedin kademeli kurumaya kaynaklanmaktadır. Uzun gözlem süreleri gerekli ise, bu yastık orta bölgelerinde bir kuruma engellemez, ancak açlık pedin saçak steril musluk az miktarda su ilave edilmesi mümkündür. Başka bir sınırlama yöntem kesinlikle nicel değil olmasıdır. Tek hücreli organizmalarda bu hücre başına olayları puan mümkündür (örneğin, vakuol GFP içeren hücrelerin miktarı). Buna karşılık, S. chrysogenum filaman tipi bir fungus karakterizasyon olarakBir çok hücreli mimarisi tarafından yetkilendirilmiş. Hücreler, sitoplazma ve organellerin geçişine olanak sağlayan bir merkezi gözenek içeren septumların bölünür. Bu nedenle numuneler sadece 'kantitatif yarı' analiz edilebilir (örneğin, vakuollerde lokalize GFP içeren hiflerin sayısı). Önemini ulaşmak için bu (kesin zaman noktasında ve ancak daha fazla test durumda en az 80 tercih edilir) analiz hiflerin sayısı yeterince yüksek olması çok önemlidir.
Otofaji incelemek için açlık tamponlar kullanımı kolayca diğer filamentli mantarlar içerisinde kullanıma uyarlanabilir. Bu nedenle burada sunulan protokol sadece P. ile sınırlı değildir chrysogenum. Aynı zamanda, örneğin, maya, tek hücreli mantarlar ile için adapte etmek mümkündür. Yüksek organizmaların (örneğin, nematod) için protokol transferi muhtemelen daha özel uyarlamalar gerektirir. Bu çalışmada tarif edilen yöntem aynı zamanda bulur olup olmadığını görmek ilginç olurdiğer alanlarda kullanımı ile ilgilidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
- Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
- Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. Autophagy in filamentous fungi. Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).
- Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
- Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. Podospora anserina target of rapamycin. Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).
- Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
- Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
- Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
- Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
- Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
- Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
- Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. mTOR regulation of autophagy. FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).
- Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).
