Analys av Autophagy i<em> Penicillium chrysogenum</em> Med hjälp Svält Pads i kombination med fluorescensmikroskopi

Summary

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Abstract

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Introduction

Filamentösa svampar är utmärkta modellsystem för att studera utvecklingsprocesser. De erbjuder flera experimentella fördelar som billig odling, ett stort antal avkommor och genetiska tillgänglighet. Den sista punkten är särskilt relevant för byggandet av transformanter som tillåter undersöker betydelsen av så långt okarakteriserade gener för olika cellulära mekanismer. Trådsvampar har varit avgörande för att klarlägga flera delar och mekanismer för cellulära kvalitetskontroll vägar som proteas aktivitet för nedbrytning av avvikande proteiner, mitokondriella dynamik för att upprätthålla mitokondriell integritet och autophagy för avlägsnande av överskott och / eller dysfunktionella cellkomponenter och för att upprätthålla cellviabiliteten i tider av svält ^1,2,3.

Det finns flera experimentella tekniker tillgängliga för studier av autophagy i trådsvampar ^2: (i) undersökning av vakuoler if de innehåller täta autophagic kroppar när proteaser inhiberas av transmissionselektronmikroskopi ^4, (ii) visualisering av autophagosomes genom att övervaka GFP-Atg8 foci via fluorescensmikroskopi ^5,6 och (iii) detektering av syrade autophagosomal strukturer genom att använda det fluorescerande färgämnet monodansyl kadaverin ^7.

Här används en ny metod för att odla Penicillium chrysogenum för autophagy studier presenteras. Det viktigaste inslaget är "svält pad" som helt enkelt består av 1% -ig löst i steriliserat kranvatten. Ytterligare föreningar (t.ex. stress, asätare, autophagy modulatorer) kan läggas till dynan så länge de inte visar auto fluorescens. Dynan ligger i objektglas som innehåller ett grunt central hålighet. Denna dyna i ympas antingen med en sporsuspension eller med små mycel fragment. Det senare är lämpligt om stammen av intresse inte sporulate effektivt (t.ex. Δ atg1 stammar ^8). Glasen är placerade i våta kamrar (dessa kan lätt konstrueras med hjälp tomma pipett spets rutorna) för att förhindra uttorkning av provet och inkuberas vid rumstemperatur. P. chrysogenum kan växa för ett par dagar under dessa förhållanden. Autophagy kan observeras mikroskopiskt genom vakuolär utvidgning som är en positiv markör för svamp autophagy. I detta bidrag, ett P. chrysogenum stam (Wisconsin 54-1255) används som bildar grönt fluorescerande protein som är riktad till peroxisomerna med sin C-terminal "SKL" sekvens ^9. Därför är det möjligt att övervaka nedbrytning av peroxisomer. Det är möjligt att märka även andra avdelningarna i cellen (t.ex., mitokondrier) genom användning av lämpliga lokaliseringssignaler och för att analysera deras nedbrytning. Fastän data från P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) presenteras här, är det säkert möjligtatt använda "svält pad" metod även för andra trådsvampar (t.ex. Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus arter, osv).

Protocol

1. Beredning av P. chrysogenum för Svält Experiment Om P. chrysogenum stam av intresse hålls på ris ("gröna ris"), placera 2-3 riskorn täcks med sporbildande mycel i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Fyll den med 500 | il YGG (10 g / I KCI, 20 g / I glukos, 10 g / l jästkvävebas, 5 g / I K 2 HPO 4, 20 g / I jästextrakt). Vortexa röret för 30 sek, så att sporer kan lossna från ris effektivt. Inkubera röret under en dag vid rumstempe…

Representative Results

För att demonstrera användbarheten av protokollet beskrivs ovan peroxisom nedbrytning i P. chrysogenum stam Ws54-1255 (GFP-SKL) analyserades. I denna stam GFP-SKL brukar importeras till peroxisomer 9. Detta resulterar i uppkomsten av flera sfäriska former när provet analyseras via fluorescensmikroskopi. Om autophagy inträffar, vakuoler förstoring. GFP-SKL inkorporeras i vakuoler av autophagy (pexophagy). På grund av det faktum att GFP är resistent mot nedbrytning av vakuol proteaser det märk…

Discussion

Den metod som presenteras här tillåter bekväm och reproducerbar undersökning av autophagy i P. chrysogenum. Till exempel kan den användas för att screena effektiviteten av olika föreningar om de är kapabla att modulera autophagy responsen för denna svamp eller inte. Resultaten med rapamycin visar att hämning av TOR signalering leder till en uttalad induktion av autophagy i P. chrysogenum som även visats för andra organismer ^11.

Det är möjligt att an…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 – 0.50 mm